人促紅細(xì)胞生成素在細(xì)胞上的表達(dá)

人促紅細(xì)胞生成素在細(xì)胞上的表達(dá)第一頁，共二十一頁，2022年，8月28日促紅細(xì)胞生成素的理化性質(zhì)

EPO是由165個(gè)氨基酸組成的高糖基化蛋白質(zhì)，去唾液酸或去糖基化不影響重組人EPO的體外生物活性，但卻縮短了在體內(nèi)的半衰期，使其完全喪失了在體內(nèi)的活性，說明糖基對其生物活性是至關(guān)重要的，因此基因工程的EPO不能利用原核表達(dá)系統(tǒng)，只能利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（如CHO細(xì)胞）生產(chǎn)第二頁，共二十一頁，2022年，8月28日關(guān)于EPO人促紅細(xì)胞生成素是一種由腎臟產(chǎn)生的高度糖基化蛋白,是紅系細(xì)胞發(fā)育過程中最重要的調(diào)節(jié)因子。天然存在的EPO藥源極為匱乏,須從貧血病人尿中提取,不能滿足社會(huì)的需要。1985年Jacob等成功地從胎兒肝中克隆出EPO基因,使通過基因工程手段大量生產(chǎn)重組EPO成為可能。第三頁，共二十一頁，2022年，8月28日關(guān)于EPO國外用人促紅細(xì)胞生成素gDNA(genomicDNA)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已獲得高效表達(dá),而在我國雖也有重組產(chǎn)品問世,但存在表達(dá)水平偏低,生產(chǎn)成本偏高的問題,不能滿足大規(guī)模工廠化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用的需要,因此迫切需要提高EPO在細(xì)胞中的表達(dá)量。為此,我們開展了EPO在CHO細(xì)胞中的表達(dá)研究,希望能獲得比較理想的效果。第四頁，共二十一頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康模韩@得人促紅細(xì)胞生成素(EPO)的高效表達(dá)第五頁，共二十一頁，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)儀器及耗材實(shí)驗(yàn)試劑與器材氨甲喋呤(MTX)、煌焦油藍(lán)購于Sigma公司;rHuEPO體內(nèi)生物學(xué)活性測試工作標(biāo)準(zhǔn)品為Amgen公司產(chǎn)品;Lipofectamine、犢牛血清、F12與D-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自Gibco/BRL公司;EPOELISAkit購自BoehringerMannheim公司;96孔與24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為Costar產(chǎn)品。第六頁，共二十一頁，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)儀器及耗材實(shí)驗(yàn)材料菌株DH5α,JM109均由本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒質(zhì)粒pD、p38(內(nèi)含EPOgDNA)由本實(shí)驗(yàn)室保存,pcDNA3購自Invitrogen公司,pSV40dhfr由PaulBerg實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,本實(shí)驗(yàn)室保存。工具酶各種限制性內(nèi)切酶均購自華美生物工程公司,T4DNA連接酶與牛小腸堿性磷酸酶購自Gibco/BRL公司,DNA聚合酶I大片段(Klenow)購自Promega公司第七頁，共二十一頁，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)儀器及耗材細(xì)胞株CHO-dhfr-細(xì)胞由本室保存。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性BALB/c小鼠,6~8周齡。第八頁，共二十一頁，2022年，8月28日方法以EPOgDNA為基礎(chǔ)構(gòu)建了兩個(gè)真核表達(dá)載體pDE、pCE,將它們分別經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞,其48h瞬時(shí)表達(dá)量分別為27·5ng/ml與88·90ng/ml。然后用氨甲喋呤(MTX)對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行加壓并挑選細(xì)胞克隆,共獲得3株高效表達(dá)EPO的工程細(xì)胞株A,B,C,其中A來自質(zhì)粒pCE,B和C來自pDE,在2×10-6mol/L的MTX的壓力下,它們48h的最高表達(dá)水平分別為A:8·7μg/mlB:10·76μg/ml,C:16·44μg/ml。經(jīng)網(wǎng)織紅細(xì)胞法測得它們均具有體內(nèi)生物活性。第九頁，共二十一頁，2022年，8月28日網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)

(一)原理網(wǎng)織紅細(xì)胞是晚幼紅細(xì)胞脫核后但尚未完全成熟的紅細(xì)胞,胞質(zhì)中尚有核糖體、核糖核酸等嗜堿性物質(zhì)殘存,經(jīng)煌焦油藍(lán)或新亞甲藍(lán)活體染包后,胞質(zhì)中可見藍(lán)或藍(lán)綠色枝點(diǎn)狀甚至網(wǎng)織狀結(jié)構(gòu)。

(二)方法活體染色法.近年來還可通過某些血液自動(dòng)分析儀及流式細(xì)胞術(shù)檢測法進(jìn)行網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。第十頁，共二十一頁，2022年，8月28日四·實(shí)驗(yàn)步驟質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、酶切、去磷、連接、重組子質(zhì)粒的鑒定等基因操作

