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文檔簡介

蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用第一節(jié)抗體工程抗體(antibody)是抗原刺激人或動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)后,由B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞產(chǎn)生的、能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白??贵w可與細(xì)菌、病毒或毒素等抗原結(jié)合,并通過特定的方式清除異物。第一節(jié)抗體工程抗體工程(antibodyengineering)是通過對抗體分子結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究,有計(jì)劃地對抗體蛋白序列進(jìn)行改造,改善抗體某些功能的技術(shù)??贵w的分類多克隆抗體:傳統(tǒng)的抗體制備的方法是將天然抗原經(jīng)過各種途徑免疫動(dòng)物,因?yàn)榭乖晕镔|(zhì)具有多種抗原決定簇,所以刺激機(jī)體產(chǎn)生了多種B細(xì)胞克隆針對不同抗原決定簇產(chǎn)生的混合抗體,并合成和分泌各抗體到血清和體液中,這種用體內(nèi)免疫法所獲得的免疫血清。單克隆抗體當(dāng)抗原進(jìn)入體內(nèi),在機(jī)體中就會誘導(dǎo)出針對不同抗原決定簇的多種抗體,如果要把這些抗體一一分開,用現(xiàn)有的生物化學(xué)或物理化學(xué)方法是根本辦不到的。1975年科勒和米爾斯坦將小鼠免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合,培養(yǎng)出既能迅速生長繁殖又可分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。從而獲得針對某一特殊抗原決定簇的單克隆抗體。6南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院抗體的分類單克隆抗體:同一克隆的細(xì)胞可合成和分泌在理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、遺傳標(biāo)記及生物學(xué)特性等方面都完全相同的均一性抗體。

構(gòu)建嵌合抗體的大致過程是,將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來,連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達(dá)所需的其它元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等)的表達(dá)載體上,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞)中表達(dá)。構(gòu)建重組表達(dá)載體克隆鼠單抗的可變區(qū)基因,可從基因組文庫中分離,也可用PCR技術(shù)分離。人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇,不同的恒定區(qū)會帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用,可通過點(diǎn)突變來修飾調(diào)整其效應(yīng)。

人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比,免疫原性大大降低,利于在人體內(nèi)應(yīng)用,所以目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關(guān)抗原)的嵌合抗體。2鼠單抗可變區(qū)的人源化

盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多,但有時(shí)它仍可能引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。為了進(jìn)一步降低抗體的鼠源成分,發(fā)展出CDR移植技術(shù)。CDR即互補(bǔ)決定區(qū)。Ig超變區(qū)氨基酸殘基的種類和順序特別多變,這些部位與識別抗原直接相關(guān),為Ig分子的抗原結(jié)合部位,故稱為互補(bǔ)決定區(qū)。

CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi),所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體,也就是人源化抗體。

經(jīng)過CDR移植,抗體的免疫原性極低,而其抗原結(jié)合能力保持不變,結(jié)合半抗原及全抗原(如細(xì)胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報(bào)道,到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。(美國正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體)人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法。全合成法是以人抗體序列為骨架,以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR,將整個(gè)可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段,并使相鄰的片段具有彼此互補(bǔ)的粘性末端。合成所有DNA片段,每組片段分別退火,然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因,插入質(zhì)粒中,進(jìn)一步即可用于構(gòu)建和表達(dá)改形抗體。

定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆,根據(jù)鼠抗體的CDR序列合成幾種突變引物,用定點(diǎn)突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列,然后表達(dá)出改型抗體。

研究表明,在構(gòu)建改形抗體時(shí),簡單地進(jìn)行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力,因此在構(gòu)建時(shí)還必需包括對影響抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)的框架序列進(jìn)行操作。小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識別單位等幾種。小分子抗體有很多優(yōu)點(diǎn):

可以用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn),成本低;分子小,穿透力強(qiáng);不含F(xiàn)c,沒有Fc帶來的效應(yīng);在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短,易清除,利于解毒排出;易于與毒素或酶基因連接,便于直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等。

