基因工程抗體和抗體工程培訓課件

基因工程抗體和抗體工程Cgenescodefortheconstantregionsofimmunoglobulinproteinchains.

Vgeneissequencecodingforthemajorpartofthevariable(N-terminal)regionofanimmunoglobulinchain.Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes

2基因工程抗體和抗體工程Figure24.4Heavyandlightchainscombinetogenerateanimmunoglobulinwithseveraldiscretedomains.Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes3基因工程抗體和抗體工程Figure24.4Heavyandlightchainscombinetogenerateanimmunoglobulinwithseveraldiscretedomains.Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes4基因工程抗體和抗體工程Table24.1EachimmunoglobulinfamilyconsistsofaclusterofVgeneslinkedtoitsCgene(s).Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes

FamilyVGenesCGenesManMouseManMouseLambda<3002>64Kappa<300~100011Heavy~300>1000985基因工程抗體和抗體工程Figure24.5ThelambdaCgenesegmentisprecededbyaJsegment,sothatV-Jrecombinationgeneratesafunctionallambdalight-chaingene.Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes6基因工程抗體和抗體工程Figure24.6ThekappaCgenesegmentisprecededbymultipleJsegmentsinthegermline.V-JjoiningmayrecognizeanyoneoftheJsegments,whichisthensplicedtotheCgenesegmentduringRNAprocessing.Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes7基因工程抗體和抗體工程Figure24.7Heavygenesareassembledbysequentialjoiningreactions.FirstaDsegmentisjoinedtoaJsegment;thenaVgenesegmentisjoinedtotheDsegment.Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes8基因工程抗體和抗體工程Figure24.8ThelambdafamilyconsistsofVgenesegmentslinkedtoasmallnumberofJ-Cgenesegments.Thediversityofgermlineinformation

9基因工程抗體和抗體工程Figure24.9ThehumanandmousekappafamiliesconsistofVgenesegmentslinkedto5JsegmentsconnectedtoasingleCgenesegment.Thediversityofgermlineinformation

10基因工程抗體和抗體工程Figure24.10Asinglegeneclusterinmancontainsalltheinformationforheavy-chaingeneassembly.Thediversityofgermlineinformation

11基因工程抗體和抗體工程Figure24.12Consensussequencesarepresentininvertedorientationateachpairofrecombiningsites.Onememberofeachpairhasaspacingof12bpbetweenitscomponents;theotherhas23bpspacing.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangements

12基因工程抗體和抗體工程Figure24.13Breakageandreunionatconsensussequencesgeneratesimmunoglobulingenes.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangements13基因工程抗體和抗體工程Figure15.8Reciprocalrecombinationbetweendirectrepeatsexcisesthematerialbetweenthem;eachproductofrecombinationhasonecopyofthedirectrepeat.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangements14基因工程抗體和抗體工程Figure15.9Reciprocalrecombinationbetweeninvertedrepeatsinvertstheregionbetweenthem.15基因工程抗體和抗體工程一、噬菌體抗體庫技術的

基本方法⒈獲取目的基因⒉抗體庫技術的載體⒊淘篩⒋表達與鑒定16基因工程抗體和抗體工程

它是在PCR技術和PhageDisplay的基礎上實現(xiàn)的。其過程是把用PCR法得到的抗體基因插入絲狀噬菌體的DNA，與噬菌體外殼蛋白的基因相連，在輔助噬菌體的幫助下，噬菌粒包裝成絲狀噬菌體，抗體分子通過與PⅢ或PⅧ相連，在噬菌體表面的一端或分散分布，然后可直接對噬菌體表面的抗體分子進行篩選。噬菌體抗體庫技術17基因工程抗體和抗體工程

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達106倍。該技術的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。噬菌體表面展示系統(tǒng)(phagesurfacedisplaysystem)18基因工程抗體和抗體工程19基因工程抗體和抗體工程

噬菌體表面展示文庫技術的要點:

外源基因表達多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因g3或g8的先導系列的緊靠下游隨機克隆入相應載體形成組合文庫從免疫或未被免疫的B細胞中PCR擴增抗體全套基因片段20基因工程抗體和抗體工程用固相化抗原經(jīng)“親和結合一洗脫一擴增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。使翻譯出的抗體分泌到細菌的質周腔內，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉入大腸桿菌，21基因工程抗體和抗體工程該項技術的優(yōu)點:

將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來;

可繞過雜交瘤技術，不需要復雜的基因工程技術;

抗體基因篩選的范圍廣;

技術穩(wěn)定、可靠、生產(chǎn)周期短;可規(guī)模化生產(chǎn);

適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機多肽等的生產(chǎn)。22基因工程抗體和抗體工程

噬菌體抗體庫技術的發(fā)展具有很大優(yōu)越性。它簡單易行，篩選容量大，效率高，繞過了細胞融合及免疫等步驟，而且在表型一基因型的統(tǒng)一和識別一增殖過程上模擬了B細胞的成熟過程，從而在實際應用上具有很大意義。23基因工程抗體和抗體工程24基因工程抗體和抗體工程25基因工程抗體和抗體工程26基因工程抗體和抗體工程二、噬菌體抗體庫技術的

