TCNHFA 002-2022 乳及乳制品中牛（家牛、牦牛和水牛）和羊（山羊和綿羊）源性成分定性檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法

ICS67.050CCSX04中國(guó)營(yíng)養(yǎng)保健食品協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CNHFA 和羊（）PCRQualitativedetectionoftaurus,BubalusbubalusandBosovine（OvisariesandCaprahircus）derivedingredientsinmilkanddairyproducts—RealtimePCRmethod2022-06-22發(fā)布 2022-07-01實(shí)施中國(guó)營(yíng)保健協(xié)會(huì)發(fā)布 發(fā)布T/CNHFA 002T/CNHFA 002—2022II前 言本文按GB/T1.1—2020《準(zhǔn)工作則 第部分標(biāo)化件結(jié)和起規(guī)》規(guī)起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本文件由海普諾凱營(yíng)養(yǎng)品有限公司提出。本文件由中國(guó)營(yíng)養(yǎng)保健食品協(xié)會(huì)歸口。本文件主要起草人：侯艷梅、楊艷歌、劉鳴暢、吳亞君、吳桐、王云帆、謝奎、王迎春、王洪越、王丹丹、吳占文、王帥。T/CNHFA 002T/CNHFA 002—2022鏈鏈鏈鏈乳及乳制品中牛（家牛、牦牛和水牛）和羊（山羊和綿羊）源性分定性檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法范圍）（）PCR。）（）（（GB19489GB/T6682GB/T27403下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1時(shí)光PCR Real-timePCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量及定性分析。3.2Ct值Cyclethreshold（Ct）每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。CTAB：cetyltrithylammoniumbromidecytb：cytochromebbdATP：deoxyadenosinetriphosphatedCTP：deoxycytidinetriphosphatedGTP：deoxyguanosinetriphosphateDNA：deoxyribonuleicaciddNTP：deoxyribonuleosidetriphosphatedTTP：deoxythymidinetriphosphateEDTA：EthylenediaminetetraaceticacidGH：GrowthHormone1PCR：polymerasechainreactionTris：Tris（Hydroxymethyl）aminomethaneTaq：ThermusaquaticusUNG：uracilN-glycosylaseN-GB19489PCR、以及家牛、牦牛、水牛、山羊、綿羊單一乳源成分的特異性引物探針，對(duì)樣品中提取的DNA模板進(jìn)行PCR（、PCR0.1mg。12000。7.6 0.5μL～10μL，10μL～100μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。pH計(jì)。除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682的要求。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。。表1 檢測(cè)引和針名稱檢測(cè)物種引物序列（5'--3'）靶基因擴(kuò)增長(zhǎng)度來源質(zhì)控哺乳動(dòng)物F:CTCAGCAGGGTCTTCACCAACAR:TGCCTTCCTCTAGGTCCTTCAGCP:FAM-TGGTGTTTGGCACCTCGGACCGT-TAMRAGH82bp本文件牛家牛、水牛和牦牛F:GTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGR:ATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGGP:FAM-TCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGG-TAMRAGH81bp本文件羊山羊和綿羊F:TGCCAGCCATCTGTTGTTACCR:AAAGGACAGTGGGCACTGGAGP:FAM-CCCGTGCCTTCCTAGACCCTGGAAG-TAMRAGH79bp本文件家牛家牛F:GCAGGCATGCTGGGGATGR:CTAAGAACCAGGAGCGTGGACAGP:FAM-TACCCAGGTGCTGAAGAATTGACCCGG-TAMRAGH135bp本文件2名稱檢測(cè)物種引物序列（5'--3'）靶基因擴(kuò)增長(zhǎng)度來源水牛水牛F:TTCATTGAYCTCCCTGCTCCR:GGAATAGGCCGGTGAGGATTP:FAM-ACTTTGGCTCTCTCC-MGBcytb100bp牦牛牦牛F:AACTTCGGCTCCATAGTAGGAGTAR:CGTCTCGGCAGATATGGACAP:FAM-CGGAGGAGAATGCTGTTGTTGTATCGGATGT-TAMRAcytb124bpBJS201904山羊山羊F:GGAGGGAACTGAGGACCTCAGTGR:GGTGTGTGGTTCCCCTCACTGP:FAM-CCTTATTCGGAACCCTCCCCACCCCA-TAMRAGH121bp本文件綿羊綿羊F:CGGAGTAATCCTCCTATTTGCR:CTAGGCTTGTGCCAATATATGGAP:FAM-TATTACCAACCTCCTTT-MGBcytb137bpGB38164-2019）。