小鼠骨片MSC分離與培養(yǎng)的方法,細(xì)胞生物學(xué)論文

小鼠骨片MSC分離與培養(yǎng)的方法,細(xì)胞生物學(xué)論文充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell,MSC)是再生醫(yī)學(xué)重要的種子細(xì)胞,在很多疾病治療中呈現(xiàn)出令人振奮的治療效果.MSC首先是由Friedenstein等[1-2]從骨髓中利用其貼壁生長的特性成功分離出來.這種方式方法后來被很多研究者用來分離人和實驗動物來源的骨髓MSC[3-6].小鼠是用量最大、用處最廣、品種最多的實驗動物,已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的科學(xué)實驗.然而令人煩惱的是實驗者很難成功的從小鼠骨髓分離到高純度的MSC,或者很難實現(xiàn)MSC的連續(xù)屢次體外傳代擴(kuò)增培養(yǎng)[7].究其原因,是由于小鼠骨髓量很少,MSC含量極少,同時混有大量造血細(xì)胞的優(yōu)勢生長,嚴(yán)重影響了MSC的分離培養(yǎng)[7].研究發(fā)現(xiàn),MSC存在于很多組織中[8],本研究將嘗試從小鼠骨片中分離MSC,并建立其分離培養(yǎng)的方式方法.材料與方式方法一、材料1.實驗動物:C57BL/6小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心,雄性,7d齡.所有實驗在符合動物實驗倫理要求下進(jìn)行.2.主要試劑及儀器:MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(美國Gibco公司),胎牛血清(美國Stemcell公司),D-60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(美國Costar公司),0.2﹪膠原酶、甘油磷酸鈉、地塞米松、胰島素、1-甲基-3異丁基-黃嘌呤、吲哚美辛、維生素C、油紅O(美國Sigma),堿性磷酸酶染色試劑盒(美國Sigma),胰蛋白酶(美國Amresco公司),PE、FITC或PERCP標(biāo)記抗小鼠單克隆抗體CD29,CD34,CD45,CD90,Scal1(美國BD公司),CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司),眼科鑷,眼科剪.二、方式方法1.小鼠骨片MSC分離培養(yǎng):C57小鼠經(jīng)脫頸處死后,75﹪酒精浸泡消毒10min.用眼科剪橫向剪開皮膚和肌肉,用眼科鑷撥開露出小鼠脛骨和股骨,剝離脛骨和股骨,從脛骨頭和股骨頭處剪斷,放入預(yù)先放有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中.用1ml注射器汲取基礎(chǔ)培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔內(nèi)的骨髓直至骨片呈白色.將骨片剪碎,參加膠原酶Ⅰ(2mg/ml)2ml,37℃消化1~2h,參加胎牛血清終止消化.參加MEM洗滌骨片,將骨片轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中,參加新鮮配制的含胎牛血清10﹪(v/v)和雙抗0.1﹪(v/v)的完全培養(yǎng)基,37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3~4d.參加0.25﹪胰酶消化3min,收獲MSC,按1:3傳代培養(yǎng),每2~3d更換培養(yǎng)基1次.殘留的骨片可繼續(xù)培養(yǎng)獲得更多的原代MSC.收獲P2,P3代細(xì)胞進(jìn)行實驗研究.2.流式鑒定:收獲P2代小鼠MSC,經(jīng)PBS洗滌2次,參加PE、FITC或PERCP標(biāo)記抗小鼠CD29,CD34,CD45,CD90,Scal1單克隆抗體避光孵育30min,參加PBS洗滌2次,1500rpm離心5min,重懸細(xì)胞,進(jìn)行流式測定.FlowJ7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.3.成骨誘導(dǎo)分化及鑒定:取P3代小鼠MSC,以每孔2104細(xì)胞數(shù)種植于24孔板中,60﹪~70﹪融合時,更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,含胎牛血清10﹪(v/v),甘油磷酸鈉10mmol/L,地塞米松10-7mol/L,維生素C50mol/L.每3~4d更換培養(yǎng)基1次,誘導(dǎo)2~3周后進(jìn)行堿性磷酸酶染色鑒定.步驟為吸棄培養(yǎng)基,4﹪多聚甲醛固定30min,去離子水洗滌2次,參加ALP染料混合液,室溫孵育30min,去離子水洗滌2次,每次2min,參加蘇木素復(fù)染10min,去離子水洗滌,倒置相差顯微鏡下觀察.4.成脂誘導(dǎo)分化及鑒定:取P3代小鼠MSC,以每孔2104細(xì)胞數(shù)種植于24孔板中,60﹪~70﹪融合時,更換含胎牛血清10﹪(v/v),地塞米松10-6mol/L,胰島素10ng/ml,1-甲基-3異丁基-黃嘌呤0.5mol/L,吲哚美辛10-4mol/L的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基,每3~4d更換培養(yǎng)基1次,2周后進(jìn)行油紅O染色鑒定成脂細(xì)胞.步驟為吸棄培養(yǎng)基,PBS洗滌1次,參加4﹪多聚甲醛固定30min,70﹪異丙醇洗滌2次,參加2﹪油紅O室溫下染色10~15min,棄去油紅O染料,異丙醇洗滌殘留油紅O,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴.結(jié)果1.小鼠骨片分離清洗:小鼠脛骨和股骨較小,約牙簽大小,可見骨腔內(nèi)紅色骨髓(圖1a),用1ml注射器吸取MEM培養(yǎng)基沖洗髓腔骨髓后,顏色變白(圖1b).2.小鼠骨片MSC原代培養(yǎng):小鼠骨片培養(yǎng)2d后就能夠看見骨片邊緣爬出長梭形細(xì)胞,3d后爬出細(xì)胞越來越多,并成集落樣生長(圖2).消化細(xì)胞進(jìn)行傳代后,可獲得純度較高的MSC,并且細(xì)胞增殖速度較快,3d就可到達(dá)90﹪融合.獲得的MSC能夠連續(xù)傳代數(shù)代,仍然保持良好的細(xì)胞形態(tài)和增殖能力(圖3).