微生物活菌計數(shù)方法專家講座

微生物計數(shù)方法種類直接計數(shù)法

核酸計數(shù)法活菌計數(shù)法（培養(yǎng)法）MPN（Most-Probable-Number）最大可能數(shù)法混菌法平板技術(shù)法微生物活菌計數(shù)方法專家講座第1頁直接計數(shù)法1.顯微鏡直接計數(shù)比濁法3.電子計數(shù)器計數(shù)法微生物活菌計數(shù)方法專家講座第2頁1.顯微鏡直接計數(shù)

顯微計數(shù)法適合用于各種含單細胞菌體純培養(yǎng)懸浮液血球計數(shù)板：菌體較大酵母菌或霉菌孢子細菌計數(shù)板：普通細菌用途：快速了解發(fā)酵液菌數(shù)。慣用于生產(chǎn)線上生產(chǎn)過程控制。缺點：不易區(qū)分顆粒、死菌體和雜菌，計數(shù)與真實菌數(shù)有很大差異。不能作為正規(guī)計數(shù)方法。微生物活菌計數(shù)方法專家講座第3頁2.比濁法依據(jù)菌懸液透光量間接地測定細菌數(shù)量。細菌懸浮液濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計測定菌液，用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度。依據(jù)濁度計算出細菌數(shù)量。該方法普通能夠預(yù)計出細菌數(shù)量級。

經(jīng)慣用于一些特殊微生物快速計數(shù)，如光合細菌和藻類測數(shù)。不過因為該方法僅能估測菌數(shù)，不能準確定量，而且因為一些顆粒和添加劑作用，不能正確反應(yīng)該樣品質(zhì)量，所以在質(zhì)檢過程中不予采取。微生物活菌計數(shù)方法專家講座第4頁3.電子計數(shù)器計數(shù)法工作原理是測定小孔中液體電阻改變，小孔僅能經(jīng)過一個細胞，當一個細胞經(jīng)過這個小孔時，電阻顯著增加，形成一個脈沖，自動統(tǒng)計在電子統(tǒng)計裝置上。

該法測定結(jié)果較準確，但它只識別顆粒大小，而不能區(qū)分是否為細菌。所以，要求菌懸液中不含任何碎片。不適于微生物肥料產(chǎn)品檢測。微生物活菌計數(shù)方法專家講座第5頁核酸計數(shù)法每一個生物都有一套自己獨有遺傳物質(zhì)，脫氧核糖核酸和核糖核酸，即DNA和RNA。伴隨核酸分析技術(shù)發(fā)展，已經(jīng)能夠利用遺傳物質(zhì)對生物進行定性和定量測定，而且更為靈敏、快速、專一性強。慣用方法：熒光定量PCR此法操作精細繁瑣，藥品昂貴，而且經(jīng)常受到死菌體干擾。暫時不能成為微生物肥料活菌計數(shù)慣用方法，微生物活菌計數(shù)方法專家講座第6頁活菌計數(shù)法（培養(yǎng)法）MPN（Most-Probable-Number）最大可能數(shù)法（主要用于光合細菌和（糞）大腸菌群測定）混菌法（適合用于兼性厭氧微生物測定）取1.0mL不一樣稀釋度菌懸液于滅菌平皿內(nèi)，將冷卻至50℃左右15~20mL培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)輕輕混勻，培養(yǎng)計數(shù)。（食品中乳酸菌總菌數(shù)測定）平板計數(shù)法（最慣用方法）微生物活菌計數(shù)方法專家講座第7頁平板計數(shù)法

使不可見微生物在人工培養(yǎng)基平板上生長成為可見菌落（CFU），從而可用肉眼進行觀察、計數(shù)。較其它方法直觀準確，是一個經(jīng)典檢測活菌數(shù)方法，也是當前國際上通用方法。制備一定體積菌懸液，作一系列倍數(shù)稀釋，然后將定量稀釋液進行平板培養(yǎng)，依據(jù)培養(yǎng)出菌落數(shù)，計算出樣品中活菌數(shù)。微生物活菌計數(shù)方法專家講座第8頁平板計數(shù)法示意圖微生物活菌計數(shù)方法專家講座第9頁微生物活菌計數(shù)方法專家講座第10頁

