基因工程基本操作程序2

基因工程基本操作程序2第1頁(yè)/共20頁(yè)基因工程的操作程序主要包括四個(gè)基本步驟：1）目的基因的獲取2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4）目的基因的檢測(cè)與鑒定第2頁(yè)/共20頁(yè)一、目的基因的獲取1、目的基因的概念：目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因,主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。

如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因，還有植物的抗?。共《尽⒖辜?xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。第3頁(yè)/共20頁(yè)2、目的基因的獲得方法：①?gòu)幕蛭膸?kù)獲取目的基因未知序列②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因③通過(guò)化學(xué)方法直接人工合成

已知序列第4頁(yè)/共20頁(yè)①?gòu)幕蛭膸?kù)中獲取目的基因：基因文庫(kù):

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(kù)(genelibrary)基因組文庫(kù):

基因文庫(kù)中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù).部分基因文庫(kù):

基因文庫(kù)中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫(kù)叫做部分基因文庫(kù).第5頁(yè)/共20頁(yè)②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

原理：DNA雙鏈復(fù)制的原理過(guò)程：熱解旋（90℃－95℃）→引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合（55℃－60℃）→DNA聚合酶作用下延伸（70℃－75℃）條件：DNA模板、引物、DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸第6頁(yè)/共20頁(yè)③通過(guò)DNA合成儀直接人工合成條件：基因比較小且已知其序列

根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推算出信使RNA核苷酸順序，然后按照堿激互補(bǔ)配對(duì)原則，推算出基因DNA的脫氧核苷酸順序。用游離脫氧核苷酸直接合成相應(yīng)的基因。第7頁(yè)/共20頁(yè)二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1、過(guò)程：

1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出黏性末端。

2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。

3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）

目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。第8頁(yè)/共20頁(yè)2、目的：

①使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以復(fù)制遺傳給下一代②使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用3、組成：目的基因；啟動(dòng)子；終止子；標(biāo)記基因第9頁(yè)/共20頁(yè)啟動(dòng)子終止子目的基因標(biāo)記基因表達(dá)載體模式圖第10頁(yè)/共20頁(yè)三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞---轉(zhuǎn)化1、轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。第11頁(yè)/共20頁(yè)常用的受體細(xì)胞：

有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。第12頁(yè)/共20頁(yè)

將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多單子葉植物沒(méi)有感染力）基因槍法（常用于單子葉植物）花粉管通道法（轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉）

將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)（“超級(jí)小鼠”）

受體細(xì)胞：受精卵第13頁(yè)/共20頁(yè)

將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞導(dǎo)入大腸桿菌的方法：鈣離子處理法

首先用Ca2+處理細(xì)胞,以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性,使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞.

第二步是將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合,在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,完成轉(zhuǎn)化過(guò)程.

第三步目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非?？欤诤芏痰臅r(shí)間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。第14頁(yè)/共20頁(yè)四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1、檢測(cè)與鑒定的目的

目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。第15頁(yè)/共20頁(yè)2、層次：檢測(cè)目的基因是否插入了轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上①分子水平的檢測(cè)：

檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA

檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)②個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定第16頁(yè)/共20頁(yè)檢測(cè)是否插入了目的基因原理：分子雜交技術(shù)過(guò)程：將轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA提取出來(lái)→標(biāo)記目的基因作探針→使其雜交檢測(cè)是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA原理：分子雜交技術(shù)檢測(cè)是否翻譯成蛋白質(zhì)原理：抗原--抗體雜交個(gè)體生物學(xué)水平的檢測(cè)（做抗蟲(chóng)或抗病的接種實(shí)驗(yàn)）第17頁(yè)/共20頁(yè)1.運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)，將蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因整合到棉花細(xì)胞中，為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)是否成功，最方便的方法是檢測(cè)棉花植株是否有（）

A.抗蟲(chóng)基因B.抗蟲(chóng)基因產(chǎn)物

C.新的細(xì)胞核D.相應(yīng)性狀2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因時(shí)的受體細(xì)胞是（）

A.受精卵B.精細(xì)胞

C.卵細(xì)胞D.體細(xì)胞DA隨堂練習(xí)第18頁(yè)/共20頁(yè)3.人的糖蛋白必須經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體進(jìn)一步加工合成，通過(guò)轉(zhuǎn)