食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第一節(jié)總菌落數(shù)檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第1頁(yè)一、菌落總數(shù)介紹食品驗(yàn)樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成份、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等），所得1mL（或1g)驗(yàn)樣中形成菌落總數(shù)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只包含一群在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)發(fā)育嗜中溫需氧菌或兼性厭氧菌菌落總數(shù)。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第一節(jié)總菌落數(shù)檢驗(yàn)與分析●

食品污染程度標(biāo)志●

預(yù)測(cè)食品存放期限衛(wèi)生學(xué)意義食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第2頁(yè)二、檢驗(yàn)方法菌落總數(shù)測(cè)定，普通將被檢樣品制成幾個(gè)不一樣10倍遞增稀釋液，然后從每個(gè)稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，在一定溫度下，培養(yǎng)一定時(shí)間后（普通為48小時(shí)），統(tǒng)計(jì)每個(gè)平皿中形成菌落數(shù)量，依據(jù)稀釋倍數(shù)，計(jì)算出每克（或每mL）原始樣品中所含細(xì)菌菌落總數(shù)?；静僮髌胀ò簶悠废♂?---傾注平皿----培養(yǎng)48小時(shí)----計(jì)數(shù)匯報(bào)。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第一節(jié)總菌落數(shù)檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第3頁(yè)三、檢驗(yàn)程序GB/T4789.2-

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第一節(jié)總菌落數(shù)檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第4頁(yè)四、操作步驟（一）最先準(zhǔn)備器材（清洗、烘干、包扎、滅菌）

規(guī)格名稱 數(shù)量 1、500mL廣口瓶 1個(gè) 2、500mL三角瓶 1個(gè) 3、250mL三角瓶 2個(gè) 4、18×180mm試管 3支 5、1mL移液管 5支6、直徑為90mm平皿 10套 7、250mL量筒 1支8、玻璃珠：直徑約5mm9、剪刀1把不銹鋼藥匙1把

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第一節(jié)總菌落數(shù)檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第5頁(yè)樣品：袋裝鮮奶1．操作方法用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用無(wú)菌剪刀開(kāi)封取樣。稱取檢樣25mL，放入裝有適量玻璃珠滅菌廣口瓶子中，然后用225mL溫?zé)釡缇睇}水漸漸加入，振搖均勻，即為1:10稀釋液。用1mL滅菌吸管吸收1：10稀釋液1mL，沿管壁漸漸注入含有9mL滅菌生理鹽水或其它稀釋液試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1：100稀釋液。另取1mL滅菌吸管，按上項(xiàng)操作次序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1mL滅菌吸管。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第一節(jié)總菌落數(shù)檢驗(yàn)與分析（二）樣品處理和稀釋食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第6頁(yè)

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第一節(jié)總菌落數(shù)檢驗(yàn)與分析（二）樣品處理和稀釋食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第7頁(yè)1．操作方法依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r預(yù)計(jì)，選擇2~3個(gè)適宜稀釋度，分別在制10倍遞增稀釋同時(shí)，以吸收該稀釋度吸管移取1mL稀釋液于滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。將涼至46℃平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，混合均勻。同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1mL稀釋液（不含樣品）滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第一節(jié)總菌落數(shù)檢驗(yàn)與分析（二）樣品處理和稀釋食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第8頁(yè)（四）菌落計(jì)數(shù)1、計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)選取菌落數(shù)在30~300之間平板（SN標(biāo)準(zhǔn)要求為25~250個(gè)菌落），若有二個(gè)稀釋度均在30~300之間時(shí)，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法要求應(yīng)以二者比值決定，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字（有要求不考慮其比值大小，均以平均數(shù)匯報(bào)）。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第一節(jié)總菌落數(shù)檢驗(yàn)與分析可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，統(tǒng)計(jì)稀釋倍數(shù)和對(duì)應(yīng)菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（CFU）表示。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第9頁(yè)2、若全部稀釋度均不在計(jì)數(shù)區(qū)間，如均大于300，則取最高稀釋度平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)匯報(bào)之；如均小于30，則以最低稀釋度平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)匯報(bào)之。如菌落數(shù)有大于300，有又小于30，但均不在30~300之間，則應(yīng)以最靠近300或30平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)匯報(bào)之。如全部稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)匯報(bào)之。（四）菌落計(jì)數(shù)

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第一節(jié)總菌落數(shù)檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第10頁(yè)3、不一樣稀釋度菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比，即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗(yàn)中差錯(cuò)，不應(yīng)作為檢樣計(jì)數(shù)匯報(bào)依據(jù)。4、當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，如呈鏈狀生長(zhǎng)菌落之間無(wú)任何顯著界限，則應(yīng)作為一個(gè)菌落計(jì)，如存在有幾條不一樣起源鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算，不要把鏈上生長(zhǎng)每一個(gè)菌落分開(kāi)計(jì)數(shù)。如有片狀菌落生長(zhǎng)，該平板普通不宜采取，如片狀菌落不到平板二分之一，而另二分之一又分布均勻，則能夠半個(gè)平板菌落數(shù)乘2代表全平板菌落數(shù)。（四）菌落計(jì)數(shù)

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第一節(jié)總菌落數(shù)檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第11頁(yè)（四）菌落計(jì)數(shù)

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第一節(jié)總菌落數(shù)檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第12頁(yè)5、當(dāng)計(jì)數(shù)平板內(nèi)菌落數(shù)過(guò)多（即全部稀釋度均大于300時(shí)），但分布很均勻，可取平板二分之一或1/4計(jì)數(shù)。再乘以對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板菌落數(shù)五、菌落數(shù)匯報(bào)按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法要求菌落數(shù)在1~100時(shí)，按實(shí)有數(shù)字匯報(bào)，如大于100時(shí)，則匯報(bào)前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計(jì)算。匯報(bào)方式以下表為例（四）菌落計(jì)數(shù)

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第一節(jié)總菌落數(shù)檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第13頁(yè)

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第一節(jié)總菌落數(shù)檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第14頁(yè)第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第15頁(yè)大腸菌群是指一群在37℃培養(yǎng)24小時(shí)能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。作為糞便污染指標(biāo)，有廣泛衛(wèi)生學(xué)意義。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第16頁(yè)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第17頁(yè)檢測(cè)步驟食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第18頁(yè)1、檢樣稀釋MPN：表示食品中大腸菌群數(shù)是以每100mL或克檢樣內(nèi)大腸菌群最近似值，普通采取9管法。普通樣品25mL（克）+225mL生理鹽水=1：10，從此10-1取樣10mL，則其中含樣品為1mL（克）。接種到3管雙料乳糖發(fā)酵管中。從此10-1取樣1mL，則其中含樣品為0.1mL（克）。接種到3管單料乳糖發(fā)酵管中。表142—143。從10-1取樣1mL+9mL生理鹽水=1：100，從10-2取樣1mL，則其中含樣品為0.01mL（克）。接種到3管單料乳糖發(fā)酵管中。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第19頁(yè)2、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)（1）培養(yǎng)基單料乳糖膽鹽發(fā)酵管：蛋白胨2%豬膽鹽（或牛膽鹽）0.5%乳糖1%、1.6%溴甲酚紫酒精液0.06mlpH7.4。制法：將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示劑，分裝每管10mL，并放入一個(gè)小倒管，115℃高壓滅菌15min。

雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外其它成份加倍。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第20頁(yè)（2）原理溴甲酚紫，中性時(shí)呈藍(lán)紫色，酸性時(shí)呈黃色，假如顏色不變（呈藍(lán)紫色），說(shuō)明無(wú)產(chǎn)酸大腸菌群；假如顏色變黃色，說(shuō)明可能出現(xiàn)能分解乳糖產(chǎn)酸大腸菌群。膽鹽能夠抑制其它細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣大腸菌群，看小倒管中氣體。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第21頁(yè)杜氏發(fā)酵管產(chǎn)氣情況1產(chǎn)氣2不產(chǎn)氣

