dd結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)基因SPARCL的發(fā)現(xiàn)與功能研究

dd結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)基因SPARCL的發(fā)現(xiàn)與功能研究第1頁(yè)/共15頁(yè)研究目的尋找腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶特性相似轉(zhuǎn)移決定于原發(fā)灶通過(guò)比較伴肝轉(zhuǎn)移和無(wú)轉(zhuǎn)移的腸癌原發(fā)灶來(lái)尋找轉(zhuǎn)移相關(guān)基因BrabletzT,NatureRevCancer2005第2頁(yè)/共15頁(yè)材料與方法組織類型病例數(shù)無(wú)轉(zhuǎn)移腸癌組織13伴肝轉(zhuǎn)移腸癌組織12基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，芯片類型：Affymetrix伴肝轉(zhuǎn)移腸癌原發(fā)灶組織：

經(jīng)病理證實(shí)有肝轉(zhuǎn)移灶無(wú)轉(zhuǎn)移腸癌組織：

手術(shù)后經(jīng)隨訪三年以上無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移第3頁(yè)/共15頁(yè)GSEA：GeneSetEnrichmentAnalysis，基因富集分析方法一種生物信息學(xué)方法，用來(lái)確定一組預(yù)先定義的基因在兩組表型不同的樣本間是否有表達(dá)差異。預(yù)定義的基因：如屬于同一Pathway的基因,定位于同一Cytoband的基因本研究中用來(lái)發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)存在差異表達(dá)的染色體區(qū)帶Subramanianet.al,PNAS,2005第4頁(yè)/共15頁(yè)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的GSEA分析表明：4q22為腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)染色體顯帶，所包含的基因在無(wú)轉(zhuǎn)移和伴肝轉(zhuǎn)移腸癌間表達(dá)差異顯著SPARCL1基因?yàn)?q22中最重要的基因（權(quán)重最高）無(wú)轉(zhuǎn)移腸癌伴肝轉(zhuǎn)移腸癌第5頁(yè)/共15頁(yè)SPARCL1基本情況定位于人類染色體4q22，基因大小為35kb，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成mRNA長(zhǎng)度是3kb，編碼664個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量約為71kDa，存在多個(gè)糖基化位點(diǎn)分泌型的基質(zhì)細(xì)胞糖蛋白，參與多項(xiàng)機(jī)體生理過(guò)程，如細(xì)胞黏附，細(xì)胞增殖，肌肉分化以及B淋巴細(xì)胞成熟等在非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、慢性粒細(xì)胞白血病中表達(dá)下調(diào)，在肝癌中表達(dá)上調(diào)SPARCL1mRNA的定量，SPARCL1蛋白的免疫組化無(wú)轉(zhuǎn)移腸癌,伴肝轉(zhuǎn)移腸癌,肝轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)情況第6頁(yè)/共15頁(yè)SPARCL1基因低表達(dá)與腸癌肝轉(zhuǎn)移有關(guān)表達(dá)低：

伴肝轉(zhuǎn)移腸癌

肝轉(zhuǎn)移灶表達(dá)高：

無(wú)轉(zhuǎn)移腸癌差異顯著，P=0.007無(wú)轉(zhuǎn)移腸癌SPARCL1mRNA伴肝轉(zhuǎn)移腸癌肝轉(zhuǎn)移灶組織中SPARCL1mRNA定量分析第7頁(yè)/共15頁(yè)SPARCL1蛋白低表達(dá)與腸癌肝轉(zhuǎn)移有關(guān)表達(dá)低：

伴肝轉(zhuǎn)移腸癌

肝轉(zhuǎn)移灶表達(dá)高：

無(wú)轉(zhuǎn)移腸癌差異顯著，P=0.004SPARCL1蛋白表達(dá)差異與mRNA一致無(wú)轉(zhuǎn)移腸癌伴肝轉(zhuǎn)移腸癌肝轉(zhuǎn)移灶空白H&ESPARCL1SPARCL1蛋白的免疫組化分析第8頁(yè)/共15頁(yè)SPARCL1表達(dá)載體構(gòu)建及抗體制備構(gòu)建帶有His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET-22b-SPARCL1構(gòu)建用于真核表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN-SPARCL1合成多肽作為抗原，制備兔多克隆抗體及鼠單克隆抗體SPARCL1蛋白重組表達(dá)和純化pET-22b-SPARCL1轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E.coli(BL21(DE3)/Polys)擴(kuò)大培養(yǎng)并以IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)

Ni2+金屬螯合層析柱純化第9頁(yè)/共15頁(yè)SPARCL1功能研究腸癌細(xì)胞系中高表達(dá)SPARCL1不影響：細(xì)胞周期和增殖能力影響：遷移和侵襲能力細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)第10頁(yè)/共15頁(yè)SPARCL1蛋白表達(dá)與預(yù)后生存分析175例結(jié)直腸癌病人P=0.025SPARCL1表達(dá)高

者預(yù)后好SPARCL1表達(dá)與生存時(shí)間第11頁(yè)/共15頁(yè)結(jié)合其他標(biāo)志物判斷預(yù)后多標(biāo)志物生存分析P53、MAPK、E-cadherin、MSH2、ADCY-2、Shp2、SPARCL1遺傳算法支持向量機(jī)P53+SPARCL1的模型可更好判斷預(yù)后第12頁(yè)/共15頁(yè)SPARCL1基因的低表達(dá)與腸癌肝轉(zhuǎn)移有關(guān)SPARCL1基因可能通過(guò)抑制細(xì)胞的遷移能力影響腫瘤轉(zhuǎn)移SPARCL1表達(dá)高低可幫助判斷腸癌病人的預(yù)后，結(jié)合經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物如P53構(gòu)建的多標(biāo)志物模型可更好判斷預(yù)后SPARCL1為分泌型蛋白，是潛在血清標(biāo)志物腫瘤原發(fā)灶的分子事件是導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的主要因素第13頁(yè)/共15頁(yè)鄭樹(shù)葛維挺

芯片分析，mRNA定量分析虞舒靜

免疫組化，預(yù)