Taq5U/μL。UNG（-N-。8.6 70%（V/V）。NaCl1.2mol/LMgCl2溶液：2.5mmol/LdNTP（dGTP、dCTP、dATP、dTTPdUTP）2.5mmol/L。蛋白酶K10mg/mLXmL的無菌水或者蛋白酶K10Xmg蛋白酶K（5mL的無菌水或者蛋白酶K50mgK）mg/mLK-20℃CB20gLCB.4oLNC01oLTC002oLNaEAH8.0，CTAB5g/LCTAB，40mmol/LNaCl10×RCl100oLH42SO4160LO420oLTrHlH8.8。PCR12.5μL1U～2UTaq酶、2×PCR2.5mmol/L～4.0mmol/LMgCl20.2U～1U的UNG0.2mmol/LTPs0.2mmol/L～0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料（某些熒光PCR儀不需要ROX校正）；也可用等效的實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液。乳粉3g～64℃液態(tài)乳將樣品充分混勻，分別取30mL～60mL，均分成三份，分別為測(cè)試樣品、復(fù)檢樣品和保存樣品，并裝入離心管或密封袋中，加封后，標(biāo)明標(biāo)記，4℃儲(chǔ)存。以上前處理過程中應(yīng)小心操作，確保防止任何交叉污染和樣品組分的改變。DNA1～2g10～20L于50L3～5LBCTABμL～100μL65℃rpm～1000rpm2h或200rpm～300rpm13000g10min，350mL0.713000離心10min800μL1.5mL0.713000g10700μL1.5mLCTAB13000離心10min350μL1.2mol/LNaCl0.8-20℃放置0.5h～1離心10min～15min70%12000離心10min20μL～50μL1-20℃也可用等效DNA提取試劑盒提取模板DNA。DNA使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280。DNA的濃度按照公式（1）計(jì)算：式中：

c=A×N×50/1000 （1）c=DNA濃度，單位為納克每微升（ng/μL）；A=260nm處的吸光值；N=核酸稀釋倍數(shù)。當(dāng)A260/A280比值在1.7～2.1之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增。DNA5ng/μL～10ng/μLPCRPCRDNADNA3Ct實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系如下表2。表2 實(shí)時(shí)光PCR應(yīng)系試劑體積實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)混合液12.5μL正向引物（10μmol/L）0.5μL反向引物（10μmol/L）0.5μL探針（10μmol/L）0.5μLDNA模板（5ng/μL～10ng/μL）5.0μL滅菌ddH2O6.0μLPCR50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。以下條件有一條不滿足時(shí)，實(shí)驗(yàn)視為無效：Ct值＞40.0。Ct值＞40.0。Ct30.0。Ct30.0。4在符合質(zhì)量控制的情況下，被檢樣品進(jìn)行乳源動(dòng)物成分檢測(cè)時(shí)：Ct值≤30Ct值≥3530＜CtCtCt值≥35XXDNA成分”；XXDNA防止污染措施應(yīng)符合GB/T27403附錄D的規(guī)定。5附錄A（）GHGeneBank：KU288612.1GeneBank：EF077162.1，家GeneBank：M57764.1）CTCAGCAGAGTCTTCACCAACAGCCTGGTGTTTGGCACCTCGGACCGTGTCTATGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAAGGCA牛H（enBank64.1GenBnk94361Gnean：GTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATGH山羊GeneBank：KU288612.1，綿羊GeneBank：EF077162.1）TGCCAGCCATCTGTTGTTACCCCTCCCCGTGCCTTCCTAGACCCTGGAAGGTGCCACTCCAGTGCCCACTGTCCTTTCCGH（GeneBank：KU288612.1）GGGAGGGAACTGAGGACCTCAGTGGTATTTTATCCAAGTAAGGATGTGGTCAGGGGAGTAGAAATGGGGGTGTGTGGGGTGGGGAGGGTTCCGAATAAGGCAGTGAGGGGAACCACACACCcytb（GeneBank：KU899144.1）CGGAGTAATCCTCCTATTTGCGACAATAGCCACAGCATTCATAGGCTACGTCTTACCATGAGGACAAATATCATTCTGAGGAGCAACAGTTATTACCAACCTCCTTTCAGCAATTCCATATATTGGCACAAGCCTAGGH（GeneBank：M57764.1）GCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTACCCAGGTGCTGAAGAATTGACCCGGTTCCTCCTGGGCCAGAAAGAAGCAGGCACATCCCCTTCTCTGTGACACACCCTGTCCACGCCCCTGGTTCTTAGcytb（GeneBank：MT975686.1）CGTCTCGGCAGATA