漢族人群聚腺苷二磷酸核糖聚合酶

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苷二磷酸核

目的：通過(guò)檢測(cè)人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（hPARP1）7個(gè)外顯子核苷酸多態(tài)性，了解在廣東的漢族人群中hPARP1基因多態(tài)性分布，為建立民族特色的DNA修復(fù)基因多態(tài)性數(shù)據(jù)提供基礎(chǔ)資料。方法：選取在廣東地區(qū)的漢族健康人群320名的基礎(chǔ)資料及血液樣本，抽提血液DNA，用PCR法擴(kuò)增hPARP1基因7個(gè)外顯子，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)和銀染技術(shù)檢測(cè)hPARP1基因多態(tài)性，并進(jìn)行DNA序列測(cè)定。結(jié)果：在廣東的漢族正常人320名血標(biāo)本的7個(gè)外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物SSCP電泳條帶中，4個(gè)樣本hPARP1基因外顯子17的SSCP電泳條帶檢出1條多態(tài)性條帶，3個(gè)樣本第12內(nèi)含子檢出1條多態(tài)性條帶，其余6個(gè)外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物SSCP電泳未見(jiàn)多態(tài)性條帶。正常帶型DNA測(cè)序結(jié)果與genebank中已知序列完全一致，第17外顯子上有1種基因突變類型（TC）。結(jié)論：在廣東地區(qū)的漢族人群的hPARP1基因第17外顯子和第12內(nèi)含子上可能存在多態(tài)性。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶－1；遺傳多態(tài)性；聚合酶鏈反應(yīng)

Objective:Toinvestigatethenucleotidepolymorphismsanddistributionsofsevenexonsinhumanpoly(ADPribose)polymerase1(PARP1)geneandtocontributetotheconstructionofthespecialDNArepairgenepolymorphismsdatabank.Methods:Thebasicmaterialsandbloodsamplesfrom320GuangdonghealthHanpopulationwerecollected.Thepolymorphismofexon3,11,12,13,16,17andexon20ofhPARP1geneweredetectedbyPCRSSCP,andsequencingtestwereperformed.Results:Apolymorphismsofexon20ofPARP1genewasdetectedin320HanpeoplebyPCRSSCP,noabnormalbandswereobservedfromtheanalysisofPCRSSCPinotherexons.Also,DNAsequenceofnormalbandsturnedoutthatPCRproductsweretargetonesinGenebank,onetypemutations(TC)and(GA)weredetectedinexon17andinintron12.Conclusion:Polymorphismsmayexistinexon17andintron12ofhPARP1geneinGuangdongHanpopulation.PCRSSCPsilverstainingcouldbeasatooltoscreenrapidlythepolymorphismshPARP1gene.

poly(ADPribose)polymerase1;geneticpolymorphism;polymerasechainreaction

DNA修復(fù)系統(tǒng)在修復(fù)DNA損傷、維持基因組完整和穩(wěn)定性中起著不容忽略的作用。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1［poly(ADPribose)polymerase1，PARP1］是真核細(xì)胞中存在的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶?？蓞⑴c大量與細(xì)胞功能有關(guān)的重要反應(yīng)，并與癌癥的發(fā)生、發(fā)展和治療、預(yù)后密切相關(guān)，對(duì)維持DNA的完整性方面起著重要的作用［1］，其多態(tài)位點(diǎn)的確認(rèn)對(duì)疾病易感性的流行病學(xué)研究具有重大意義?；驒z測(cè)能有效篩查基因突變攜帶者，可以為進(jìn)一步鑒定該突變功能上的意義提供基礎(chǔ)的分子遺傳學(xué)資料，因而具有重要的意義。本文應(yīng)用PCRSSCP基因篩查技術(shù)和分子流行病學(xué)方法檢測(cè)了在廣東的漢族人群中正常人hPARP1基因的多態(tài)性，為hPARP1基因多態(tài)性人群分布和建立民族特色的DNA修復(fù)基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)提供基礎(chǔ)資料?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1方法