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第22頁(yè)判別培養(yǎng)基名稱加入化學(xué)物質(zhì)微生物代謝產(chǎn)物培養(yǎng)基特征性改變主要用途H2S試驗(yàn)培養(yǎng)基糖發(fā)酵培養(yǎng)基伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基醋酸鉛溴甲酚紫伊紅、美藍(lán)H2S乳酸、醋酸、丙酸等酸產(chǎn)生黑色沉淀由紫色變成黃色帶金屬光澤深紫色菌落判別產(chǎn)H2S菌株判別腸道細(xì)菌判別大腸菌群3、判別和分離培養(yǎng)

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第23頁(yè)4、證實(shí)試驗(yàn)（1）革蘭氏染色：陰性、短桿菌（2）乳糖復(fù)發(fā)酵：產(chǎn)酸產(chǎn)氣

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第24頁(yè)糞大腸菌群檢驗(yàn)檢驗(yàn)稀釋乳糖發(fā)酵試驗(yàn)證實(shí)證驗(yàn)（EC肉湯發(fā)酵伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基）結(jié)果評(píng)定

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第25頁(yè)EC肉湯（大腸桿菌檢驗(yàn)肉湯,E.ColiBroth

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第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第26頁(yè)第一個(gè)半天器材準(zhǔn)備準(zhǔn)備器材并滅菌，以下：1、250mL三角瓶1個(gè)2、18×180mm試管2支3、乳糖發(fā)酵管（帶黑帽或棉塞，有刻度試管，內(nèi)帶小倒管）15支4、250mL量筒1支5、1mL移液管2支6、10mL移液管2支7、平皿6套

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第27頁(yè)第二個(gè)半天樣品處理及初發(fā)酵1、樣品處理2、檢樣稀釋與乳糖膽鹽發(fā)酵試驗(yàn)3、培養(yǎng)18—26小時(shí)，于35—37攝氏度

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第28頁(yè)第二天伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基分離培養(yǎng)[接種EC肉湯（糞大腸菌群）1、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基分離培養(yǎng)2、接種EC肉湯（大腸桿菌檢驗(yàn)肉湯,E.ColiBroth

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第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析

伊紅Y是一個(gè)酸性染料,有色部分為陰離子(E-)美藍(lán)是一個(gè)堿性染料,有色部分是陽(yáng)離子(M+)。細(xì)菌細(xì)胞主要成份是蛋白質(zhì),因?yàn)榈鞍踪|(zhì)系兩性電解質(zhì),在偏酸性環(huán)境中正電荷增多,易與伊紅結(jié)合,在堿性環(huán)境中負(fù)電荷增多,易與美藍(lán)結(jié)合。而細(xì)菌發(fā)酵乳糖是產(chǎn)酸.美藍(lán)并不是完全不起作用，多見(jiàn)于經(jīng)典大腸桿菌(乳糖發(fā)酵很快速),在伊紅染成粉紅色之后,美藍(lán)能夠繼續(xù)將其染成紫黑色帶金屬光澤菌落。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第29頁(yè)第三天證實(shí)試驗(yàn)1、乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)2、從陽(yáng)性EC肉湯接種EMB分離培養(yǎng)。3、EMB經(jīng)典菌落革蘭氏染色鏡檢

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析革蘭氏染色：陰性、短桿菌食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第30頁(yè)第四天觀察結(jié)果與器材消毒與清洗1、觀察乳糖發(fā)酵管結(jié)果2、觀察EMB培養(yǎng)結(jié)果并革蘭氏染色鏡檢3、器材消毒與清洗4、查表匯報(bào)結(jié)果與撰寫試驗(yàn)匯報(bào)

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)大腸菌群檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第31頁(yè)

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第32頁(yè)沙門菌屬（Salmonella）是一大群寄生于人類和動(dòng)物腸道內(nèi)，生化反應(yīng)和抗原結(jié)構(gòu)相同革蘭氏陰性桿菌統(tǒng)稱為沙門桿菌。一、沙門氏菌生物學(xué)特征

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第33頁(yè)

1885年沙門氏等在霍亂流行時(shí)分離到豬霍亂沙門氏菌，故定名為沙門氏菌屬。沙門氏菌屬有專對(duì)人類致病，有只對(duì)動(dòng)物致病，也有對(duì)人和動(dòng)物都致病。沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所引發(fā)對(duì)人類、家畜以及野生禽獸不一樣形式總稱。感染沙門氏菌人或帶菌者糞便污染食品，可使人發(fā)生食物中毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)在世界各國(guó)種類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引發(fā)食物中毒常列榜首。中國(guó)內(nèi)陸地域也以沙門氏菌為首位。

1、沙門氏桿菌介紹

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第34頁(yè)沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上含有主要意義人畜共患病之一，沙門氏菌屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌。造成胃腸炎、傷寒和副傷寒細(xì)菌。它們除可感染人外，還可感染很多動(dòng)物包含哺乳類、鳥(niǎo)、爬行類、魚(yú)、兩棲類及昆蟲(chóng)。已發(fā)覺(jué)近一千種（或菌株）。按其抗原成份，沙門氏菌可分為甲、乙、丙、丁、戊等基本菌組。其中與人體疾病相關(guān)主要有甲組副傷寒甲桿菌，乙組副傷寒乙桿菌和鼠傷寒桿菌，丙組副傷寒丙桿菌和豬霍亂桿菌，丁組傷寒桿菌和腸炎桿菌等。

1、沙門氏桿菌介紹

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第35頁(yè)形態(tài)、染色G-桿菌0.6-1.0um×2-4um周身鞭毛，有菌毛。沙門氏桿菌形態(tài)大小

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第36頁(yè)生化反應(yīng)不分解乳糖（亞利桑那菌除外），分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣（傷寒沙門菌產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）。多數(shù)產(chǎn)生H2S，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不液化明膠，不分解尿素，不產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，多數(shù)能利用枸櫞酸鹽，能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在氰化鉀培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第37頁(yè)沙門菌病當(dāng)前最少有67種O抗原和個(gè)以上血清型，所致疾病稱沙門菌病。腸熱癥----是傷寒病和副傷寒病總稱，主要由傷寒桿菌和甲、乙、丙型副傷寒桿菌引發(fā)。急性腸炎（食物中毒）----是最常見(jiàn)沙門桿菌感染。多由鼠傷寒桿菌、豬霍亂桿菌、腸炎桿菌等引發(fā)。敗血癥----常由豬霍亂桿菌、丙型副傷寒桿菌、鼠傷寒桿菌、腸炎桿菌等引發(fā)。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第38頁(yè)三、沙門氏菌檢驗(yàn)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T4789.4-微生物學(xué)檢驗(yàn)

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第39頁(yè)凍肉、蛋品、乳品及其它加工食品鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其它未經(jīng)加工食品前增菌法25g＋BPW225mL36℃±1℃普通4h，干蛋品18h～24h10mL＋MM（或TTB）100mL10mL＋SC100mL直接增菌法25g＋滅菌生理鹽水25mL檢樣勻液25mL＋MM（或TTB）100mL檢樣勻液25mL＋SC100mLBSDHL（或HE、WS、SS）TSI（排除A/AH2S－結(jié)果），靛基質(zhì)，尿素，KCN，賴氨酸沙門氏菌血清學(xué)試驗(yàn)甘露醇山梨醇H2S＋靛＋尿－KCN－賴＋H2S－靛－尿－KCN－賴＋/－非如左述各種反應(yīng)結(jié)果沙門氏菌血清學(xué)試驗(yàn)ONPG－沙門氏菌非沙門氏菌42℃18h～24h36℃±1℃18h～24h42℃18h～24h36℃±1℃18h～24h36℃±1℃40h～48h36℃±1℃18h～24h第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第40頁(yè)前增菌：25克（加工食品）+225毫升緩沖蛋白胨37度培養(yǎng)4小時(shí)（干蛋品18—24小時(shí)）。增菌：移取10毫升接種于100mL增菌液中。氯化鎂孔雀綠（MM）或四硫酸鈉煌綠（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）。（一）前增菌和增菌（二）分離培養(yǎng)最適生長(zhǎng)溫度為35～37℃，最適pH值為6.8～7.8。選擇性瓊脂平板：BS培養(yǎng)基（亞硫酸鉍瓊脂）、DHL瓊脂、HE（?？祟D腸內(nèi)瓊脂培養(yǎng)基）或WS瓊脂、SS瓊脂。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第41頁(yè)選擇瓊脂平板沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ沙門氏菌Ⅲ（即亞利桑那菌）亞硫酸瓊脂(BS瓊脂)產(chǎn)硫化氫菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色菌落，周圍培養(yǎng)基不變。黑色有金屬光澤DHL瓊脂無(wú)色半透明，產(chǎn)硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色。乳糖遲緩陽(yáng)性或陰性菌株與沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖陽(yáng)性菌株為粉紅色，中心帶黑色。HE瓊脂WS瓊脂藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落中心黑色或幾乎全黑色。乳糖陽(yáng)性菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色；乳糖遲緩陽(yáng)性或陰性菌株為藍(lán)綠色或藍(lán)色，中心黑色或幾乎全黑色。SS瓊脂無(wú)色半透明，產(chǎn)硫化氫菌株有菌落中心帶黑色，但不如以上培養(yǎng)基顯著.乳糖遲緩陽(yáng)性或陰性菌株，與沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖陽(yáng)性菌株為粉紅色，中心黑色，但中心無(wú)黑色形成時(shí)與大腸艾希氏菌不能區(qū)分.第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第42頁(yè)

