第二核酸的凝膠電泳演示文稿

第二核酸的凝膠電泳演示文稿當(dāng)前1頁，總共83頁。優(yōu)選第二核酸的凝膠電泳當(dāng)前2頁，總共83頁。

前言一、瓊脂糖凝膠電泳二、聚丙烯酰胺凝膠電泳三、脈沖場(chǎng)凝膠電泳當(dāng)前3頁，總共83頁。前言

核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段；優(yōu)點(diǎn)：（1）便于分離;（2）便于檢測(cè);（3）便于回收。

當(dāng)前4頁，總共83頁。當(dāng)前5頁，總共83頁。核酸凝膠電泳的基本原理1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，呈負(fù)離子化狀態(tài)；核酸分子在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度的電場(chǎng)中，它們會(huì)向正電極方向遷移；2）由于在電泳中往往使用無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，電泳遷移率（或遷移速度）與分子的摩擦系數(shù)成反比。而摩擦系數(shù)是分子大?。?gòu)型）、介質(zhì)粘度等的函數(shù)；因此，可在同一凝膠中、一定電場(chǎng)強(qiáng)度下、可在凝膠上分離出不同分子量大小或相同分子量但構(gòu)型有差異的核酸分子。當(dāng)前6頁，總共83頁。一、瓊脂糖凝膠電泳

Agarosegelelectrophoresis當(dāng)前7頁，總共83頁。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是一種從紅色海藻中提取出的線性多糖聚合物。它是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。分為常熔點(diǎn)的瓊脂糖和低熔點(diǎn)（LMP）瓊脂糖。

當(dāng)前8頁，總共83頁。（一）凝膠的制備及電泳當(dāng)前9頁，總共83頁。制膠1.準(zhǔn)備好凝膠成型器，插入成型梳。2.將1.5g瓊脂糖加至100ml1×TAE緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全熔化，冷卻至60℃以下。3.加入5ul溴化乙錠（終濃度0.5ug/ml）至熔化的瓊脂糖液中混勻，但避免出現(xiàn)氣泡。4.將冷卻的瓊脂糖倒入凝膠成型器，制備凝膠。當(dāng)前10頁，總共83頁。當(dāng)前11頁，總共83頁。當(dāng)前12頁，總共83頁。電泳1.待膠變硬，直到它呈乳白狀且不透明（約20分鐘），小心垂直向上拔出梳子，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm。2.用移液器吸取2μl的6X載樣緩沖液于封口膜上，再加入5μl樣品，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。3.接通電源，調(diào)節(jié)電壓至4-5V/cm，DNA從負(fù)極移到正極。電泳時(shí)間30－60分鐘。4.電泳結(jié)束，關(guān)掉電源。當(dāng)前13頁，總共83頁。1.將電泳完畢的瓊脂糖凝膠置于自動(dòng)成像系統(tǒng)的平臺(tái)中間；2.開通紫外光，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶，在電腦中觀察圖像；3.關(guān)上紫外光電源，在電腦中編輯和保存圖像；4.根據(jù)圖像判定結(jié)果。結(jié)果分析當(dāng)前14頁，總共83頁。當(dāng)前15頁，總共83頁。當(dāng)前16頁，總共83頁。當(dāng)前17頁，總共83頁。（二）DNA的遷移速率決定因素當(dāng)前18頁，總共83頁。1DNA分子的大小雙鏈DNA分子遷移的速率與其堿基對(duì)數(shù)的常用對(duì)數(shù)近似成反比；

2瓊脂糖濃度濃度越低，相同核酸分子遷移越快；當(dāng)前19頁，總共83頁。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA相對(duì)遷移距離推測(cè)待測(cè)定的DNA片段的大小當(dāng)前20頁，總共83頁。

3DNA的構(gòu)象

一般同一分子：超螺旋環(huán)狀＞線狀＞切口環(huán)狀。

4凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠

溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長(zhǎng)度增加。當(dāng)前21頁，總共83頁。Agarosegelelectrophoresis當(dāng)前22頁，總共83頁。5所用的電壓低電壓時(shí)DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。

6瓊脂糖種類常見的有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖；當(dāng)前23頁，總共83頁。

不同類型瓊脂糖的性質(zhì)

瓊脂糖類型凝結(jié)溫度/℃熔化溫度/℃

標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖35~3890~95不同廠家生產(chǎn)的不同商品其凝結(jié)溫度和熔化溫度有一定差異40~4285~90