1.1樣本收集

選取在廣東地區(qū)的健康狀況良好(通過(guò)體檢選擇取)、無(wú)家族史和遺傳病史、三代及以上均為漢族的320名個(gè)體（其中男174例，女146例，年齡38～67歲，平均年齡（43.156.70）歲）并取血樣標(biāo)本。

1.2血液DNA的抽提［2］

采集外周抗凝全血5mL，用經(jīng)典酚氯仿法提取外周血DNA，并在4℃保存。

1.3引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已確定的hPARP1基因cDNA和內(nèi)含子/外顯子連接序列，用PrimerPremier5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)hPARP1基因7個(gè)外顯子的引物，該引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。表1擴(kuò)增hPARP1基因外顯子的引物序列

1.4PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)總體積為25L，各成分終濃度為：引物0.125mol/L，dNTP0.2mmol/L，Mg2+1.8mmol/L，DNA模板25～250ng，TaqDNA聚合酶2.5u。反應(yīng)參數(shù)為：98℃預(yù)變性5min，94℃30s，53～59℃30s，72℃45s，30次循環(huán)后72℃延伸8min。以2％瓊脂凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。若與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)相比，擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，無(wú)雜帶，則可用于單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析。

1.5SSCP分析

1.5.18％聚丙烯酰胺凝膠的配制40％丙烯酰胺8mL，10Tris/硼酸電泳緩沖液(TBE)4ml，10％過(guò)硫酸胺（AP）0.8mL，N,N,N,N四甲基乙二胺(TEMED)53L，甘油4mL，加水至40mL。將聚丙烯酰胺凝膠混合物倒入玻璃板夾層，插入梳子，讓凝膠在室溫下聚合40～50min，拔出梳子，沖洗樣孔。根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度，取0.2～2L產(chǎn)物參與20L甲酰胺變性液（98％去離子甲酰胺，0.05%溴酚藍(lán)和0.05%二甲苯青）中混勻，95℃熱變性5min，立刻置于冰上，點(diǎn)樣于預(yù)電泳30min的上述8％聚丙烯酰胺凝膠中，在4～8℃環(huán)境中300V電泳6～10h。

1.5.2銀染步驟參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行(1)10％乙醇浸泡5min；(2)1％HNO3浸泡5min；(3)0.2％AgNO3浸泡20min；(4)顯影液(20mL1.4mol/L無(wú)水碳酸鈉＋50L甲醛＋80mL去離子水)，至條帶出現(xiàn)；(5)10％醋酸浸泡5min。以上每一步后均用去離子水洗2次，觀測(cè)結(jié)果并掃描成像保存。對(duì)陽(yáng)性結(jié)果樣本進(jìn)行2～3次PCRSSCP銀染重復(fù)試驗(yàn)。

1.6DNA序列測(cè)定

對(duì)SSCP分析有異常泳動(dòng)帶的外顯子，擴(kuò)增DNA樣本，采用ABI377全自動(dòng)基因分析儀對(duì)其進(jìn)行DNA序列測(cè)定并與GeneBank中所報(bào)道的序列進(jìn)行對(duì)比。

2結(jié)果

2.1DNA抽提結(jié)果

所抽提DNA樣本濃度及純度，均可用于后續(xù)試驗(yàn)研究。

2.2PCR擴(kuò)增

320份DNA樣本的hPARP1基因7個(gè)外顯子均得到成功擴(kuò)增，各外顯子PCR反應(yīng)產(chǎn)物均為單一條帶，大小在175～362bp之間，與預(yù)計(jì)擴(kuò)增片斷大小一致(圖1)。

2.3SSCP分析

經(jīng)PCRSSCP對(duì)7個(gè)外顯子進(jìn)行遺傳多態(tài)性檢測(cè)，320名漢族人中有4名的外顯子17和3名測(cè)序檢出內(nèi)含子12出現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)，出現(xiàn)2種穩(wěn)定的帶型，顯示3條變性單鏈帶（異常泳動(dòng)條帶位置在2條正常單鏈的中間），其余6個(gè)外顯子均未發(fā)現(xiàn)異常帶型，顯示2條變性單鏈帶（圖2）。