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第43頁(yè)（三）五項(xiàng)生化試驗(yàn)1、三糖鐵瓊脂試驗(yàn)2、靛基質(zhì)試驗(yàn)（吲哚試驗(yàn)）3、尿素酶試驗(yàn)4、氰化鉀試驗(yàn)（KCN）5、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第44頁(yè)1、三糖鐵（TSI）試驗(yàn)

腸道桿菌科為革蘭氏陰性菌，可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸。三糖鐵瓊脂試驗(yàn)是利用糖類發(fā)酵之不一樣與硫化氫產(chǎn)生是否，將腸道桿菌科各組細(xì)菌或各菌屬加以區(qū)分。

三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基含有1﹪乳糖及蔗糖與0.1﹪葡萄糖作為發(fā)酵基質(zhì)，且以酚紅作為酸堿指示劑，如培養(yǎng)基由橘紅轉(zhuǎn)為黃色，表示有糖類發(fā)酵。測(cè)試時(shí)使用接種針先穿刺至底部，而后于斜面作劃線接種，經(jīng)培養(yǎng)18-24小時(shí)后，依情況判斷糖類之發(fā)酵情形。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第45頁(yè)制好培養(yǎng)基對(duì)照管斜面紅色，底面黃色培養(yǎng)基全黃色斜面、底部黃色，并產(chǎn)生H2S斜面紅色，底部黃色，產(chǎn)生H2S底面黃色，并產(chǎn)生CO2

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第46頁(yè)（1）斜面堿性（紅色-）底部酸性（黃色+）產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣（產(chǎn)氣時(shí)會(huì)造成瓊脂裂開(kāi)）：表示僅葡萄糖發(fā)酵。因微生物優(yōu)先分解葡萄糖產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基變黃，但因葡萄糖含量低，于斜面產(chǎn)生之微量酸馬上氧化而呈堿性反應(yīng)，同時(shí)培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)也隨之利用而產(chǎn)堿，培養(yǎng)基底部則因氧張力較小，且微生物生長(zhǎng)較慢，故仍維持酸性反應(yīng)。（2）斜面酸性（黃色+）底部酸性（黃色+）產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣：表示除了葡萄糖發(fā)酵外，乳糖與（或）蔗糖也發(fā)酵。因?yàn)槿樘桥c蔗糖濃度高，經(jīng)繼續(xù)發(fā)酵，可維持培養(yǎng)基斜面與底部保持酸性反應(yīng)。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第47頁(yè)（3）斜面堿性（紅色-）底部堿性（紅色-）或無(wú)改變（橘紅色）：表示無(wú)糖類發(fā)酵。而蛋白質(zhì)則于有氧或厭氧條件下進(jìn)行代謝產(chǎn)生氨，而使培養(yǎng)基呈堿性反應(yīng)，如有氧與厭氧均發(fā)生蛋白質(zhì)分解，則斜面與底部均呈堿性反應(yīng)。

為使結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)于接種培養(yǎng)18-24小時(shí)內(nèi)觀察結(jié)果，以確保糖類還未用盡，且蛋白質(zhì)分解之堿性終產(chǎn)物還未產(chǎn)生。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第48頁(yè)培養(yǎng)基變黑（4）三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中亦含有硫代硫酸鈉作為產(chǎn)生硫化氫之基質(zhì)，且含硫酸亞鐵作為檢測(cè)此無(wú)色產(chǎn)物之指示劑，經(jīng)接種培養(yǎng)后，若微生物有硫化氫產(chǎn)生，會(huì)與亞鐵離子作用生成不溶性硫化亞鐵之沉淀，進(jìn)而使培養(yǎng)基變黑。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第49頁(yè)2、靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn)陰性（液面黃）陽(yáng)性（液面玫瑰紅）

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第50頁(yè)3、尿素酶試驗(yàn)陰性（黃）陽(yáng)性（紅）

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第51頁(yè)5、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)對(duì)照陽(yáng)性（紫）陰性（黃）

4、氰化鉀試驗(yàn)“渾濁”為“+”

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第52頁(yè)ONPG試驗(yàn)陽(yáng)性（黃）空白丙二酸鹽試驗(yàn)陽(yáng)性（蘭）陰性（不變）

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第53頁(yè)第一天器材準(zhǔn)備、樣品處理和增菌培養(yǎng)規(guī)格名稱 數(shù)量

1、500mL三角瓶 2個(gè) 2、15×150mm試管20支 3、1mL移液管 5支4、10mL移液管 2支5、直徑為90mm平皿 12套 6、250mL量筒 1支其它：均質(zhì)器、玻璃珠等。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第54頁(yè)第二天接種選擇性平板進(jìn)行分離培養(yǎng)從平板上挑取可疑菌落接種到：三糖鐵瓊脂、蛋白陳水、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基。第四天觀察五項(xiàng)生化試驗(yàn)結(jié)果，判斷沙門氏菌屬性。第三天觀察分離結(jié)果

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)第二節(jié)沙門氏桿菌檢驗(yàn)與分析食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第55頁(yè)第三節(jié)志賀氏菌檢驗(yàn)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第56頁(yè)（一）形態(tài)與染色

革蘭氏陰性短桿菌、無(wú)莢膜，無(wú)芽胞，無(wú)鞭毛，有菌毛。2~3um×0.5~0.7um一、志賀氏菌生物學(xué)特征第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第57頁(yè)（二）培養(yǎng)特征1、需氧或兼氧性厭氧，最適溫度37℃，PH7.2~7.42、在普通瓊脂和SS平板上，能形成圓形、微凸、光滑濕潤(rùn)、無(wú)色半透明、邊緣整齊、在中等大小菌落3、宋氏志賀氏菌菌落較大，較不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可遲發(fā)酵乳糖，菌落呈玫瑰紅色。4、在肉湯中呈均勻混濁生長(zhǎng)，無(wú)菌膜。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第58頁(yè)（三）生化反應(yīng)1、發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，除宋氏志賀氏菌外，均不發(fā)酵乳糖。2、不發(fā)酵側(cè)金盞花醇、肌醇、水楊苷。3、不產(chǎn)生H2S，不分解尿素，V-P試驗(yàn)陰性，不能利用檸檬酸鹽。4、甲基紅陽(yáng)性。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第59頁(yè)二、志賀氏菌致病性與食物中毒（一）傳染源食物、病人、糞便、蒼蠅等（二）志賀氏菌致病性致病原因：侵襲力、菌體內(nèi)毒素、外毒素。臨床癥狀：A、急性細(xì)菌性痢疾：急性經(jīng)典、急性非經(jīng)典、急性中毒性菌痢。B、慢性細(xì)菌性痢疾：慢性遷延型、慢性隱伏型、慢性急性發(fā)作型。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第60頁(yè)GB/T4789.5-