高強(qiáng)度瓊脂糖34~4385~95

修飾的低熔點(diǎn)/凝點(diǎn)瓊脂糖25~3563~653565

超低熔點(diǎn)8~1540~45

低黏性低熔點(diǎn)瓊脂糖25~307038853075當(dāng)前24頁，總共83頁。

不同類型瓊脂糖分離DNA片段的范圍濃度（%）標(biāo)準(zhǔn)(kb)高強(qiáng)度(kb)低熔點(diǎn)(kb)低黏度低溶點(diǎn)(kb)0.31-500.50.7--250.80.5-150.8-100.8-101.00.25-120.4-80.4-81.20.15-60.3-70.3-71.50.08-40.2-40.2-42.00.1-30.1-33.00.05-10.5-14.00.1-0.56.00.01-0.1當(dāng)前25頁，總共83頁。7電泳緩沖液常用的有TAE、TPE及TBE當(dāng)前26頁，總共83頁。TAE、TPE及TBE電泳緩沖液比較

都是常用電泳緩沖液。三者相比：1）TAE的緩沖容量最低，如長(zhǎng)時(shí)間電泳會(huì)被消耗，此時(shí)凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花費(fèi)稍貴，但有高得多的緩沖容量；3）雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中遷移快10%；4）對(duì)于高分子質(zhì)量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，對(duì)于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。當(dāng)前27頁，總共83頁。（二）凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液：臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。載樣緩沖液有三個(gè)作用：1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；2）使樣品帶有顏色便于簡(jiǎn)化上樣過程；3）其中的染料在電場(chǎng)中以可以預(yù)測(cè)的泳動(dòng)速率向陽極遷移。當(dāng)前28頁，總共83頁。6×凝膠載樣緩沖液類型6×緩沖液貯存溫度I0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰FF40%(m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍(lán)室溫0.25%二甲苯氰FF15%Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.25%溴酚藍(lán)4℃40%(m/V)蔗糖水溶液當(dāng)前29頁，總共83頁。（三）瓊脂糖凝膠中DNA的檢測(cè)

通過染色,紫外燈下檢測(cè)。主要有溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）染色法和SYBRGold染色法。當(dāng)前30頁，總共83頁。1凝膠的EB染色當(dāng)前31頁，總共83頁。

觀察瓊脂糖凝膠中DNA最常用的方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色，溴化乙錠含有一個(gè)可以嵌DNA堆積堿基之間的一個(gè)三環(huán)平面基團(tuán)。它與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。當(dāng)前32頁，總共83頁。在高離子強(qiáng)度的飽和溶液中，大約每2.5個(gè)堿基插入一個(gè)溴化乙錠分子。當(dāng)染料分子插入后，其平面基團(tuán)與螺旋的軸線垂直并通過范德華力與上下堿基相互作用。這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致與DNA結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。由于溴化乙錠-DNA復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒有結(jié)合DNA的染料高出20-30倍，所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴化乙錠（0.5ug/ml）時(shí)，可以檢測(cè)到少至10ng的DNA條帶。當(dāng)前33頁，總共83頁。溴化乙錠可以用來檢測(cè)單鏈或雙鏈核酸（DNA或RNA）。但是染料對(duì)單鏈核酸的親和力相對(duì)較小，所以其熒光產(chǎn)率也相對(duì)較低。事實(shí)上，大多數(shù)對(duì)單鏈DNA或RNA染色的熒光是通過染料結(jié)合到分子內(nèi)形成較短的鏈內(nèi)螺旋產(chǎn)生的。

盡管在該染料存在的情況下，線狀DNA的電泳遷移率約降低15%，因此，當(dāng)需要知道DNA片段的準(zhǔn)確大小（如DNA限制酶酶切圖譜的鑒定），凝膠應(yīng)該在無EB情況下電泳，電泳結(jié)束后用EB染色。染色完畢后，通常不需要脫色。但是在檢測(cè)小量DNA（小于10ng）片段時(shí)，通常要將染色后的凝膠進(jìn)行脫色。

當(dāng)前34頁，總共83頁。使用EB染色注意事項(xiàng)（1）EB被認(rèn)為是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)（2）EB可用來檢測(cè)單鏈或雙鏈核酸當(dāng)前35頁，總共83頁。

（3）EB使用時(shí)的配制、貯存及使用

EB常用水配制成10mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5μg/ml

。當(dāng)前36頁，總共83頁。（4）當(dāng)要知道DNA片段準(zhǔn)確大小時(shí)，凝膠應(yīng)在無EB情況下電泳，電泳結(jié)束后再用EB染色。當(dāng)前37頁，總共83頁。EB替代品sybr-green不穩(wěn)定，易降解goldview宣稱無毒,不靈敏,回收連接不好,對(duì)大片段的DNA染色還可以，熒光易猝滅gelred低毒,效果很強(qiáng)!但價(jià)格昂貴genefinder效果一般，以前懷疑它是sybrgreengenegreen不穩(wěn)定，易降解

