核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座

什么是電泳？帶點(diǎn)顆粒在電場作用下，向著與其電性相反電極移動(dòng)，稱為電泳。生物大分子如蛋白質(zhì)，核酸，多糖等大多都有陽離子和陰離子基團(tuán)，稱為兩性離子在電場中，帶電顆粒向正極或負(fù)極遷移，遷移方向取決于它們帶點(diǎn)符號(hào)。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第1頁凝膠電泳有幾類？一·瓊脂凝膠電泳（分辨DNA范圍為0.2~50kb)二·聚丙烯酰胺凝膠電泳（分辨范圍為1~1000kb）三·脈沖電場凝膠電泳（分離到高達(dá)107bpDNA大分子）序言；核酸凝膠電泳是分子克隆技術(shù)之一，用于分離·判定和純化DNA或RNA片段。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第2頁核酸凝膠電泳基本原理

凝膠電泳原理比較簡單。當(dāng)一個(gè)帶電分子放在電場當(dāng)中時(shí)，它們就會(huì)以一定速度移向適當(dāng)電極。帶點(diǎn)分子在電場作用下移動(dòng)速度，稱之為電泳遷移率，它同電場強(qiáng)度和電泳分子本身攜帶靜電荷數(shù)成正比。也就是說，電場強(qiáng)度越大，電泳分子所攜帶靜電荷越多，其移動(dòng)速度也就越快，反之則慢。在哪電泳中，使用無反應(yīng)活性瓊脂糖與聚丙烯酰胺凝膠作支持介質(zhì)，從而將電泳分子對(duì)流運(yùn)動(dòng)降低到極低，使電泳分子移動(dòng)速度與其分子摩擦系數(shù)成反比。已知摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)黏度函數(shù)，所以依據(jù)分子大小不一樣、構(gòu)型或形狀差異，以及所帶凈電荷多寡，便能夠經(jīng)過電泳將核酸或蛋白質(zhì)分子混合物中各種成份彼此分離開來。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第3頁在生理?xiàng)l件下，核酸分子糖-磷酸骨架中磷酸基團(tuán)，是呈離子狀態(tài)。從這種意義上講，DNA和RNA多核苷酸鏈可稱為多聚陰離子。所以，當(dāng)核酸分子被放置在電場當(dāng)中時(shí)，它們就會(huì)向正極方向遷移。因?yàn)樘?磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上重復(fù)性質(zhì)，相當(dāng)數(shù)量雙鏈DNA幾乎含有等量凈電荷，所以它們能以一樣速度向正極方向遷移。在一定電場強(qiáng)度，DNA分子這種遷移速度，亦即電泳遷移率，取決于核實(shí)分子本身大小和結(jié)構(gòu)。分子質(zhì)量較小DNA分子比分子質(zhì)量較大DNA分子，含有較緊密構(gòu)型，所以其電泳遷移率也就比同等分子質(zhì)量渙散型開環(huán)DNA分子或線性分子要快些。這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離DNA片段基本原理。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第4頁常見電泳儀水平電泳儀垂直電泳儀核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第5頁脈沖電泳核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第6頁電泳梳子電泳槽核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第7頁電泳儀核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第8頁一·瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)一個(gè)電泳方法。對(duì)于分子量較大樣品，如大分子核酸、病毒等，普通可采取孔徑較大瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。瓊脂糖凝膠含有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子經(jīng)過時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到阻力大，所以在凝膠電泳中，帶電顆粒分離不但取決于凈電荷性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提升了分辨能力。凝膠分辨能力同凝膠類型和濃度相關(guān)。分辨DNA片段范圍0.2~50kb；而要分辨較小分子質(zhì)量DNA片段，則要用聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為1~1000bp。凝膠濃度高低影響凝膠介質(zhì)孔隙大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越強(qiáng)；反之，濃度越低，孔隙就增大，其分辨能力也就越弱。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第9頁DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。因?yàn)樘?磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量雙鏈DNA幾乎含有等量凈電荷，所以它們能以一樣速率向正極方向移動(dòng)。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第10頁瓊脂糖凝膠電泳操作操作步驟：配膠EB染色點(diǎn)樣

膠圖分析成像拍照電泳核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第11頁1、配膠按所要分離DNA分子大小，稱取適量瓊脂糖粉末，放入錐形瓶，加適量1×TAE電泳緩沖液；