中志賀氏菌檢驗(yàn)程序三、志賀氏菌檢驗(yàn)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第61頁(yè)（一）試驗(yàn)內(nèi)容樣品處理→→選擇性增菌→→選擇性平板分離→→生化學(xué)試驗(yàn)→→結(jié)果匯報(bào)第一天樣品處理和增菌培養(yǎng)早晨準(zhǔn)備并滅菌器材下午規(guī)格名稱 數(shù)量1、樣品處理無(wú)菌操作稱取檢樣25g，加入裝有225mLGN增菌液500mL廣口瓶?jī)?nèi)，固體食品用均質(zhì)器以8000-10000r/min打壞1min。2、增菌培養(yǎng)放于36℃培養(yǎng)6～8h。培養(yǎng)時(shí)間視細(xì)菌生長(zhǎng)情況而定，當(dāng)培養(yǎng)液出現(xiàn)輕微混濁時(shí)即應(yīng)中止培養(yǎng)。500ml廣口瓶1個(gè)18×180mm試管6支13×100mm試管 13支10ml移液管 1支直徑為90mm平皿6套250ml量筒1支不銹鋼湯匙1把，玻璃珠，杜氏小管第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第62頁(yè)第二天接種選擇性平板進(jìn)行分離培養(yǎng)（一）接種選擇性平板取增菌液1環(huán)，劃線接種于HE瓊脂平板或SS瓊脂平板1個(gè)；另取1環(huán)劃線接種于麥康凱瓊脂平板和EMB（伊紅美藍(lán)）瓊脂平板各1個(gè)。（二）培養(yǎng)放于36℃培養(yǎng)18～24h。結(jié)果：志賀氏菌在這些培養(yǎng)基上展現(xiàn)無(wú)色透明不發(fā)酵乳糖菌落。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第63頁(yè)HE平板原理及反應(yīng)發(fā)酵乳糖腸桿菌不發(fā)酵乳糖某種腸道菌，而且產(chǎn)生硫化氫，可能是沙門氏菌不發(fā)酵乳糖，菌落呈藍(lán)綠色或藍(lán)色可能就是志賀氏菌第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第64頁(yè)SS平板原理及反應(yīng)SSAgar(SalmonellaShigellaAgar)大腸桿菌或者別發(fā)酵乳糖腸桿菌。是沙門氏菌。有黑色中心。假如沒(méi)有黑色中心，就很可能是志賀氏菌了。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第65頁(yè)麥康凱瓊脂平板

菌落為粉紅色，半透明，可能為志賀氏菌。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第66頁(yè)EMB平板照片及原理

菌落為無(wú)色半透明狀，可能為志賀氏菌。

大腸桿菌第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第67頁(yè)第三天初步生化試驗(yàn)（一）接種三糖鐵瓊脂和葡萄糖半固體培養(yǎng)基從HE或SS、麥康凱或EMB瓊脂平板、挑取平板上可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和葡萄糖半固體各1管。普通應(yīng)多挑幾個(gè)菌落，以防遺漏。經(jīng)36℃培養(yǎng)18～24h，分別觀察結(jié)果。（二）培養(yǎng)放于36℃培養(yǎng)18～24h。結(jié)果：乳糖、蔗糖不發(fā)酵，葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣(福氏志賀氏菌6型可產(chǎn)生少許氣體)，無(wú)動(dòng)力。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第68頁(yè)志賀氏菌在TSI生長(zhǎng)結(jié)果（現(xiàn)象）：（1）斜面產(chǎn)堿仍為紅色或粉紅色；（2）底層產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，變黃色；（3）不產(chǎn)H2S，不出現(xiàn)黑色。志賀氏菌在葡萄糖半固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)：沿線生長(zhǎng)，無(wú)動(dòng)力。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第69頁(yè)三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)原理2－志賀氏菌3－沙門氏菌4－大腸桿菌

葡萄糖半固體原理及結(jié)果1.銅綠假單胞菌

2.志賀氏菌

3.枯草芽孢桿菌第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第70頁(yè)在志賀氏菌檢驗(yàn)中可棄去培養(yǎng)物：（1）在TSI表面上展現(xiàn)蔓延生長(zhǎng)培養(yǎng)物（2）在18~24h發(fā)酵乳糖、蔗糖培養(yǎng)物（3）不分解葡萄糖，只在半固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)培養(yǎng)物。（4）產(chǎn)氣培養(yǎng)物（5）有動(dòng)力培養(yǎng)物（6）產(chǎn)H2S培養(yǎng)物第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第71頁(yè)第四天深入生化試驗(yàn)凡是乳糖、蔗糖不發(fā)酵，葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣(福氏志賀氏菌6型可產(chǎn)生少許氣體)，無(wú)動(dòng)力菌株，可做深入生化試驗(yàn)和生化分型試驗(yàn)。（一）深入生化試驗(yàn)即：葡萄糖銨，西蒙氏檸檬酸鹽，賴氨酸和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶，pH7.2尿素，KCN生長(zhǎng)，以及水楊苷和七葉苷分解，36℃培養(yǎng)。志賀氏菌屬培養(yǎng)物均為陰性結(jié)果。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第72頁(yè)（二）生化分群試驗(yàn)接種生化培養(yǎng)基從三糖鐵瓊脂上挑取培養(yǎng)物上,拌種到：5%乳糖、靛基質(zhì)培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第73頁(yè)各項(xiàng)生化試驗(yàn)現(xiàn)象葡萄糖銨：陽(yáng)性者斜面上有正常大小菌落生長(zhǎng)，陰性者不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)極微小菌落。西蒙氏檸檬酸鹽：陽(yáng)性者斜面上菌落生長(zhǎng)，培養(yǎng)基由綠色轉(zhuǎn)為藍(lán)色，陰性者不生長(zhǎng)。賴氨酸和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶：陽(yáng)性者為紫色，陰性者為黃色。pH7.2尿素：陽(yáng)性者為紅色，陰性者為黃色。KCN：陽(yáng)性者細(xì)菌生長(zhǎng)，陰性者細(xì)菌不生長(zhǎng)。水楊苷和七葉苷：陽(yáng)性者產(chǎn)氣。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第74頁(yè)（三）結(jié)果匯報(bào)綜合生化試驗(yàn)結(jié)果判定菌型并作出匯報(bào)。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第75頁(yè)第四節(jié)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第76頁(yè)一、金黃色葡萄球菌生物學(xué)特征革蘭氏陽(yáng)性球菌，直徑為0.5-1.0微米，鏡檢時(shí)呈單個(gè)、成對(duì)、四聯(lián)或不規(guī)則簇群，如葡萄狀，故稱為葡萄球菌。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第77頁(yè)大多數(shù)菌株產(chǎn)生類胡羅卜素，使細(xì)胞團(tuán)展現(xiàn)出深橙色到淺黃色，色素產(chǎn)生取決于生長(zhǎng)條件，故稱金黃色葡萄球菌。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第78頁(yè)大多數(shù)菌株最適生長(zhǎng)溫度30-37℃，最適pH為7.0-7.5；兼性厭氧菌，在好氧條件下生長(zhǎng)最好；可在15%氯化鈉和40%膽汁中生長(zhǎng)。普通用含10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯增菌或7.5%氯化鈉肉湯增菌。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第79頁(yè)全部毒株產(chǎn)生血漿凝固酶，人和動(dòng)物起源菌株通?？赡掏谩⑷?、馬和豬血漿。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶和溶菌酶等，大多數(shù)菌株可水解天然動(dòng)物蛋白并釋放脂肪酸。在BP平板產(chǎn)生磷脂環(huán)。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第80頁(yè)生物學(xué)特征——致病性金黃色葡萄球菌為條件致病菌，菌株致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生毒素和侵襲性酶：a.溶血素：外毒素，能損傷血小板，破壞溶酶體，引發(fā)肌體局部缺血和壞死；在血平板培養(yǎng)出現(xiàn)溶血環(huán)。b.殺白細(xì)胞素：可破壞人白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；c.血漿凝固酶：當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入人體時(shí)，該酶使血液或血漿中纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，妨礙吞噬細(xì)胞吞噬作用。d.脫氧核糖核酸酶（DNA酶）