平板計數(shù)優(yōu)缺點優(yōu)點：直觀、準確、可靠該方法不但能夠檢測到樣品中有效活菌數(shù)，而且能夠檢測到產(chǎn)品微生物污染情況，即雜菌數(shù)。缺點：因為培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不足，所得結(jié)果普通低于實際值。微生物活菌計數(shù)方法專家講座第11頁平板計數(shù)法（一）檢測前準備（二）操作過程（母液制備、系列稀釋、加樣、涂布、培養(yǎng)、菌落識別、計數(shù)）（三）計算微生物活菌計數(shù)方法專家講座第12頁（一）檢測前準備依據(jù)菌種特征選擇方法天平，搖床，酒精燈，培養(yǎng)箱，染色液，顯微鏡，滅菌鍋，烘箱等無菌間或潔凈工作臺消毒吸管、刮刀、培養(yǎng)皿洗滌、包扎、滅菌制樣和稀釋用三角瓶水制備、滅菌培養(yǎng)基制備和平板制備微生物活菌計數(shù)方法專家講座第13頁培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基定義指人工方法配合而成，專供微生物培養(yǎng)、分離、判別、研究和保留用混合營養(yǎng)物制品。培養(yǎng)基選擇需要了解目標微生物基本特征，選擇正確培養(yǎng)基培養(yǎng)基制備程序按《微生物肥料試驗用培養(yǎng)基技術(shù)條件》要求執(zhí)行，NY/T1114-培養(yǎng)基標識清楚，培養(yǎng)基名稱，配制日期等。檢測前準備微生物活菌計數(shù)方法專家講座第14頁平板制備

滅好菌培養(yǎng)基冷卻至50℃左右（以不燙手為宜），在無菌狀態(tài)下傾注培養(yǎng)基。傾倒平板前應(yīng)將培養(yǎng)基搖勻，預(yù)防在瓶底有沉淀。不過搖動時要預(yù)防產(chǎn)生大量氣泡。通常條件下平板制備好后室溫放置或溫箱放置2~3天使用，目標：一能夠檢驗培養(yǎng)基是否滅菌徹底，是否在傾倒過程被微生物污染；二為了使平板表面干濕適宜，預(yù)防菌落因為平板上水滴運動而連片以致無法計數(shù)。檢測前準備微生物活菌計數(shù)方法專家講座第15頁（二）操作過程

2.1母液制備2.2系列稀釋、加樣和涂布2.3培養(yǎng)2.4識別和計數(shù)微生物活菌計數(shù)方法專家講座第16頁2.1母液（基礎(chǔ)液）制備樣品混合均勻：很主要固體樣品：稱取10g左右樣品加入到100mL無菌水（500mL三角瓶）中，靜置20min。液體樣品：量取10.0ml樣品加入到90mL無菌水（500mL三角瓶）中，靜置20min。分散菌體：將三角瓶置于搖床上200r/min振蕩30min，即成母液菌懸液。微生物活菌計數(shù)方法專家講座第17頁2.2樣品稀釋、加樣和涂布準備工作：應(yīng)將平板上做好標識，包含培養(yǎng)基種類，樣品編號，稀釋度/稀釋倍數(shù).將小瓶無菌水寫好樣品編號、稀釋度/稀釋倍數(shù)詳細過程見GB20287-農(nóng)用微生物菌劑微生物活菌計數(shù)方法專家講座第18頁2.2.1系列稀釋用無菌吸管分別吸收5.0mL上述母液菌懸液加至45mL無菌水（150mL三角瓶）中，按1:10(10倍)進行依次稀釋，分別得到10-1，10-2，10-3，10-4等濃度菌懸液（每個稀釋度應(yīng)更換無菌吸管）注：稀釋度：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5相當于稀釋倍數(shù)：101，102，103，104，105

