神經(jīng)毒理學(xué)方法培訓(xùn)課件

神經(jīng)毒理學(xué)方法神經(jīng)毒理學(xué)是研究外源化學(xué)物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)各部分所引起的結(jié)構(gòu)和功能損壞作用的一門學(xué)科。它主要應(yīng)用神經(jīng)解剖、神經(jīng)病理、神經(jīng)生化、神經(jīng)藥理和分子生物學(xué)的學(xué)科的理論和技術(shù)，研究神經(jīng)毒物在機(jī)體內(nèi)的代謝、毒性效應(yīng)發(fā)生的類型、特征、主要的臨床表現(xiàn)及其生化和分子機(jī)制，為中毒防止提供科學(xué)依據(jù)。神經(jīng)毒理學(xué)可看作既屬于毒理學(xué)分支,又深深扎根與神經(jīng)科學(xué)的一門交叉學(xué)科

2神經(jīng)毒理學(xué)方法任何一種方法和技術(shù)決定于它所要解決的問題，反過來，方法和技術(shù)的發(fā)展必然帶來某一學(xué)科的發(fā)展。鑒于神經(jīng)毒理學(xué)的特點(diǎn)，其研究方法必顯示此學(xué)科的特點(diǎn)，即神經(jīng)毒理學(xué)研究方法。方法和技術(shù)學(xué)科3神經(jīng)毒理學(xué)方法傳統(tǒng)毒理學(xué)研究方法1.體內(nèi)試驗(yàn)：也稱為整體動(dòng)物試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)多采用哺乳動(dòng)物，常用8種：大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、倉鼠、狗、雪貂（白鼬）和猴等。其結(jié)果原則上可外推到人。2.體外試驗(yàn)：利用游離器官、培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行，多用于外源化學(xué)物對(duì)機(jī)體急性毒作用的初步篩檢、作用機(jī)制和代謝轉(zhuǎn)化過程的深入研究。體外試驗(yàn)系統(tǒng)缺乏整體毒物動(dòng)力學(xué)過程，并且難以研究慢性毒作用。4神經(jīng)毒理學(xué)方法3.人體觀察（急性中毒事故、受控的臨床實(shí)驗(yàn)），可以直接獲得關(guān)于人體的毒理學(xué)資料，臨床毒理學(xué)主要研究僅限于低濃度、短時(shí)間的接觸，并且毒作用應(yīng)有可逆性。4.流行病學(xué)研究：對(duì)人群的直接觀察中取得動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所不能獲得的資料，優(yōu)點(diǎn)是接觸條件真實(shí)。但流行病學(xué)研究干擾因素多。5神經(jīng)毒理學(xué)方法神經(jīng)毒理學(xué)研究方法一、神經(jīng)行為功能評(píng)價(jià)方法二、神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)方法三、行為發(fā)育毒性測(cè)試方法6神經(jīng)毒理學(xué)方法神經(jīng)行為功能評(píng)價(jià)方法行為是機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)功能的最終輸出結(jié)果，是神經(jīng)系統(tǒng)功能的綜合體現(xiàn)，就目前狀況而言，是較理想的體檢測(cè)試評(píng)價(jià)指標(biāo)，可為評(píng)價(jià)各種神經(jīng)毒物的毒效應(yīng)提供有意義的定性和定量依據(jù)。其特點(diǎn)：行為改變往往出現(xiàn)在器質(zhì)性損害 之前▲7神經(jīng)毒理學(xué)方法具體方法如下：一、動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型1、帕金森病經(jīng)靈長目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)， MPTP(1-甲基4-苯基-1，2，3，6-四氫 吡啶)作為能提供人類非常有意義的PD 動(dòng)物模型而被接受2、遲發(fā)型神經(jīng)病雞作為某些有機(jī)磷中毒后引起遲發(fā)型神經(jīng)?。∣PIDN）的模型已被國際學(xué)術(shù)界公認(rèn)。8神經(jīng)毒理學(xué)方法二、神經(jīng)行為功能測(cè)試組合1、FIOH測(cè)試組合（Finland‘sInstituteofOccupationalHealth,芬蘭職業(yè)衛(wèi)生研究所）測(cè)試組合2、WHO-NCTB測(cè)試組合WHO選定的神經(jīng)行為核心測(cè)試組合（neurobehavioralcoretestbattery,NCTB）3、NES方法神經(jīng)行為評(píng)價(jià)系統(tǒng)(neurobehavioralevaluationsystem)是1986年Lets和Baker提出的一組利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行測(cè)試的測(cè)試組合。9神經(jīng)毒理學(xué)方法四、運(yùn)動(dòng)功能測(cè)試（一）、人體試驗(yàn)手提轉(zhuǎn)速度試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)瞄準(zhǔn)追擊試驗(yàn)簡單反應(yīng)時(shí)間試驗(yàn)（二）、動(dòng)物試驗(yàn)活動(dòng)度測(cè)定運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能測(cè)試痛覺測(cè)定11神經(jīng)毒理學(xué)方法神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)方法一、神經(jīng)病理學(xué)方法神經(jīng)病理形態(tài)或組織化學(xué)改變是確認(rèn)神經(jīng)損害及其病變可逆性程度的重要手段，也是確認(rèn)神經(jīng)毒性的最經(jīng)典方法。一般的研究思路，先進(jìn)行肉眼觀察，并輔以腦的絕對(duì)和相對(duì)重量；其次，在光學(xué)顯微鏡下觀察基本病變，確定病變的腦區(qū)后，可進(jìn)一步取材作電鏡檢查。為了確認(rèn)神經(jīng)毒性的細(xì)胞特異性及某些特殊生化過程的影響，需用神經(jīng)系統(tǒng)組織化學(xué)等方法檢查。