e.腸毒素：引發(fā)急性胃腸炎。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第81頁(yè)金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見(jiàn)病原菌，臨床表現(xiàn)各種多樣，可引發(fā)局部化膿感染，也可引發(fā)肺炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第82頁(yè)葡萄球菌皮膚感染第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第83頁(yè)葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌腸毒素所引發(fā)疾病，可引發(fā)不一樣程度急性胃腸炎癥狀，惡心、嘔吐最為突出而且普遍，腹痛、腹瀉次之。當(dāng)金黃色葡萄球菌污染了含淀粉及水分較多食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在溫度條件適宜時(shí)，經(jīng)8-10小時(shí)即可相當(dāng)數(shù)量腸毒素。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第84頁(yè)二、檢驗(yàn)程序與操作方法依據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)》GB4789.10-金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第85頁(yè)檢樣25g(ml)+225ml滅菌生理鹽水國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)程序直接計(jì)數(shù)方法增菌培養(yǎng)方法Baird-parker（貝爾德-帕克）0.3ml、0.3ml、0.4ml7．5％氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯血平板血平板，Baird-parker涂片染色觀察溶血血漿凝固酶試驗(yàn)報(bào)告36±1℃

24hr

36±1℃

24hr

36±1℃

24hr

食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第86頁(yè)檢驗(yàn)程序——增菌培養(yǎng)利用金黃色葡萄球菌耐鹽特征（可耐受15%氯化鈉），用含10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯或7.5%氯化鈉肉湯增菌。置37攝氏度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第87頁(yè)檢驗(yàn)程序——分離培養(yǎng)血平板：金黃色葡萄球菌能夠產(chǎn)生溶血素，所以在血平板上產(chǎn)生顯著溶血環(huán)。經(jīng)典菌落：呈金黃色，有時(shí)也為白色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，有溶血環(huán)。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第88頁(yè)大而突起，圓形，不透明，表面光滑，有溶血環(huán)第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第89頁(yè)血平板制作成份：豆粉瓊脂（或營(yíng)養(yǎng)瓊脂）100mL，脫纖維羊血（或兔血）5-10mL。制法：加熱融化瓊脂，冷至50℃，以無(wú)菌操作加入脫纖維羊血或兔血，搖勻，傾注平板?；蚍盅b滅菌試管，擺成斜面。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第90頁(yè)BP（貝爾德-帕克）平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、維生素和礦物元素丙酮酸鈉是一個(gè)生長(zhǎng)促進(jìn)劑亞碲酸鹽對(duì)除金黃色葡萄球外其它能分解卵黃菌株有毒性，并使菌落產(chǎn)生黑色卵黃提供營(yíng)養(yǎng)和有利于觀察卵磷脂環(huán)甘氨酸和氯化鋰對(duì)金黃色葡萄球菌以外其它菌株有抑制作用。檢驗(yàn)程序——分離培養(yǎng)第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第91頁(yè)在BP平板上經(jīng)典菌落為：灰色到黑玉色，圓形，光滑突起，濕潤(rùn)，直徑2-3mm，邊緣常為淡色（米黃色或灰色），周圍為一混濁帶，在其外緣常有一透明圈。用接種針接觸菌落似有黃油樹(shù)膠粘稠感。長(zhǎng)久保留冷凍或干燥食品中所分離菌落，其黑色常較經(jīng)典菌落淡些，且外觀可能粗燥，質(zhì)地較干燥。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第92頁(yè)B-P平板第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第93頁(yè)革蘭氏陽(yáng)性，球形，組成葡萄狀檢驗(yàn)程序——判定之革蘭氏染色鏡檢第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第94頁(yè)檢驗(yàn)程序——判定之凝固酶試驗(yàn)金黃色葡萄球菌能夠產(chǎn)生血漿凝固酶，所以對(duì)其判別主要試驗(yàn)是測(cè)定其凝固酶。方法一：試管法吸收1:4新鮮兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入培養(yǎng)24h金黃色葡萄球肉浸液肉湯培養(yǎng)物0.5mL，振蕩搖勻，放36±1℃恒溫箱或水浴內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如展現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時(shí)，展現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第95頁(yè)試管法第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第96頁(yè)陽(yáng)性反應(yīng)陰性反應(yīng)不凝固少許、零碎凝固顯著塊狀凝固巨大塊凝固完全凝固，倒置不流動(dòng)第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第97頁(yè)有凝塊血漿均勻混濁生理鹽水方法二：玻片法

在一張潔凈玻片中央加1滴生理鹽水，用接種環(huán)取待檢培養(yǎng)物與其混合（設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照）制成菌懸液，若經(jīng)10~20s內(nèi)無(wú)自凝現(xiàn)象發(fā)生，則加入人或兔新鮮血漿1環(huán)（不用稀釋），與菌懸液混合，觀察結(jié)果。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第98頁(yè)

兔血漿制備成份：檸檬酸鈉0.106mol/L（31.3gNa3C6H5O7·2H2O溶于1L蒸餾水中）制法：一份加兔血9份混合后離心rpm，10min吸收上清液即為兔血漿。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第99頁(yè)葡萄糖肉浸液肉湯制備成份：絞碎牛肉500g，氯化鈉5g，蛋白胨10g，磷酸氫二鉀2g，葡萄糖10g，蒸餾水1000mL，pH7.4～7.6。制法：將絞碎之去筋膜無(wú)油脂牛肉500g，與蒸餾水混合后放冰箱24h，除去液面之浮油，隔水煮沸半小時(shí)，使肉渣完全凝結(jié)成塊，用絨布過(guò)濾，并擠壓搜集全部濾液，加水補(bǔ)足原量。加入蛋白胨、葡萄糖，氯化鈉和磷酸鹽，溶解后校正pH，煮沸并過(guò)濾、分裝，121℃30min高壓滅菌。第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第100頁(yè)25g樣品+225ml生理鹽水

5mL樣品勻液（1:10）+50mL胰酪胨大豆肉湯血平板36±1℃

24hr

鏡檢與肉浸液肉湯培養(yǎng)血漿凝固酶試驗(yàn)

匯報(bào)結(jié)果

定性檢測(cè)36±1℃

24hr

36±1℃

24hr

36±1℃6hr

BP平板第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第101頁(yè)25g樣品+225ml生理鹽水

選三個(gè)連續(xù)梯度，每個(gè)梯度分別取1mL接種之至表面干燥BP平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）平板計(jì)數(shù)（分別統(tǒng)計(jì)每種類型菌落數(shù)）36±1℃

48hr

血平板、鏡檢與肉浸液肉湯培養(yǎng)血漿凝固酶試驗(yàn)匯報(bào)結(jié)果金葡菌數(shù)/g(mL)定量檢測(cè)（平板法）每種類型選取一個(gè)菌落

36±1℃

24hr

36±1℃

6hr

適合用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌數(shù)大于10/g（mL）食品計(jì)算方法：（三個(gè)平板中疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數(shù)相加）×血漿凝固酶陽(yáng)性數(shù)÷5×稀釋倍數(shù)梯度稀釋