2.4測(cè)序

正常樣本7個(gè)外顯子雙向測(cè)序結(jié)果說(shuō)明，所擴(kuò)增序列分別與Genbank中hPARP1基因7個(gè)外顯子的符合率達(dá)到100％。4例異常樣本第17外顯子和3例異常樣本第12外顯子測(cè)序結(jié)果，所擴(kuò)增序列有一處堿基發(fā)生突變，外顯子17在密碼子808處出現(xiàn)CACCGC，即組氨酸精氨酸；第12外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)12內(nèi)含子在18731位出現(xiàn)GA改變(圖3，圖4)。

1～8泳道分別為外顯子20、17、3、11、DNAMarkDL2000及外顯子12、13、16。

圖1PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上電泳結(jié)果第6泳道為異常標(biāo)本，其余泳道為正常標(biāo)本；"'：正常單鏈，"'：異常單鏈。

圖2hPARP1基因外顯子17PCR產(chǎn)物在8％非變性聚丙烯酰胺凝膠上的電泳圖

第12內(nèi)含子的18731位出現(xiàn)GA的雜合性突變。

圖3第12內(nèi)含子正向測(cè)序圖異常泳動(dòng)條帶樣本第17外顯子反向測(cè)序結(jié)果：密碼子808出現(xiàn)TC的雜合性突變。

圖4第17外顯子反向測(cè)序圖3探討

PCRSSCP銀染技術(shù)是一種檢測(cè)基因突變十分敏感的方法。在大樣本量的分子流行病學(xué)研究中,往往需要對(duì)多個(gè)基因或同一基因的多個(gè)外顯子進(jìn)行突變篩查,這種工作不僅工作量大,花費(fèi)大,操作繁瑣,而且不易進(jìn)行質(zhì)量控制。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，SSCP多重PCR法是一種快速檢測(cè)正常人群hPARP1基因多態(tài)性的有用技術(shù)。它比用于檢測(cè)基因突變的其它方法［4］，如變性梯度凝膠電泳法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性和直接測(cè)序更簡(jiǎn)單、更省財(cái)省力，適用于大樣本量人群的基因突變篩查和分子流行病學(xué)研究。

由于DNA單鏈的構(gòu)像是未知的，SSCP的條件應(yīng)基于不同大小的DNA片段，一般是靠經(jīng)驗(yàn)來(lái)決定的，同時(shí)電泳溫度和凝膠濃度能明顯影響電泳的速度和單鏈DNA分子的辨別率。SSCP不能確定堿基改變的確切數(shù)量或改變的位點(diǎn)，突變位點(diǎn)的確切定位必需依靠直接測(cè)序來(lái)完成。我們?cè)赟SCP檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)有異常泳動(dòng)條帶的樣本時(shí)，重新擴(kuò)增其DNA進(jìn)行序列分析，結(jié)果均有基因突變。由此可見(jiàn)，SSCP檢測(cè)結(jié)果與直接測(cè)序結(jié)果的符合率高。在所有320份標(biāo)本中僅檢出4份樣本的第17外顯子上的突變位點(diǎn)，其余6個(gè)外顯子均未檢出突變位點(diǎn)。與本室以前研究結(jié)果［3］相比，檢出率有提高。這是與本試驗(yàn)始終在同一電泳環(huán)境溫度(4℃)、凝膠濃度下對(duì)7個(gè)外顯子進(jìn)行電泳有關(guān)，還是與抽樣有關(guān)呢？其確鑿原因有待進(jìn)一步研究。

本研究用PCRSSCP法在320名廣東地區(qū)漢族人群中篩查出4名的hPARP1基因第17外顯子有一種錯(cuò)義突變，檢出3例第12內(nèi)含子有1種堿基突變發(fā)生。由于所檢測(cè)出的突變位點(diǎn)尚未見(jiàn)報(bào)道，因此無(wú)法與其他國(guó)家或民族的基因頻率進(jìn)行對(duì)比。同時(shí)，第17外顯子基因頻率大于1