然后置微波爐內(nèi)加熱搖勻至完全溶化成透明狀，適當(dāng)冷卻后倒入膠托；膠完全冷凝后放入電泳槽，電泳槽里緩沖液必須沒過膠面。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第12頁鋪膠核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第13頁凝膠凝固后取出梳子核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第14頁加緩沖液核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第15頁2、EB染色溴化乙錠是一個(gè)扁平分子，能夠嵌入核酸雙鏈配對(duì)堿基之間。在在紫外照射EB-DNA復(fù)合物時(shí)，出現(xiàn)不一樣效應(yīng)。注意：嚴(yán)格區(qū)分污染區(qū)和非污染區(qū)，不把污染區(qū)物品拿到非污染區(qū)碰過EB手套要及時(shí)丟棄！核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第16頁3、點(diǎn)樣依據(jù)樣品不一樣可分兩種點(diǎn)樣體系：A、樣品+6XloadingbufferB、樣品能夠直接點(diǎn)樣核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第17頁4、電泳點(diǎn)完樣后連接電源，設(shè)置好電源參數(shù)，開始電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)帶（藍(lán)色）移動(dòng)至一定長度即可停頓電泳。電壓要求：≤20V/CM膠，在樣品出孔用低壓（3V/CM，15min）,然后調(diào)回標(biāo)準(zhǔn)電壓，跑出條帶很好。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第18頁成像拍照核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第19頁膠圖分析核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第20頁注意事項(xiàng)核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第21頁一、配膠1.電子稱使用，要時(shí)刻注意保持電子稱準(zhǔn)確性，保持清潔，依據(jù)不一樣濃度膠稱取瓊脂糖。2.加TAE量要適當(dāng)，以防止配出來膠太薄造成膠孔太淺或濃度太低。3.倒膠前膠托一定要洗潔凈，并檫干。倒膠時(shí)要待膠冷到一定溫度搖勻盡可能不要產(chǎn)生氣泡。若膠液溫度太高膠托輕易變形。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第22頁二、EB染色1.碰到EB手套要及時(shí)丟棄。2.加量要適當(dāng)，加EB至終濃度0.5μg/ml3抹布要嚴(yán)格區(qū)分，不可交叉使用。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第23頁三、點(diǎn)樣電泳1.加樣時(shí)，槍頭要上緊，吸樣均一準(zhǔn)確，排液時(shí)吸頭不要有殘留。2.點(diǎn)完樣后及時(shí)蓋上膠墊，注意不要蓋反。3.點(diǎn)電泳前最好檢驗(yàn)待用膠是否合格，點(diǎn)電泳時(shí)要對(duì)準(zhǔn)膠孔，盡可能點(diǎn)完全部樣。4.點(diǎn)完樣勿忘marker,并擺正膠位，電泳儀正負(fù)極不要插反，電泳槽蓋子要蓋緊。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第24頁二·聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯(lián)劑N，N’一亞甲基雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在催化劑過硫酸銨(AP)，N，N，N’，N’四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交聯(lián)向成含有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)凝膠，并以此為支持物進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳可依據(jù)不一樣分子所帶電荷差異及分子大小不一樣所產(chǎn)生不一樣遷移率將DNA或蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶，假如分離純化樣品中只含有同一個(gè)DNA蛋白質(zhì)，樣品電泳后，就應(yīng)只分離出一條區(qū)帶。SDS是一個(gè)陰離子表面活性劑能打斷蛋白質(zhì)氫鍵和疏水鍵，并按一定百分比和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出其本身原有電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然電荷差異。所以，各種蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物在電泳時(shí)遷移率，不再受原有電荷和分子形狀影響，只是棒長函數(shù)。這種電泳方法稱為SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱SDS—PAGE)。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第25頁聚丙烯酰胺凝膠電泳種類

1.變性聚丙烯酰胺凝膠（SDS）變性聚丙烯酰胺凝膠是分子生物學(xué)慣用技術(shù)之一，是依據(jù)寡核苷酸大小來分離，所以可將全長產(chǎn)物與不完整短分子分開。電泳時(shí)通常每一泳道最少加1mg合成寡核苷酸，電泳后在紫外燈下定位寡核苷酸條帶，將長度正確寡核苷酸從凝膠上切下。主要用于單鏈DNA片段分離或純化。

用途；放射性DNA探針分離，DNA測序等。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第26頁2.非變性聚丙烯酰胺凝膠（native）

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native)或稱為活性電泳是在不加入SDS和疏基乙醇等變性劑條件下，對(duì)保持活性蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，慣用于酶判定、同工酶分析和提純。使生物大分子在電泳過程中保持其天然形狀和電荷，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子生物活性，對(duì)于生物大分子判定有主要意義，用于雙鏈DNA片段分離于純化。