第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第102頁(yè)第一天器材準(zhǔn)備、樣品處理、增菌培養(yǎng)和BP平板分離接種早晨：準(zhǔn)備器材第一天下午規(guī)格名稱數(shù)量1、樣品處理：魚(yú)干、臘肉2、增菌培養(yǎng)3、BP平板制備及分離接種4、采集兔血準(zhǔn)備：抗凝劑制備、滅過(guò)菌容器和玻璃珠250ml三角瓶1個(gè)10×100mm試管6支1ml移液管2支10ml移液管2支直徑為90mm平皿8套250ml量筒1支第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第103頁(yè)第二天接種選擇性平板進(jìn)行分離培養(yǎng)和玻片法血漿凝固酶試驗(yàn)1、血平板制備及兔血漿制備2、接種選擇性平板取增菌液1環(huán)，劃線接種于血平板或B－P平板。3、培養(yǎng)放于36±1℃培養(yǎng)24h。4、玻片法血漿凝固酶試驗(yàn)第三天觀察分離結(jié)果、鏡檢和葡萄糖肉浸液肉湯制備及接種第四天血漿凝固酶試驗(yàn)（試管法）、試驗(yàn)匯報(bào)第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第104頁(yè)第五節(jié)單核增生李斯特菌檢驗(yàn)第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第105頁(yè)李斯特氏菌屬李斯特氏菌屬（Listeria）普遍存在于環(huán)境中，最新分類學(xué)研究表明，其分為六個(gè)種：?jiǎn)魏嗽錾钏固厥暇↙isteriamonocytogenes）伊氏李斯特氏菌（Listeriaivanovii）無(wú)害李斯特氏菌（Listeriainnocua）斯氏李斯特氏菌（Listeriaseeligeri）威氏李斯特氏菌（Listeriawelshimeri）格氏李斯特氏菌（Listeriagrayi）

在李斯特氏菌屬六個(gè)種中，只有兩種致病菌：?jiǎn)魏嗽錾钏固厥暇鸵潦侠钏固厥暇軌蛞l(fā)老鼠和其它動(dòng)物發(fā)病。不過(guò)，其中通常只有單核增生李斯特氏菌和人類李斯特氏菌癥（listeriosis）相關(guān)。所以，李斯特氏菌中最有檢測(cè)意義是單核增生李斯特氏菌。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第106頁(yè)生物學(xué)特征

---菌體形態(tài)及染色特征革蘭氏陽(yáng)性；小、類似球形桿菌，0.4~0.5×0.5~2μm，在有些培養(yǎng)基中稍彎，兩端鈍圓，單個(gè)、成短鏈、細(xì)胞彼此連成V形，或成群細(xì)胞沿長(zhǎng)軸方向平行排列，在較老或生長(zhǎng)不良培養(yǎng)物中，可能形成絲狀；20-25℃以4根周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，在37℃只有較少鞭毛或1根鞭毛；無(wú)芽孢、無(wú)莢膜。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第107頁(yè)第五章食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與分析技術(shù)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第108頁(yè)生物學(xué)特征

---培養(yǎng)特征兼性厭氧；在20--25℃培養(yǎng)有動(dòng)力，穿刺培養(yǎng)2-5天可見(jiàn)倒立傘狀生長(zhǎng)，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見(jiàn)翻跟斗運(yùn)動(dòng)。生長(zhǎng)溫度范圍為2-42℃（也有報(bào)道在0℃能遲緩生長(zhǎng)），最適培養(yǎng)溫度為35--37℃。pH范圍pH4.4-pH9.6。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第109頁(yè)生物學(xué)特征

---培養(yǎng)特征在固體培養(yǎng)基上，菌落初始很小，透明，邊緣整齊，呈露滴狀，但伴隨菌落增大，變得不透明。在5-7%血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養(yǎng)后可產(chǎn)生窄小β-溶血環(huán)。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂(TSAYE)瓊脂上，用45°角入射光照射菌落，經(jīng)過(guò)解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第110頁(yè)生物學(xué)特征

---生化反應(yīng)觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性。能發(fā)酵各種糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，如發(fā)酵葡萄糖、乳糖、水楊素、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷、蔗糖（遲發(fā)酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不發(fā)酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側(cè)金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖。不利用枸櫞酸鹽，40%膽汁不溶解，吲哚、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸均陰性，VP、甲基紅試驗(yàn)和精氨酸水解陽(yáng)性。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第111頁(yè)生物學(xué)特征

---血清型依據(jù)菌體（O）抗原和鞭毛(H)抗原，將單增李氏菌分成13個(gè)血清型，分別是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7”。致病菌株血清型普通為1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后兩型尤多。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第112頁(yè)生物學(xué)特征

---抵抗力該菌對(duì)理化原因抵抗力較強(qiáng)，在土壤、糞便、青儲(chǔ)飼料和食品中能長(zhǎng)久存活；對(duì)堿和鹽抵抗力強(qiáng)，60-70℃經(jīng)5-20min可殺死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氫氧化鈉、2.5%福爾馬林20min可殺死此菌；濕熱滅菌（121℃，最少15min）和干熱滅菌（160-170℃，最少1hr）可殺滅該菌，對(duì)紫外線和γ射線敏感；該菌對(duì)青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素（已產(chǎn)生抗性）、氨基糖苷類、氯霉素均敏感。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第113頁(yè)流行病學(xué)

分布：廣泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、廢水、青儲(chǔ)飼料、動(dòng)植物及其食品中都有該菌存在，所以動(dòng)物很輕易食入該菌，并經(jīng)過(guò)口腔-糞便路徑進(jìn)行傳輸寄主范圍：哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、魚(yú)類、甲殼類和昆蟲(chóng)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第114頁(yè)流行病學(xué)

據(jù)報(bào)道，有1-10%人類腸道中存在單核增生李斯特氏菌，4-8%水產(chǎn)品、5-10%奶及其產(chǎn)品、30%以上肉制品及15%以上家禽均被該菌污染。相關(guān)食品：鮮奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤其是軟奶酪）、冰激凌、生蔬菜、發(fā)酵過(guò)生肉制作香腸、生和加工過(guò)禽肉、各種生肉類、生和煙熏魚(yú)肉。約有85-90%病例是由被污染食品引發(fā)。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第115頁(yè)1996年至1999年，因單核增生李斯特氏菌回收食品種類（起源：USDA及FDA匯報(bào)）食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第116頁(yè)致病性及其治療該病臨床表現(xiàn)，健康成人個(gè)體出現(xiàn)輕微類似流感癥狀，新生兒、孕婦、免疫缺點(diǎn)患者表現(xiàn)為呼吸急促、嘔吐、出血性皮疹、化膿性結(jié)膜炎、發(fā)燒、抽搐、昏迷、自然流產(chǎn)或死嬰、腦膜炎、敗血癥直至死亡。由該菌造成腦膜炎致死率可高達(dá)70%，敗血癥死亡率達(dá)50%，圍產(chǎn)期或新生兒感染死亡率超出80%，懷孕期婦女感染，母親通常能存活下來(lái)。抗生素治療，用青霉素或氨芐青霉素注射給藥，或與氨基糖苷類抗生素一起用藥。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第117頁(yè)感染人群感染劑量未知，但與該菌毒力和易感人群年紀(jì)、免疫狀態(tài)相關(guān)。易感者：孕婦/胎兒—圍產(chǎn)期和新生兒感染；接收皮質(zhì)激素、抗癌劑治療、器官移植治療、艾滋病患者等免疫缺損者；癌癥病人—尤其是白血病患者；不太常見(jiàn)報(bào)道—糖尿病、肝硬化、哮喘和潰瘍性結(jié)腸炎患者；年紀(jì)較大人；沒(méi)有免疫缺點(diǎn)健康人，食用污染該菌尤其是大量污染該菌食品后，也有患病危險(xiǎn)。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第118頁(yè)致病機(jī)理單增李氏菌抗原結(jié)構(gòu)與毒力無(wú)關(guān)，它致病性與毒力機(jī)理以下：1、寄生物介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)增生，使它附著及進(jìn)入腸細(xì)胞與巨噬細(xì)胞；2、抗活化巨噬細(xì)胞，單增李氏菌有細(xì)菌性過(guò)氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧物（為殺菌毒性游離基團(tuán)）分解；3、溶血素，即李氏桿菌素O，能夠從培養(yǎng)物上清液中取得，有α和β兩種，為毒力因子。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第119頁(yè)試驗(yàn)室危害不是一個(gè)普遍與試驗(yàn)室相關(guān)傳染病，當(dāng)前只有少數(shù)有報(bào)道案例發(fā)生；直接攝取是最普遍一個(gè)感染方式，除此之外，暴露在該菌高濃度氣溶膠中，也可經(jīng)過(guò)眼睛和破損皮膚、粘膜進(jìn)入體內(nèi)造成感染。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第120頁(yè)注意事項(xiàng)生物安全2級(jí)，操作時(shí)應(yīng)有對(duì)應(yīng)防污染設(shè)施，在進(jìn)行可能產(chǎn)生氣溶膠操作時(shí)，應(yīng)在生物安全柜內(nèi)完成；在直接接觸有感染性材料時(shí)，必須穿著試驗(yàn)服，戴手套和護(hù)目鏡；懷孕婦女應(yīng)防止接觸傳染物。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第121頁(yè)操作要求濺灑：使氣溶膠沉降，穿著防護(hù)服裝，用紙巾輕輕覆蓋濺灑處，加入1%次氯酸鈉溶液，由周圍向中心加，在清理之前要留充分接觸時(shí)間（30min）；廢棄：在廢棄前應(yīng)先采取凈化辦法，高壓蒸汽滅菌、化學(xué)消毒、焚燒等；儲(chǔ)存：在有適當(dāng)標(biāo)識(shí)密封容器內(nèi)儲(chǔ)存。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第122頁(yè)檢測(cè)程序