▲12神經(jīng)毒理學(xué)方法可使用光鏡、電鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交法，受體定位法、熒光素示蹤技術(shù)和放射性核素示蹤技術(shù)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和功能活動(dòng)形態(tài)定位。如：1998年阮素云報(bào)道了低濃度鉛對(duì)大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的損害；2001年赫秋月報(bào)道了丙烯酰胺對(duì)小鼠小腦浦肯野細(xì)胞的病理改變；2003年楊芳報(bào)道不同濃度鋰對(duì)大鼠原代培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元的影響。13神經(jīng)毒理學(xué)方法二、生理與生物化學(xué)方法目前應(yīng)用腦內(nèi)微透技術(shù)，微穿技術(shù)，磁共振光譜技術(shù)，高效液相色譜法，免疫印跡法，放射免疫分析法等測(cè)定神經(jīng)中樞神經(jīng)遞質(zhì)的釋放量及其變化。如：2003年李紅玉報(bào)道了電磁輻射對(duì)大鼠海馬氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響；胡衛(wèi)萱報(bào)道了甲基汞對(duì)腦組織有極大的親和性，2008年Yumi等發(fā)現(xiàn)組氨酸可減少腦水腫面積的增加

14神經(jīng)毒理學(xué)方法三、神經(jīng)電生理學(xué)方法神經(jīng)電生理學(xué)指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)和人群的臨床研究中都得到了較為廣發(fā)的應(yīng)用，可使用腦電圖，感覺誘發(fā)電位，肌電圖等測(cè)試神經(jīng)系統(tǒng)的電活動(dòng)，離體的單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞可用斑片鉗和膜片鉗技術(shù)評(píng)價(jià)單個(gè)細(xì)胞的單個(gè)離子通道及其受體的電活動(dòng)。如：2002年阮迪云應(yīng)用膜片鉗技術(shù)和原位雜交技術(shù)研究了鉛對(duì)鉀通道亞單位和NMDA受體亞單位的影響；2003年桑楠等報(bào)道了二氧化硫衍生物對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元外向鉀電流特性的影響。15神經(jīng)毒理學(xué)方法四、分子生物學(xué)方法神經(jīng)生物學(xué)研究中常用的分子生物學(xué)方法有基因的分子克隆，克隆后的基因在人工體外系統(tǒng)或細(xì)胞中的表達(dá)，PCR擴(kuò)增核酸分子技術(shù)，原位雜交技術(shù)，基因芯片等。如：2002年張?jiān)隼麍?bào)道了農(nóng)藥對(duì)小鼠腦細(xì)胞組織c-fos、c-jun、mRNA表達(dá)的影響；2002年逯曉波報(bào)道了鉛對(duì)幼鼠海馬區(qū)Bcl-2、Fas蛋白表達(dá)的影響；2004年丁曉蓉綜述了基因芯片與腦衰老的研究進(jìn)展。16神經(jīng)毒理學(xué)方法五、腦成像技術(shù)腦成像技術(shù)很多，有顱骨X射線成像技術(shù)、同位素腦掃描、計(jì)算機(jī)斷層掃描、核磁共振成像、正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)及單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層攝影等。如1997年姜鋒杰報(bào)道了慢性錳中毒顱腦CT的改變，為錳中毒的診斷提供了新的參考依據(jù)。