微生物活菌計數(shù)方法專家講座第19頁2.2.2加樣和涂布每個樣品取3個連續(xù)適宜稀釋度，用0.5mL無菌吸管分別吸收不一樣稀釋度菌懸液0.1mL，加至預(yù)先制好固體培養(yǎng)基平板上，分別用無菌玻璃刮刀將不一樣稀釋度菌懸液均勻地涂于平板表面。每一稀釋度每種培養(yǎng)基做3個重復(fù)，同時以無菌水作空白對照。微生物活菌計數(shù)方法專家講座第20頁微生物活菌計數(shù)方法專家講座第21頁稀釋、加樣和涂布注意事項整個程序應(yīng)在無菌間或超凈臺內(nèi)進行，操作人員時刻有無菌概念適宜稀釋度：依據(jù)標準或企業(yè)提供信息選擇稀釋度。系列稀釋時不一樣稀釋度應(yīng)更換吸管（移液管），加樣和涂布不一樣稀釋度時也要更換吸管和刮刀。每個培養(yǎng)皿均要標明培養(yǎng)基種類、樣品編號、稀釋度稀釋和加樣要準確，涂布均勻及時，使用吸管量程要適宜。無菌水對照，以檢驗吸管、刮刀以及稀釋用水滅菌是否徹底、操作過程是否合乎無菌要求。微生物活菌計數(shù)方法專家講座第22頁2.3平板培養(yǎng)將涂布好平板放在適宜條件下培養(yǎng)如：溫度條件氣體條件培養(yǎng)時間平板倒置培養(yǎng)微生物活菌計數(shù)方法專家講座第23頁2.4菌落識別和計數(shù)經(jīng)過菌落識別、涂片染色、鏡檢觀察，確定有效菌。（必要時做生化試驗）選擇性培養(yǎng)基上長出菌落并非都是有效菌，培養(yǎng)基選擇性是相正確。一個有效菌只在一個特定培養(yǎng)基上計數(shù)，不一樣培養(yǎng)基上同一個有效菌不能累加。細菌雜菌（包含放線菌）在培養(yǎng)細菌培養(yǎng)基上計數(shù)；霉菌和真菌雜菌在真菌培養(yǎng)基上計數(shù)。但也不能重復(fù)計數(shù)。微生物活菌計數(shù)方法專家講座第24頁（三）計算3.1有效稀釋度選擇3.2標準差3.3計算公式及示例微生物活菌計數(shù)方法專家講座第25頁3.1有效稀釋度選擇參見標準GB20287-6.3.2.4示例：（表格）微生物活菌計數(shù)方法專家講座第26頁計數(shù)標準以出現(xiàn)20~300個細菌菌落數(shù)稀釋度平板為計數(shù)標準，絲狀真菌為10~150個菌落數(shù)。當只有一個稀釋度，其平均菌落數(shù)在20～300之間時，則以平均菌落數(shù)計算。若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在20～300之間時，應(yīng)按二者菌落總數(shù)之比值決定：若其比值小于等于2應(yīng)計算二者平均數(shù)；