---增菌當(dāng)前慣用單核增生李斯特氏菌檢測(cè)增菌肉湯主要有半量Fraser肉湯、Fraser肉湯（FB）、UVM（ModifiedUniversityofVermontbroth，也叫UVM1）、LEB（Listeriaenrichmentbroth）和BLEB（bufferedListeriaenrichmentbroth）食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第123頁(yè)半量Fraser肉湯和Fraser肉湯含有選擇性和區(qū)分性。加入檸檬酸鐵銨和七葉靈，起到區(qū)分作用。李斯特氏菌能夠水解七葉靈，與培養(yǎng)基中鐵離子反應(yīng)，使培養(yǎng)基變黑，可直觀從培養(yǎng)液顏色就能夠判斷是否有單核李斯特氏菌生長(zhǎng)。氯化鋰、吖啶黃和萘啶酮酸作為選擇性因子。半量Fraser肉湯與Fraser肉湯所用添加劑一樣半量Fraser肉湯：萘啶酮酸10mg/L，吖啶黃12.5mg/LFraser肉湯：萘啶酮酸20mg/L，吖啶黃25mg/L食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第124頁(yè)UVMUVM只有選擇性沒(méi)有區(qū)分性加入萘啶酮酸和鹽酸吖啶黃，作為選擇性因子。即使其中含有七葉靈，不過(guò)沒(méi)有添加檸檬酸鐵銨，不能發(fā)生黑色顏色反應(yīng)。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第125頁(yè)LEB和BLEB只有選擇性沒(méi)有區(qū)分性LEB是在TSB-YE基礎(chǔ)上加入鹽酸吖啶黃、萘啶酮酸和放線菌酮等選擇性因子；加入丙酮酸鈉，有利于受損細(xì)胞恢復(fù)；不含七葉靈和檸檬酸鐵銨，無(wú)顏色反應(yīng)BLEB是在LEB基礎(chǔ)上加入緩沖體系：磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第126頁(yè)檢測(cè)程序

---分離分離培養(yǎng)基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX等，但首選依然是OXA。分離原理主要是基于李斯特氏菌含有β－D－葡萄糖苷酶活性，能水解培養(yǎng)基中七葉靈，產(chǎn)生七葉苷，與鐵離子產(chǎn)生顏色反應(yīng)而，使菌落為棕褐色，并帶有褐色暈圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能發(fā)生這種反應(yīng)還有一些選擇性顯色培養(yǎng)基，如BCM、ALOA、CHROMagarlisteria、Rapid’L.mono等，其原理主要是檢測(cè)由毒力基因編碼溶血素，而此種溶血素只存在于單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中，因而能夠很好將此兩種菌同李斯特屬其它種分開(kāi)。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第127頁(yè)OXA平板單核增生李斯特氏菌ATCC1911748h，35℃培養(yǎng)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第128頁(yè)OXA平板無(wú)害李斯特氏菌ATCC3309048h，35℃培養(yǎng)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第129頁(yè)檢測(cè)程序

---判定藍(lán)色菌落檢驗(yàn)（Henryillumination）經(jīng)典運(yùn)動(dòng)：相差顯微鏡，輕微旋轉(zhuǎn)或翻跟頭動(dòng)力試驗(yàn)：7天，傘形生長(zhǎng)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)：陽(yáng)性革蘭氏染色：陽(yáng)性短桿菌溶血試驗(yàn)：穿刺接種血平板硝酸鹽還原試驗(yàn)：5天，陰性糖發(fā)酵試驗(yàn)：葡萄糖、麥芽糖和七葉靈，李斯特菌屬反應(yīng)均為陽(yáng)性，除格氏李斯特甘露醇陰性，李斯特其它種甘露醇陰性，木糖和鼠李糖最有檢測(cè)意義食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第130頁(yè)動(dòng)力試驗(yàn)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第131頁(yè)血平板單核增生李斯特氏菌ATCC1911736h，35℃培養(yǎng)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第132頁(yè)血平板無(wú)害李斯特氏菌ATCC3309036h，35℃培養(yǎng)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第133頁(yè)

血平板伊氏李斯特氏菌ATCC1911924h，35℃培養(yǎng)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第134頁(yè)單核增生李斯特氏菌檢測(cè)流程25g樣品+225mlBLEB基礎(chǔ)（加入丙酮酸鈉）

加入萘啶酮酸、鹽酸吖錠黃、放線菌酮

30℃4hr劃線接種OXA平板30℃

24hr和48hr

科瑪嘉李氏菌顯色培養(yǎng)基TSA-YE分純

35℃

24hr-48hr

35℃

24hr過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、革蘭氏染色、溶血試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)（木糖、鼠李糖）APIListeria35℃

24-48hr匯報(bào)結(jié)果35℃18-24hr食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第135頁(yè)方法名稱一次增菌二次增菌分離判定快速方法SN0184-1993加工MBP30℃，18-24hEB30℃，24/48hMMA/OXA（35℃，24-48h）藍(lán)色菌落；經(jīng)典運(yùn)動(dòng)；過(guò)氧化氫酶；革蘭氏染色；溶血試驗(yàn)；尿素酶試驗(yàn)；硝酸鹽還原；MR-VP；三糖鐵；糖發(fā)酵；動(dòng)力試驗(yàn)；協(xié)同溶血*；血清學(xué)檢驗(yàn)*；小鼠毒力試驗(yàn)*無(wú)未加工EB（30℃，24/48h）GB/T4789.30-EB（30±1℃，48h）MMA（30±1℃，24-48h）藍(lán)色菌落；三糖鐵；動(dòng)力試驗(yàn)；染色鏡檢（革蘭氏染色、經(jīng)典運(yùn)動(dòng)）；生化特征（溶血反應(yīng)、硝酸鹽還原、尿素酶、MR-VP、糖發(fā)酵）；小鼠毒力試驗(yàn)；協(xié)同溶血無(wú)LB1（30±1℃，24h）LB2（30±1℃，24h）FDABLEB+Phy（30℃，4h）BLEB+Phy+三種抑菌劑（30℃，20/44h）OXA/PALOM/MOX/LPM+七葉靈+Fe3+推薦BCM/ALOA/RapidL'mono/CHROMagarListeria藍(lán)色菌落*；經(jīng)典運(yùn)動(dòng)或動(dòng)力試驗(yàn)；過(guò)氧化氫酶；革蘭氏染色；溶血試驗(yàn)；硝酸鹽還原*；糖發(fā)酵；協(xié)同溶血；血清學(xué)檢驗(yàn)；小鼠毒力試驗(yàn)*篩選、判定都能夠使用快速方法USDAUVM（30±2℃，22±2h）FB（35±2℃，26-48±2h）MOX（35±2℃，26-48±2h）初步判定：純菌菌落形態(tài)；經(jīng)典運(yùn)動(dòng)；生化判定：MICRO-ID?Listeria或Api?Listeria或BAM等方法中傳統(tǒng)生化反應(yīng)；協(xié)同溶血遺傳判定：核糖體RNA檢測(cè)；PFGE*篩選取快速方法必須經(jīng)過(guò)確認(rèn)后才可使用判定中用到MICRO-ID?、Api?、GenProbeAccuProbe?、GENE-TRAK?各官方方法比較食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第136頁(yè)各官方方法比較方法名稱一次增菌二次增菌分離判定快速方法CFIAMFHPB-30LEB（UVM）（30℃，24/48h）MFB（35℃，24-48h）OXA+LPM或MOX或PALCOM經(jīng)典運(yùn)動(dòng)或動(dòng)力試驗(yàn)；溶血試驗(yàn)；甘露醇；木糖；鼠李糖；快速判定試劑盒*；過(guò)氧化氫酶*；革蘭氏染色*；協(xié)同溶血*；血清學(xué)試驗(yàn)*作為判定可選步驟，允許使用快速方法，如Vitek或API、MicroIDListeria、ListeraAccuprobe?ISO11290-1:1996（E）半量Fraser肉湯（30℃，24±2h）Fraser肉湯（35或37℃，48±2h）OXA和PALCOM（30、35或37℃，24-48h，）PALCOM平板微需氧或好氧條件培養(yǎng)藍(lán)色菌落*；過(guò)氧化氫酶；革蘭氏染色；動(dòng)力試驗(yàn)或經(jīng)典運(yùn)動(dòng)*；溶血試驗(yàn)；糖發(fā)酵試驗(yàn)；協(xié)同溶血；送參考試驗(yàn)室（血清或噬菌體分型）無(wú)NMKLNo.1362nd1999LBⅠ（30.0±1.0℃，24±3h）LBⅡ（30.0±1.0℃，24±3h）或Fraser肉湯（37.0±1.0℃，48±4h）OXA和PALCOM（37.0±1.0℃，24±3/48±4h，好氧或微需氧）溶血試驗(yàn)；過(guò)氧化氫酶；革蘭氏染色；經(jīng)典運(yùn)動(dòng)動(dòng)力試驗(yàn)；糖發(fā)酵試驗(yàn)；送參考試驗(yàn)室（血清、噬菌體、DNA或酶分型）允許使用經(jīng)過(guò)確認(rèn)商業(yè)化生產(chǎn)單核增生李斯特氏菌菌株判定試驗(yàn)，但沒(méi)列明詳細(xì)試劑盒名稱食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第137頁(yè)第七節(jié)食品中副溶血性弧菌檢驗(yàn)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第138頁(yè)一、概況