3小分子抗體FvScFv單區(qū)抗體最小識別單位Fab由完整的輕鏈和Fd組成,大小為完整分子的1/3。

把Fab與細(xì)菌的前導(dǎo)肽相連,在前導(dǎo)肽的作用下Fab進(jìn)入質(zhì)周腔,裝配折疊后,它具有結(jié)合抗原的活性。(1)Fab

Fv由VH與VL構(gòu)成,由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合,故Fv不穩(wěn)定。在VH與VL之間加上一段連接肽,把VH與VL連成一條單鏈,得到ScFv,即單鏈抗體。

連接肽的長度在10-15個(gè)氨基酸左右,不宜太長或太短,它應(yīng)具有柔軟性,側(cè)鏈少,抗原性弱等特點(diǎn)。常用的連接肽是(GGGGS)3。

單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時(shí)可用完全人工合成法;在具備親本單抗可變區(qū)的cDNA克隆時(shí),可用定點(diǎn)突變法在其兩端造成適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶位點(diǎn),與人工合成的連接肽編碼序列連接,組裝到表達(dá)載體中;如果從雜交瘤細(xì)胞系構(gòu)建單鏈抗體,可用PCR方法擴(kuò)增可變區(qū)基因,再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上。

單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌,有2種方式:一是表達(dá)為包涵或非包涵體的不溶蛋白。產(chǎn)量高,可達(dá)細(xì)菌蛋白總量的5%-20%,但需進(jìn)行變性復(fù)性,使其形成正確的立體結(jié)構(gòu),恢復(fù)抗體活性;二是分泌型表達(dá),將細(xì)菌的信號肽序列與單鏈抗體的氨基端相連,單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細(xì)菌體外,進(jìn)行折疊后成為有活性的分子。但產(chǎn)量不及前者,一般實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下每升細(xì)菌的產(chǎn)量僅在數(shù)毫克左右。約為完整分子的1/80-1/70大小,一般由一個(gè)CDR構(gòu)成,它也保持著抗體的特異性。(4)最小識別單位CDR4雙特異抗體和多價(jià)抗體

雙鏈抗體(Diabody)一詞最早由Hollinger等于1993年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價(jià)雙特異性抗體片段。

所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性識別腫瘤細(xì)胞外,還能將循環(huán)血液中的免疫效應(yīng)細(xì)胞再導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞處,從而使效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤活性增強(qiáng),發(fā)揮免疫導(dǎo)向作用,這是腫瘤治療的新突破。

抗體庫技術(shù)是用基因工程方法把人或其他動(dòng)物的全部抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因克隆出來,在原核載體上表達(dá),然后篩選出所需的特異基因和抗體。

PCR技術(shù);免疫球蛋白Fab片段在大腸桿菌中的成功表達(dá);噬菌體表面展示文庫技術(shù)。5抗體庫技術(shù)

初期的抗體庫技術(shù)是從淋巴細(xì)胞中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA或直接用總DNA為模板,用PCR技術(shù)建立輕、重鏈文庫,在大腸桿菌中表達(dá)后篩選。

它是在PCR技術(shù)和PhageDisplay的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的。其過程是把用PCR法得到的抗體基因插入絲狀噬菌體的DNA,與噬菌體外殼蛋白的基因相連,在輔助噬菌體的幫助下,噬菌粒包裝成絲狀噬菌體,抗體分子通過與PⅢ或PⅧ相連,在噬菌體表面的一端或分散分布,然后可直接對噬菌體表面的抗體分子進(jìn)行篩選。噬菌體抗體庫技術(shù)

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng),通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游,使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面,利用親和層析,兩輪富集達(dá)106倍。該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。噬菌體表面展示系統(tǒng)(phagesurfacedisplaysystem)

噬菌體表面展示文庫技術(shù)的要點(diǎn):外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因g3或g8的先導(dǎo)系列的緊靠下游隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中PCR擴(kuò)增抗體全套基因片段用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴(kuò)增”數(shù)個(gè)循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫。使翻譯出的抗體分泌到細(xì)菌的質(zhì)周腔內(nèi),形成游離的抗體片段,經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后,轉(zhuǎn)入大腸桿菌,該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):

將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來;可繞過雜交瘤技術(shù),不需要復(fù)雜的基因工程技術(shù);

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