當(dāng)前38頁，總共83頁。gelRed&gelGreen的凝膠染色

它們是一種新型極敏感染料的商品名稱。其與DNA結(jié)合的親和力高，并且結(jié)合后，能夠極大增強(qiáng)熒光信號(hào)。當(dāng)前39頁，總共83頁。（四）凝膠中DNA的成像

可以用透射或入射紫外光對(duì)EB染色的凝膠成像，圖像可以直接輸出到計(jì)算機(jī)觀察。當(dāng)前40頁，總共83頁。（五）凝膠中DNA的回收現(xiàn)一般采用試劑盒回收：存在的主要問題：1不能有效的回收大片段DNA2不能有效回收少量DNA當(dāng)前41頁，總共83頁。二、聚丙烯酰胺凝膠電泳

polyacrylamidegelelectrophoresis

PAGE當(dāng)前42頁，總共83頁。當(dāng)前43頁，總共83頁。

在TEMED(四甲基乙二胺)催化過硫酸銨還原產(chǎn)生的自由基的存在下，丙烯酰胺單體的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的線狀長(zhǎng)鏈。在雙功能交聯(lián)劑如N，N`-亞甲基雙丙烯酰胺的參與下的共聚合反應(yīng)中，聚丙烯胺的交聯(lián)形成三維帶狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。（一）聚丙烯酰胺凝膠的本質(zhì)當(dāng)前44頁，總共83頁。CH2=CH-C(O)-NH2

(丙烯酰胺）

CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2

（N，N`-亞甲雙丙烯酰胺）當(dāng)前45頁，總共83頁。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳種類1變性聚丙烯酰胺凝膠

用于單鏈DNA片段的分離或純化。

變性的DNA在這些凝膠中的遷移率幾乎與其堿基組成及序列完全無關(guān)。用途：放射性DNA探針的分離、DNA測(cè)序反應(yīng)等。當(dāng)前46頁，總共83頁。

2非變性聚丙烯酰胺凝膠

用于雙鏈DNA片段的分離和純化。注：遷移率受其堿基組成和序列的影響。用途：制備高純度的DNA片段。當(dāng)前47頁，總共83頁。（三）DNA在聚丙烯胺凝膠中的有效分離范圍丙烯酰胺濃度（%）有效分離范圍（bp）二甲苯氰FF溴酚藍(lán)3.51000~20004601005.080~500260658.060~4001604512.040~200702015.025~150601520.06~1004512當(dāng)前48頁，總共83頁。三、脈沖場(chǎng)凝膠電泳

（pulsed-fieldgelelectrophoresis，

PFGE）當(dāng)前49頁，總共83頁。為何選PFGE？

超過一定大小的線狀雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中以相同速率遷移。大于該極限長(zhǎng)度（40kb）后DNA的遷移速率幾乎與分子大小無關(guān)，而主要決定于電場(chǎng)強(qiáng)度。但PEGE