17神經(jīng)毒理學(xué)方法行為發(fā)育毒性測(cè)試方法一、行為發(fā)育毒性測(cè)試組合二、行為發(fā)育毒性研究組合如：2005年胡前勝報(bào)道了宮內(nèi)鉛暴露對(duì)大鼠神經(jīng)行為發(fā)育的影響，2009年李洪鈞報(bào)道了孕中期鉛暴露對(duì)嬰兒神經(jīng)行為發(fā)育影響的研究。18神經(jīng)毒理學(xué)方法可以說，神經(jīng)毒理學(xué)的研究方法很多，任何研究神經(jīng)科學(xué)的方法如神經(jīng)生物學(xué)、神經(jīng)生理學(xué)、神經(jīng)生化學(xué)、神經(jīng)病理學(xué)、神經(jīng)藥理學(xué)、分子神經(jīng)生物學(xué)等方法都適用于神經(jīng)毒理學(xué)。19神經(jīng)毒理學(xué)方法

雖說神經(jīng)毒理學(xué)的研究方法很多，但是這些方法是互為補(bǔ)充的，有些指標(biāo)也只有在結(jié)合其他相關(guān)指標(biāo)時(shí)才能很好地予以解釋，實(shí)際上，由于神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性，單一的指標(biāo)是不可能全面評(píng)價(jià)神經(jīng)毒性，因此將不同指標(biāo)組合起來進(jìn)行成套實(shí)驗(yàn)是神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)的主要研究方向。20神經(jīng)毒理學(xué)方法此外，我個(gè)人認(rèn)為神經(jīng)毒理學(xué)研究方法還可根據(jù)試驗(yàn)的樣本來源分為：一、人體研究二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)三、離體組織或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)21神經(jīng)毒理學(xué)方法就人體研究而言，其研究方法與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，離體實(shí)驗(yàn)有明顯的不同，除了對(duì)一些特殊的志愿者研究外，所有的神經(jīng)毒效應(yīng)不能采用人體進(jìn)行研究。只能在接觸某些神經(jīng)毒物或中毒后進(jìn)行某些神經(jīng)系統(tǒng)功能的臨床觀察和檢測(cè)；測(cè)定外周血、尿等替代指標(biāo)，作為評(píng)價(jià)接觸神經(jīng)毒物的生物標(biāo)志物；死后的組織病理學(xué)檢查。22神經(jīng)毒理學(xué)方法動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和離體實(shí)驗(yàn)的研究和應(yīng)用應(yīng)遵守優(yōu)化、減少及替代（refinement、reduction、replacement）3R原則。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：需要建立神經(jīng)系統(tǒng)毒性損傷的 動(dòng)物模型。然后可以應(yīng)用生理、 生化和分子生物學(xué)的方法檢測(cè)。此外，轉(zhuǎn)基因或基因剔除動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)為從基因水平研究毒作用的種屬差異提供了可能。23神經(jīng)毒理學(xué)方法離體實(shí)驗(yàn)最常見的辦法是從動(dòng)物體分離得到的神經(jīng)細(xì)胞，在盡量模擬體內(nèi)環(huán)境的體外條件下，使神經(jīng)細(xì)胞仍保持存活、增殖、發(fā)育和分化能