特點⒈模擬天然全套抗體庫⒉避開了人工免疫和雜交瘤技術⒊可獲得高親和力的人源化抗體27基因工程抗體和抗體工程

單克隆抗體噬菌體抗體

雜交瘤技術展示技術宿主細胞:雜交瘤細菌篩選范圍:~103107109時間:幾個月幾周操作:繁雜相對簡單免疫:必須可避免人源抗體:+費用:高低生產(chǎn)量:有限無限基因獲取:再克隆直接應用前景:有限不可估

28基因工程抗體和抗體工程三、基因工程抗體表達⒈原核細胞表達⒉真核細胞表達⒊轉基因植物表達⒋轉基因動物表達29基因工程抗體和抗體工程第六節(jié)抗體診斷試劑一、血清學鑒定用的抗體類試劑⒈鑒定病原菌的抗體試劑⑴常用診斷血清的品種和用途①沙門氏菌屬診斷血清②志賀氏菌屬診斷血清③病原性大腸埃希氏菌診斷血清30基因工程抗體和抗體工程⑵診斷血清的制備步驟①制備細菌抗原②免疫動物和制備抗體血清⑶診斷血清診斷方法31基因工程抗體和抗體工程32基因工程抗體和抗體工程⒉乙型肝炎病毒表面抗原的反向被動血凝診斷試劑⒊妊娠診斷試劑⒋抗ABO血型系統(tǒng)血清33基因工程抗體和抗體工程34基因工程抗體和抗體工程二、免疫標記技術用的抗體

類試劑⒈熒光抗體診斷試劑⑴熒光抗體的制備⑵免疫熒光測定方法⒉免疫酶抗體診斷試劑⑴免疫酶染色法用抗體診斷試劑⑵酶免疫測定用抗體診斷試劑①HBsAg酶標診斷試劑②HBeAg酶標診斷試劑35基因工程抗體和抗體工程③HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶標診斷試劑④測定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標抗體診斷試劑⑤甲胎蛋白（AFP）酶標抗體診斷試劑⑥癌胚抗原（CEA）的酶標抗體診斷試劑36基因工程抗體和抗體工程⒊放射免疫用抗體診斷試劑放射免疫技術是將放射性核素分析的高度靈敏性與抗原抗體反應的特異性結合起來建立的檢測技術。放射性核素標記抗體的方法：①氯胺-T法②Iodogen氏法38基因工程抗體和抗體工程抗原的測定有：①夾心法②間接法③竟爭法39基因工程抗體和抗體工程3.競爭法Ag※Ag※Ab+AbAg(標本)(定量)AgAbEE終止液標本酶標抗體底物顯色顯色固相固相標本酶標二抗底物1.夾心法2.間接法40基因工程抗體和抗體工程①HBsAg放射性核素標記抗體診斷試劑②HBeAg放射性核素標記抗體診斷試劑③HAV抗原放射性核素標記抗體診斷試劑④AFP放射性核素標記抗體診斷試劑⑤CEA放射性核素標記抗體診斷試劑常用標記抗體試劑有：41基因工程抗體和抗體工程三、導向診斷藥物

放射性核素標記抗體腫瘤放射免疫顯像放射免疫顯像優(yōu)點：①在體內確切腫瘤定位作用，準確性達90%，靈敏度達100%。②在體內可檢出0.5cm大小的病灶，并可檢出肺腦的轉移灶。42基因工程抗體和抗體工程③小分子抗體易到達腫瘤部位，可顯著提高N/NT值。④抗體在腫瘤部位可保留6～9日⑤能觀擦抗體在血中的半衰期和可能出現(xiàn)的不良反應。43基因工程抗體和抗體工程

放射免疫顯像定位技術將抗腫瘤單克隆抗體（Ab）與二乙基三胺五乙酸（DTPA）在體外偶聯(lián)成Ab-DTPA，再注入體內后，就能與體內組織相結合。由于抗體分子量大，需3天完成。3天后注入放射性核素In-113M（半衰期100m），因DTPA是重金屬離子絡合劑，所以In-113M可以結合到DTPA分子上，使腫瘤組織顯像。這一過程在2小時內可完成。44基因工程抗體和抗體工程

建立預定位技術需解決3個問題：①抗體在腫瘤組織滯留要7天以上。②Ab-DTPA偶聯(lián)物比較穩(wěn)定；③內源性金屬離子對DTPA的封閉作用要小。45基因工程抗體和抗體工程第六節(jié)抗體治療藥物以抗體為載體的導向治療藥物，還不成熟。一、放射性核素標記的抗體治療藥物抗體作為放射性核素的導向載體，標記操作簡便用量小。放射性核素標記的抗體對腫瘤細胞殺傷較大。46基因工程抗體和抗體工程二、抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物⒈常用的抗癌藥物氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、絲裂霉素（MMC）等。以人血漿白蛋白作為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的MTX量，使體外細胞毒性體高二倍。47基因工程抗體和抗體工程⒉抗體類藥物逆轉耐藥性腫瘤細胞對抗原藥物可產(chǎn)生多藥耐藥性（MDR）。

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