副溶血性弧菌（V。parahemolyticus）于1950年從日本一次暴發(fā)性食物中毒中分離發(fā)覺(jué)。該菌存在于近海海水、海底沉積物和魚(yú)類、貝殼等海產(chǎn)品中。依據(jù)菌體O抗原不一樣，現(xiàn)已經(jīng)有13個(gè)血清群。主要引發(fā)食物中毒，尤以日本、東南亞、美國(guó)及我國(guó)臺(tái)北地域多見(jiàn)，也是我國(guó)大陸沿海地域食物中毒中最常見(jiàn)一個(gè)病原菌。本菌廣泛存在于海水中，偶亦見(jiàn)淡水。在海水中能存活47日以上，淡水中生存1～2日。在37℃、pH7.7、含氯化鈉3～4%環(huán)境中生長(zhǎng)最好。本菌嗜鹽畏酸，在無(wú)鹽培養(yǎng)基上，不能生長(zhǎng)，3%～6%食鹽水繁殖快速，每8～9分鐘為1周期，低于0.5%或高于8%鹽水中停頓生長(zhǎng)。對(duì)酸敏感，在2%醋酸中或50%食醋中1分鐘即可死亡。不耐熱，56℃、5分鐘即可殺死，90℃、1分鐘滅活。對(duì)低溫及高濃度氯代鈉抵抗力甚強(qiáng)。

食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第139頁(yè)當(dāng)前已發(fā)覺(jué)本菌有12種菌分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型。從患者糞便分離出菌株屬于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，自致病食物分離菌株90%以上屬于Ⅳ、Ⅴ型。致病性菌株能溶解人及家兔紅細(xì)胞，稱為“神奈川”試驗(yàn)（kanagawatest）陽(yáng)性。其致病力與其溶血能力平行，這是由一個(gè)不耐熱溶血素（分子量4）所致。本菌能否產(chǎn)生腸毒素尚待證實(shí)。媒介食品副溶廣泛存在于海岸和海水中，海生動(dòng)植物常會(huì)受到污染而帶菌。海魚(yú)、蝦、蟹、蛤等海產(chǎn)品帶菌率極高；被海水污染食物、一些地域淡水產(chǎn)品如鯽魚(yú)、鯉魚(yú)等及被污染其它含鹽量較高食物如咸菜、咸肉、咸蛋亦可帶菌，也可因受到污染而引發(fā)中毒。帶用少許該菌食物，在適宜溫度下，經(jīng)3～4小時(shí)細(xì)菌可急劇增加至中毒數(shù)量。進(jìn)食肉類或蔬菜而致病者，多因食物容器或砧板污染所引發(fā)。臨床表現(xiàn)潛伏期多為10小時(shí)左右，普通8～40小時(shí)，主要癥狀有惡心、嘔吐、上腹部陣發(fā)性猛烈腹痛、頻繁腹瀉、洗肉水樣或帶粘液便，無(wú)里急后重，每日5～6次，體溫39℃。重癥病人可有脫水、血壓下降、意識(shí)不清等。病程2～4天，普通預(yù)后良好，無(wú)后遺癥，少數(shù)病人因休克、昏迷而死亡.食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第140頁(yè)二、生物學(xué)特征（一）形態(tài)與染色

1、革蘭氏陰性無(wú)芽胞多形態(tài)桿菌，單端鞭毛、兩端濃染。桿狀、棒狀、甚至球狀、絲狀等食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第141頁(yè)（二）培養(yǎng)特征：1、需氧或兼性厭氧：生長(zhǎng)最好2、在2～３%NaCL培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，無(wú)鹽或食鹽>10%不能生長(zhǎng)。3、最適溫度36℃，PH7.5—7.8（7.7）4、在專用選擇性平板上，菌落呈圓形凸起，混濁不透明，表面光滑，較濕潤(rùn)，邊緣不整齊。5、血平板：可見(jiàn)溶血環(huán)。

食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第142頁(yè)（三）生化特征

1、分解GLU產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖，蔗糖。2、H2S（－）、V-P（－）、靛基質(zhì)（－）、精氨酸（－）3、甲基紅（＋）、賴氨酸（＋）、溶血＋/-食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第143頁(yè)（四）抗原結(jié)構(gòu)：O抗原O1—O1313個(gè)群。H抗原：K抗原：K1—K7065個(gè)型缺：K2K14K17K35K62食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第144頁(yè)三、檢驗(yàn)操作關(guān)鍵點(diǎn)

采樣→樣品處理→增菌培養(yǎng)→分離培養(yǎng)→3.5%氯化鈉三糖鐵培養(yǎng)基→嗜鹽性試驗(yàn)→生化判定→動(dòng)物試驗(yàn)→結(jié)果匯報(bào)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第145頁(yè)1、采樣：患者糞便、嘔吐物、可凝食品。從海產(chǎn)品體表面，腸內(nèi)容物，鰓等取樣包裝物，炊具用具。快，不宜低溫保留。2、增菌培養(yǎng)：Nacl結(jié)晶紫增菌液，37℃8～16小時(shí)。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第146頁(yè)3、分離培養(yǎng)：Nacl蔗糖平板：圓形，半透明或不透明，無(wú)粘性，(綠)蘭色，直徑2—4mm

嗜鹽選擇性平板：直徑2.5mm，圓整或不齊，隆起混濁，無(wú)粘性，無(wú)色，濕潤(rùn)。4、3.5%Nacl-TSI培養(yǎng)37℃24小時(shí)5、鏡檢：應(yīng)為革蘭氏陰性，無(wú)芽胞多形態(tài)，兩端濃染。食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第147頁(yè)食品中微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和分析技術(shù)專家講座第148頁(yè)6、嗜鹽性試驗(yàn)：