若大于2則以稀釋倍數(shù)小菌落平均數(shù)計算。微生物活菌計數(shù)方法專家講座第27頁例次不一樣稀釋倍數(shù)菌落平均數(shù)兩個稀釋倍數(shù)度菌落數(shù)之比菌數(shù)億/g,mL1031041051無法數(shù)無法數(shù)253/25.32無法數(shù)31532/3.23313383/0.3842893221.10.305無法數(shù)136342.5/63250/0.03271530/0.015微生物活菌計數(shù)方法專家講座第28頁3.2標準差標準差(StandardDeviation)：各數(shù)據(jù)偏離平均數(shù)距離（離均差）平均數(shù)，它是離差平方和平均后方根。用δ表示。標準差表達隨機變量取值與其期望值偏差。標準NY411-固氮菌肥料7.2.6.2。微生物活菌計數(shù)方法專家講座第29頁平板上菌落數(shù)對應(yīng)標準差要求平板上菌落平均數(shù)，個/皿20-5051-99100-300標準差±10.0±20.0±50.0微生物活菌計數(shù)方法專家講座第30頁標準差分析（例子）重復(fù)I重復(fù)II重復(fù)III平均數(shù)標準差3548219100.7±102.7微生物活菌計數(shù)方法專家講座第31頁3.3有效活菌數(shù)和雜菌計算微生物活菌計數(shù)方法專家講座第32頁示例樣品編號：A樣品狀態(tài)：顆粒執(zhí)行標準：GB20287-菌種名稱：巨大芽孢桿菌稱樣量：10.10g微生物活菌計數(shù)方法專家講座第33頁重復(fù)稀釋倍數(shù)（巨大芽孢桿菌在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上）/1031041051無法數(shù)11515有效菌數(shù)億/g2無法數(shù)126193無法數(shù)12417菌落平均數(shù)/121.717.01.20標準差/±5.9//微生物活菌計數(shù)方法專家講座第34頁重復(fù)稀釋倍數(shù)（細菌雜菌在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上）/1031041051無法數(shù)152雜菌數(shù)億/g2無法數(shù)2543無法數(shù)183菌落平均數(shù)/19.3/0.19微生物活菌計數(shù)方法專家講座第35頁重復(fù)稀釋倍數(shù)（霉菌在馬丁培養(yǎng)基上）/10310410516//霉菌數(shù)個/g27//38//菌落平均數(shù)7.0//0.69×106微生物活菌計數(shù)方法專家講座第36頁重復(fù)稀釋倍數(shù)（真菌雜菌在馬丁培養(yǎng)基上，不包含霉菌）/10310410513//真菌雜菌億/g22//34//菌落平均數(shù)3.0//0.0030微生物活菌計數(shù)方法專家講座第37頁微生物活菌計數(shù)方法專家講座第38頁

樣品編號檢測日期年月日室溫，℃相對濕度，%儀器名稱、編號1.培養(yǎng)箱2.潔凈室菌種名稱依據(jù)標準培養(yǎng)溫度，℃

培養(yǎng)基培養(yǎng)時間，h

基礎(chǔ)液體積v1，mL

樣品量m0(v0)，g(mL)

加樣量v2，mL

稀釋倍數(shù)k菌落數(shù)(cfu/皿)重復(fù)Ⅰ重復(fù)Ⅱ重復(fù)Ⅲ平均標準差σn-1無菌水對照計算公式：

nm=10-8kv1/(m0v2)其中nm為質(zhì)量有效活菌數(shù)或nv=10-8kv1/(v0v2)其中nv為體積有效活菌數(shù)

計算結(jié)果：億/g(mL)備注：檢測人校核人審核人有效活菌數(shù)測定原始統(tǒng)計表微生物活菌計數(shù)方法專家講座第39頁樣品編號檢測日期年月日室溫，℃相對濕度，%儀器名稱、編號1.培養(yǎng)箱2.潔凈室依據(jù)標準

基礎(chǔ)液體積v1，mL

樣品量m0(v0)，g(mL)加樣量v2，mL培養(yǎng)基1.培養(yǎng)溫度，℃1.培養(yǎng)時間，h1.2.2.2.真菌雜菌細菌雜菌類別稀釋倍數(shù)k1，k2菌落數(shù)（cfu/皿）稀釋倍數(shù)k3菌落數(shù)（cfu/皿）重復(fù)I重復(fù)II重復(fù)III平均重復(fù)I重復(fù)II重復(fù)III平均霉菌其它真菌無菌水對照無菌水對照真菌雜菌數(shù)霉菌雜菌數(shù)n1/g(mL)細菌雜菌數(shù)n3億/g(mL)其它真菌數(shù)n2/g(mL)k3v1/(v0