細(xì)胞的轉(zhuǎn)染按lipofectamine使用說明書進(jìn)行,在此過程中質(zhì)粒要經(jīng)特定的內(nèi)切酶線性化,在pCE中采用BglⅡ,pDE則采用EcoRⅠ,其中質(zhì)粒pCE要與經(jīng)EcoRⅠ線性化的質(zhì)粒pSV40-dhfr共轉(zhuǎn)染。細(xì)胞克隆的篩選CHO-dhfr-細(xì)胞在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48h后,經(jīng)胰蛋白酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),用F12培養(yǎng)液將其稀釋成1×104cells/ml,置37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常后,換用D-MEM培養(yǎng)液置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),約15d后出現(xiàn)肉眼可第十一頁，共二十一頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)步驟見的細(xì)胞克隆此時(shí)可用彎頭吸管挑取細(xì)胞克隆至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),同時(shí)在培養(yǎng)液中添加MTX,其初濃度為1×10-8mol/L,以每10d為一個(gè)周期,倍比地提高M(jìn)TX的濃度。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候?qū)?6孔板內(nèi)的細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,然后再轉(zhuǎn)入30ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),至此細(xì)胞克隆工作即告完成。在挑選克隆的過程中,應(yīng)挑取加壓后表達(dá)水平提高較明顯的細(xì)胞株,而非一開始表達(dá)量較高的細(xì)胞。細(xì)胞表達(dá)上清中EPO含量的檢測采用BoehringerMannheim公司的EPOELISAkitEPO生物活性的測定采用網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法第十二頁，共二十一頁，2022年，8月28日五·實(shí)驗(yàn)結(jié)果1·真核表達(dá)載體pDE、pCE的構(gòu)建

將質(zhì)粒p38經(jīng)SalⅠ酶切后,回收長為2·4kb的EPOgDNA片段,除EPO蛋白編碼區(qū)外,其5’非翻譯區(qū)長120bp,3’非翻譯區(qū)長200bp。同時(shí)將真核表達(dá)載體pD、pcDNA3分別用SalⅠ、HindⅢ線性化,線性化的pD經(jīng)CIP去磷后與EPO基因片段按適當(dāng)?shù)谋壤郎睾线B接,獲得重組質(zhì)粒pDE;將線性化的質(zhì)粒pcDNA3與EPO基因片段均經(jīng)Klenow補(bǔ)平,并且將線性化的pcDNA3經(jīng)CIP去磷,兩者按適當(dāng)比例混合后用T4DNA連接酶連接,得重組質(zhì)粒pCE。質(zhì)粒pCE與pDE的物理圖譜如下。第十三頁，共二十一頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)結(jié)果第十四頁，共二十一頁，2022年，8月28日·2瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果將質(zhì)粒用lipofectamine轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后48h,收集細(xì)胞上清,經(jīng)PBS稀釋100倍后,用ELISA測定其EPO的濃度,結(jié)果見表1。第十五頁，共二十一頁，2022年，8月28日3穩(wěn)定表達(dá)·經(jīng)MTX篩選后得到的三個(gè)高表達(dá)細(xì)胞株A、B、C,在MTX的濃度為2×10-6mol/L時(shí),測定它們48h細(xì)胞上清中EPO的濃度,樣品均用PBS稀釋10000倍,結(jié)果見表2。第十六頁，共二十一頁，2022年，8月28日4EPO體內(nèi)生物活性的測定

經(jīng)過網(wǎng)織紅細(xì)胞法,測得工程細(xì)胞株A,B,C48h穩(wěn)定表達(dá)上清中的EPO含有體內(nèi)生物活性,其體內(nèi)活性值分別為A:848·3IU/ml,B:1049·1IU/ml,C:1602·9IU/ml。第十七頁，共二十一頁，2022年，8月28日六·討論真核基因表達(dá)不僅可以生產(chǎn)大量的感興趣蛋白,而且在細(xì)胞遺傳學(xué)與生物學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用,因此研究基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)具有極其重要的理論及實(shí)踐意義。外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)受許多因素的影響,如轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后處理、翻譯水平以及翻譯后加工等方面,其中尤以轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)最為重要。在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是由基因的順式作用元件與細(xì)胞內(nèi)存在的反式作用因子之間的相互作用來實(shí)現(xiàn),由于在特定的細(xì)胞內(nèi),反式作用因子是固定的,不可改變的,因此基因的表達(dá)主要取決于其順式作用元件的作用。第十八頁，共二十一頁，2022年，8月28日對外源基因而言,也就是決定于特定的表達(dá)載體中的啟動(dòng)子,一個(gè)合適的啟動(dòng)子可將外源基因的表達(dá)水平提高幾倍甚至幾十倍。但是對于特定的基因和細(xì)胞,各啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄的效率有很大的差別,因此我們認(rèn)為在進(jìn)行外源基因的表達(dá)研究中,應(yīng)考慮選用幾種不同的強(qiáng)啟動(dòng)子,才有可能獲得較為理想的表達(dá)效果。目前外源蛋白在真核細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)均采用了選擇擴(kuò)增系統(tǒng),其中以二氫葉酸還原酶基因擴(kuò)增系統(tǒng)研究最為清楚,應(yīng)用最為廣泛?？梢酝ㄟ^MTX的漸次加壓選擇而進(jìn)行極大地增加外源基因的拷貝數(shù),從而提高外源蛋白的產(chǎn)量。第十九頁，共二十一頁，2022年，8月28日有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為與dhfr基因共轉(zhuǎn)染的DNA傾向于同它一起整合于細(xì)胞染色體的共同區(qū)域,當(dāng)用MTX進(jìn)行加壓篩選時(shí),它們將同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。但我們的研究表明共轉(zhuǎn)染時(shí)加壓效果不明顯,這可能是由于它們并未整合于染色體的相同位點(diǎn)所致。因此我們認(rèn)為最好選用dhfr基因與目的基因串聯(lián)在一起的載體來進(jìn)行表達(dá),加壓效果較為明顯。我們的表達(dá)結(jié)果明顯高于國內(nèi)