用途；制備高純度DNA片段。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第27頁操作步驟制板制濃縮膠電泳槽安裝加樣制分離膠染色電泳固定剝膠脫色觀察結(jié)果核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第28頁1.制膠1）在聚合分離膠上直接灌注濃縮膠，并馬上在濃縮膠溶液中插入潔凈梳子。小心防止混入氣泡，再加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。2）濃縮膠聚合完成后（30分鐘）小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸電極緩沖液。2.樣品制備取樣品加入0.5ml2×SDS凝膠加樣緩沖液混勻。3.加樣及電泳用吸嘴吸收50μl，從加樣孔底部遲緩加樣。注意：加樣時(shí)不得插傷凝膠孔面，不得產(chǎn)生氣泡、樣品不得溢出加樣孔。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第29頁4.接電源與電泳上槽接負(fù)極，下槽接正極。調(diào)整電壓至80V電泳至樣品前沿剛好進(jìn)入分離膠后，把電壓提升到120V（凝膠上所加電壓為8V/cm），繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)抵達(dá)分離膠底部上方約1cm（約2—3小時(shí)），然后關(guān)閉電源，取出插頭。5.剝膠從電泳裝置上卸下玻璃，用水果刀撬開玻璃板。并用刀在緊靠最左邊一孔凝膠下部切去一角以標(biāo)注凝膠方位。6.染色與脫色用考馬氏亮藍(lán)染色液對(duì)SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行室溫染色1~2小時(shí)后，用脫色液在脫色搖床上與脫色3~4次，每次20~30分鐘。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第30頁注意事項(xiàng)1.丙烯酰胺和雙丙烯酰胺含有很強(qiáng)神經(jīng)毒性并輕易吸附于皮膚，操作時(shí)應(yīng)防止沾在臉、手等皮膚上。最好戴一次性手套進(jìn)行操作。2.過硫酸銨主要作用是提供自由基引發(fā)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合反應(yīng)，故一定要新鮮，貯存過久過硫酸銨商品不能使用。另外，10％過硫酸銨必須現(xiàn)配現(xiàn)用。3.灌制凝膠時(shí)，應(yīng)防止產(chǎn)生氣泡，因?yàn)闅馀輹?huì)影響電泳分離效果。4.剛灌制注分離膠混合溶液后，應(yīng)在分離膠液面上加1~2cm高得水層，以阻隔空氣。膠液面上加水層時(shí)要尤其小心，緩緩疊加，以免沖壞凝膠膠面。5.聚丙烯酰胺凝膠電泳耗時(shí)長，電泳過程中產(chǎn)熱多，尤其是夏天產(chǎn)熱更多。顧電泳過程中應(yīng)安裝循環(huán)冷卻水以帶走熱量，或在4冰箱中電泳?！婧怂崮z電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第31頁核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第32頁非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳變性聚丙烯酰胺凝膠電泳核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第33頁三·脈沖電場凝膠電泳（PFGE）在脈沖電場中，DNA分子遷移方向伴隨電場方向周期性改變而不停改變。在標(biāo)準(zhǔn)PFGE中，第一個(gè)脈沖電場方向在另一側(cè)成45°夾角。由于瓊脂糖凝膠電場方向、電流大小及作用時(shí)間都在交替改變，使得DNA分子能夠隨時(shí)調(diào)整其游動(dòng)方向，以適應(yīng)凝膠孔隙無規(guī)則改變。與相對(duì)分子質(zhì)量較小DNA相比，相對(duì)分子質(zhì)量較大DNA需要更多脈沖次數(shù)來更換其構(gòu)型和方位，使其按新方向游動(dòng)。應(yīng)用脈沖電場凝膠電泳技術(shù)，可成功分離到高達(dá)107bpDNA大分子。