解決了這一問題。

當(dāng)前50頁，總共83頁。（一）脈沖電場(chǎng)凝膠電泳基本原理1984年，發(fā)明的。分離超大分子量的DNA分子。在脈沖電泳中，電場(chǎng)方向是周期變化的，頭一個(gè)脈沖電場(chǎng)方向與核酸的移動(dòng)方向成45度角，下一個(gè)脈沖的電場(chǎng)方向與核酸移動(dòng)方向在另一側(cè)成45度角，由于加在瓊脂糖凝膠電泳上的電場(chǎng)方向、電流大小、以及作用時(shí)間都在交替地變換著，這就使得DNA分子必須隨時(shí)調(diào)整其泳動(dòng)的方向，來適應(yīng)凝膠孔隙的無規(guī)則變化。與分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要較多的次數(shù)來更換其構(gòu)型和方位，使之能夠按新的方向游動(dòng)，所以遷移率就慢，從而達(dá)到了分離大分子量DNA分子的目的。10^7bp的DNA大分子當(dāng)前51頁，總共83頁。B+A-+A-B脈沖電場(chǎng)電泳示意圖當(dāng)前52頁，總共83頁。PFGEcanresolvelargeDNAfragments當(dāng)前53頁，總共83頁。（二）PEGE類型垂直脈沖場(chǎng)電泳系統(tǒng)(verticalpulsedfield)場(chǎng)翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)(fieldinversion)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)(rotatinggel)箝位勻強(qiáng)電場(chǎng)系統(tǒng)(contour-clampedhomogeneouselectricfield)當(dāng)前54頁，總共83頁。A-+AB-+B垂直交變電場(chǎng)系統(tǒng)場(chǎng)翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)箝位勻強(qiáng)電場(chǎng)系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)A-+AB-+BA-+AB-+B-+當(dāng)前55頁，總共83頁。（三）影響分辨率的因素1脈沖時(shí)間（0.1s-1000s)：增加脈沖時(shí)間分離較大分子，減少脈沖時(shí)間分離較小分子。2電壓：若固定脈沖時(shí)間，增加電場(chǎng)強(qiáng)度就增大了可分離最大片段的范圍，但是太大的電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)導(dǎo)致較小片段泳動(dòng)的紊亂。當(dāng)前56頁，總共83頁。3電場(chǎng)夾角：電場(chǎng)方向的夾角常為1100-1200，研究證實(shí)900夾角也非常有效的。4溫度：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖電泳基本在室溫進(jìn)行，PFGE一般應(yīng)在4℃進(jìn)行。較高的溫度DNA泳動(dòng)較快；但是較高的溫度也引起較小片段的泳動(dòng)截留和明顯的條帶變寬。當(dāng)前57頁，總共83頁。核酸分子雜交（DNA/DNAorDNA/RNA）技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)，是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。

當(dāng)前58頁，總共83頁。

雜種核酸分子：彼此退火的核酸來自不同的生物有機(jī)體，而形成的雙鏈分子。

DNA/DNA的雜交作用檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間的親源關(guān)系

DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片段中某種特定基因的位置。當(dāng)前59頁，總共83頁。核酸雜交常用幾種膜的性能比較當(dāng)前60頁，總共83頁。硝酸纖維素膜不能滯留小于150bp的DNA片段，不能同RNA結(jié)合。應(yīng)用1mol/L醋酸銨和0.2mol/L的NaOH緩沖液代替SSC緩沖液可改善對(duì)小片段DNA的滯留能力。

RNA變性后也能十分容易的結(jié)合到膜上。當(dāng)前61頁，總共83頁。

尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟：

1.核酸印跡轉(zhuǎn)移：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持膜上。利用的是毛細(xì)管作用

2.印跡雜交：將具有核酸印跡的濾膜同帶有標(biāo)記的DNA/RNA進(jìn)行雜交。當(dāng)前62頁，總共83頁。1、薩瑟恩DNA印跡雜交

根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由E.Southern于1975年首先設(shè)計(jì)出來的，故又叫SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。

當(dāng)前63頁，總共83頁。

印跡轉(zhuǎn)移前的凝膠處理：分子量不同所需轉(zhuǎn)移的時(shí)間不同；浸泡在0.25M的HCl溶液中脫嘌呤，再進(jìn)行堿變性堿水解，DNA鏈斷裂單鏈當(dāng)前64頁，總共83頁。（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片Southern凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)當(dāng)前65頁，總共83頁。當(dāng)前66頁，總共83頁。當(dāng)前67頁，總共83頁。SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片

水稻（OryzasativaL.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標(biāo)記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶，表明含有水稻的psbA基因序列。當(dāng)前68頁，總共83頁。

在進(jìn)行核酸印跡轉(zhuǎn)移的時(shí)，

1.要將以轉(zhuǎn)好的硝酸纖維素膜在80度下烘烤1～2小時(shí)；

2.紫外線交聯(lián)法，將DNA分子上的部分胸腺嘧啶殘基同尼龍膜表面的帶正電荷的氨基基團(tuán)之間進(jìn)行交聯(lián)。

當(dāng)前69頁，總共83頁。2、諾賽恩RNA印跡技術(shù)（Northernblotting）

1979年，等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于這種方法與薩瑟恩DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做諾賽恩RNA印跡技術(shù)（Northernblotting）。

當(dāng)前70頁，總共83頁。當(dāng)前71頁，總共83頁。3.而將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)，這種技術(shù)叫做韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（Westernblotting）。當(dāng)前72頁，總共83頁。當(dāng)前73頁，總共83頁。當(dāng)前74頁，總共83頁。4、斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交斑點(diǎn)印跡雜交（dotblotting）和狹線印跡雜交（slotblotting）是在Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的量種類式的快速檢測(cè)特定核酸（DNA和RNA）分子