殘留的骨片還能夠繼續(xù)作為原代MSC的來源繼續(xù)培養(yǎng),經(jīng)過數(shù)次培養(yǎng)后,骨片逐步疏松,除MSC外,殘留骨細(xì)胞(圖4).3.流式鑒定結(jié)果:流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,獲得的細(xì)胞表示出Scal(192.7﹪),CD29(98.4﹪),CD90(91.6﹪)等MSC標(biāo)志物,不表示出CD34(1.57﹪),CD45(3.99﹪),CD11b(0.63﹪)等造血細(xì)胞標(biāo)志物(圖5).符合小鼠MSC的標(biāo)準(zhǔn).4.向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)果:小鼠骨片MSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)2周后,經(jīng)堿性磷酸酶(ALP)染色提示細(xì)胞內(nèi)有大量酶顆粒構(gòu)成,與成骨細(xì)胞活性相關(guān)的堿性磷酸酶表示出陽性(圖6).講明獲得的細(xì)胞能夠成功的誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞.5.向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)果:獲得的細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)4~5d后,倒置相差顯微鏡觀察可見胞漿內(nèi)出現(xiàn)圓形脂滴,并且隨著誘導(dǎo)時間的延長,脂滴逐步增加增大.誘導(dǎo)2周后,可見大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)充滿脂滴.經(jīng)脂肪細(xì)胞特異性油紅O染色,呈紅色油滴樣(圖7).證實獲得的細(xì)胞能夠成功誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞.討論MSC因其具有分化潛能、免疫調(diào)控、分泌細(xì)胞因子等功能成為再生醫(yī)學(xué)重要的種子細(xì)胞之一.當(dāng)前已經(jīng)被廣泛用于多種疾病治療的實驗研究,包括移植物抗宿主病、糖尿病、脊髓損傷、肺和關(guān)節(jié)疾病等[9].小鼠因其品系純,應(yīng)用于科學(xué)研究中所獲的實驗結(jié)果敏感性高,一致性強(qiáng),重復(fù)性高等優(yōu)點,已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)、胚胎發(fā)生學(xué)等領(lǐng)域的科學(xué)實驗.小鼠還具有容易實現(xiàn)基因敲除[10]、體積小、繁衍快、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點,作為動物模型越來越遭到研究者的重視[11].研究者已經(jīng)采用小鼠成功制作很多人類疾病的動物模型如糖尿病、卵巢癌、肥胖、白內(nèi)障、創(chuàng)傷、甚至HIV模型[12]等,為開展干細(xì)胞治療疾病的實驗研究提供了重要基礎(chǔ)[11,13-15].然而研究者在采用傳統(tǒng)方式方法分離小鼠骨髓MSC時卻碰到了難題,很難成功的分離高純度的MSC,或者很難實如今體外長時間繼代培養(yǎng)[7].一些研究者采用大鼠或人源的MSC作為供者細(xì)胞,替代小鼠來源MSC來研究治療效果,以解決小鼠MSC來源缺乏的問題.固然MSC的免疫原性很低,但仍然不能排除異種來源細(xì)胞對實驗研究效果的影響.為避免上述問題對實驗研究的影響,建立能獲得足量、穩(wěn)定的小鼠來源MSC對研究者具有重要意義.MSC是骨髓腔中的基質(zhì)細(xì)胞,是構(gòu)成骨髓造血微環(huán)境的重要成分,因而骨本質(zhì)中可能存在大量的MSC[16].研究發(fā)現(xiàn),在骨髓腔邊緣或骨本質(zhì)中還存在更原始的MSC,表示出成熟MSC不表示出神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志[16].本研究通過清洗骨髓腔內(nèi)骨髓,去除造血細(xì)胞的影響,成功從小鼠骨片中分離出高純度的MSC,并成功進(jìn)行體外傳代培養(yǎng).獲得的細(xì)胞高表示出MSC標(biāo)志Scal1,CD29,CD90,不表達(dá)造血系統(tǒng)細(xì)胞標(biāo)志物CD11b,CD34,CD45.并具有多向分化的能力,能夠成功誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞.所以通過骨片法能夠獲得小鼠來源MSC,并且純度高,增殖能力更強(qiáng),能夠?qū)嵢缃耋w外較長時間的繼代培養(yǎng),為實驗研究提供了很好的種子來源.同時還能夠利用很多轉(zhuǎn)基因小鼠如綠色熒光小鼠等,分離獲得具有特殊功能的MSC(表示出綠色熒光),以及利用一些基因敲除小鼠獲得某基因缺失的特殊MSC,為進(jìn)一步開展實驗研究提供更豐富的種子來源.參考文獻(xiàn):1FriedensteinAJ,Piatetzky-ShapiroII,PetrakovaKV.Osteogenesisintransplantsofbonemarrowcells[J].JEmbryolExpMorphol,1966,16(3):381-390.2FriedensteinAJ,GorskajaJF,KulaginaNN.Fibroblastprecursorsinnormalandirradiatedmousehematopoieticorgans[J].ExpHematol,1976,4(5):267-274.3KadiyalaS,YoungRG,ThiedeMA,etal.Cultureexpandedcaninemesenchymalstemcellspossessosteochondrogenicpotentialinvivoandinvitro[J].Celltransplantation,1997,6(2):125-134.4MartinDR,CoxNR,HathcockTL,etal.Isolationandcharacterizationofmultipotentialmesenchymalstemcellsfromfelinebonemarrow[J].ExpHematol,2002,30(8):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