核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第34頁倒轉(zhuǎn)電場系統(tǒng)垂直交變電場箝位勻強(qiáng)電場系統(tǒng)反轉(zhuǎn)電場系統(tǒng)脈沖電場凝膠電泳類型核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第35頁脈沖電泳操作步驟DNA樣品制備限制酶消化脈沖分離、純化大DNA片段EB染色，拍照紫外遞質(zhì)監(jiān)測DNA搜集目標(biāo)DNA核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第36頁1.脈沖電泳凝膠電泳DNA樣品制備（以金黃色葡萄球菌為例）（1）取100ml對(duì)數(shù)生長久金黃色葡萄球菌細(xì)胞于4℃，5000g離心5分鐘（2）用20mlTEN緩沖液沖洗沉淀，一樣條件離心5分鐘。在用10mlEC緩沖液使細(xì)胞懸浮。（3）取1.5ml細(xì)胞樣品與相同體積含2%SeaPLaque瓊脂糖EC緩沖液快速混合均勻并等分流溶液至封閉模塊中于4℃凝固，混合前加熱至瓊脂糖熔解并冷卻至50℃。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第37頁（4）對(duì)于每一個(gè)菌株，需要15-20個(gè)凝膠塊，將它們放至含有30-45ug/mlRNase10mlEC緩沖液中，于37℃振蕩過夜。（5）去掉裂解緩沖液，換為10mlESP緩沖液于50℃輕度搖溫育48h。（6）將凝膠塊放在10ml含有174ug/ml苯甲基磺酰氟（PMSF）TE緩沖液中，室溫溫育4h,以滅活ESP中蛋白酶K。（7）用TE清洗瓊脂塊6h，至于TE中4℃保留。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第38頁2.限制酶消化（1）25ul10x反應(yīng)緩沖液，30U限制酶，加雙蒸餾水至250ul混勻。（2）取一個(gè)凝膠塊置其中，適當(dāng)溫度下過夜后，用TE緩沖液洗滌并貯存。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第39頁3.應(yīng)用PFGE對(duì)樣品DNA進(jìn)行分析（1）用0.5xTBE緩沖液制備一個(gè)0.8%SeakemHGT瓊脂糖凝膠，膠厚度盡可能與樣品凝膠塊相符。若用WideMini-SubCell進(jìn)行電泳話，50ml該溶液即可。（2）凝膠后，小心移去樣品梳。將凝膠塊用小刀切成與樣孔一致大小，將樣心插入加樣孔，防止產(chǎn)生氣泡。（3）把膠放入電泳槽內(nèi)，加緩沖液，剛好覆蓋膠表面即可，緩沖液事先14℃冷卻。

核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第40頁（4)將電泳槽和一個(gè)連著穩(wěn)壓電源程序性開關(guān)設(shè)備相連。打開電源，調(diào)整蠕動(dòng)泵到適當(dāng)流速(5～10mL/rain)或打開變速泵至40。

（5)經(jīng)過計(jì)算機(jī)開啟極性轉(zhuǎn)換程序。大于50kb限制性片段在1.2s和0.4s正向和反向電脈沖下得以分離，時(shí)間普通為3.5h或更長。小于50kb

限制性片段在0.4s正向和0.2s反向電脈沖(比率為2:1)下得以分離，時(shí)間為3～5h。

（6)在0.5μg/mL溴化乙錠中進(jìn)行染色并拍照。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第41頁4.分離、純化大DNA片段

（1)凝膠染色、分析后，在目標(biāo)帶前(靠近正極處)切一個(gè)0.25cm2左右槽，注入0.8%Seaplaque瓊脂糖，使之凝固。

（2)重新打開極性轉(zhuǎn)換開關(guān)，用紫外遞質(zhì)檢測DNA遷移，當(dāng)目標(biāo)帶進(jìn)入Seaplaque凝膠中時(shí)，關(guān)閉開關(guān)，切下目標(biāo)帶，移至1.5mLEP管中。

（3)加入2μLtRNA，30μL5mol/LNACl，370μL

蒸餾水，在65～70℃之間，化膠并保溫10min。

（4)苯酚/氯仿500μL抽提兩次。

（5)用2.5倍體積95%乙醇和1/10體積NaAc3mol/L，pH5.2)于-70℃10min沉淀水相。再用70%乙醇洗兩次并將沉淀溶于TE

緩沖液中。核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第42頁脈沖電場凝膠電泳圖核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第43頁注意事項(xiàng)1.換緩沖掖時(shí)盡可能小心不要碰壞瓊脂凝膠。

2.PMSF是一個(gè)強(qiáng)烈蛋白酶共價(jià)抑制劑，即有毒又揮發(fā)，操作時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。

3.用蛋白酶K包埋材料時(shí)50℃溫育時(shí)間很長(24～48h)，有些學(xué)者提出如此長時(shí)間無須要(Mortimeret

al.1990)，且可能造成高分子質(zhì)量DNA降解。在試驗(yàn)中可視情況而定。

4.瓊脂糖凝膠塊在TE(pH7.6)中4℃可存放多年，如在0.5mol/LEDTA中可存放更長時(shí)間。

核酸凝膠電泳終專業(yè)知識(shí)專家講座第44頁5.一些高壓電源并不適合脈沖電場凝膠電泳，因?yàn)檫@些電源