第4章-發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制

第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制一次成功的發(fā)酵同時受到兩方面因素的制約，一是生產菌種的遺傳特性，二是發(fā)酵條件，因此，必須了解有關環(huán)境條件對生產菌種的影響，因地制宜地適應菌種的特性，測定發(fā)酵過程中各種參數(shù)的變化規(guī)律，才能有效地實現(xiàn)發(fā)酵工藝的優(yōu)化和控制。

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制第一節(jié)

發(fā)酵過程的代謝變化由于發(fā)酵過程的復雜性，使得發(fā)酵工業(yè)生產過程的在線監(jiān)控比其他行業(yè)落后，其重要原因是有效檢測過程狀態(tài)變量的傳感器質量不過關，以至很難實現(xiàn)在線分析和控制。變化過程中的參數(shù)可分為物理參數(shù)、化學參數(shù)、生物學參數(shù)等，但目前較多的測定參數(shù)僅包括溫度、罐壓、空氣流量、攪拌轉速、pH值、溶氧、糖含量、菌體濃度、基質濃度等，且其中大多數(shù)為非在線測定。一、與代謝變化有關的參數(shù)

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制1、溫度：

影響微生物的生長代謝、系統(tǒng)中酶的反應速率、溶氧量、菌體的濃度變化、產物合成等等。注意：微生物生長和產物合成的溫度要求不同；發(fā)酵過程中的發(fā)酵熱，包括生物熱、攪拌熱、蒸發(fā)熱、輻射熱等等影響發(fā)酵過程的溫度變化。（一）物理參數(shù)：

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制2、罐壓：作用：形成正壓，防止污染增加溶氧，但二氧化碳的溶解量也上升，因此罐壓不宜太高；減少泡沫（一）物理參數(shù)：

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制3、攪拌參數(shù)：（轉速、功率）

作用：增加溶氧，但也與泡沫形成等有關；攪拌功率：影響傳氧效率；菌體損傷（尤其是絲狀真菌）（一）物理參數(shù)：

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制4、空氣流量流量越大，泡沫越多，發(fā)酵液總體積上升，裝料系數(shù)下降；流量越大，空氣在罐內停留時間短，氧的有效利用率下降，耗電量上升；罐外相對濕度一般為60%，出罐時100%，帶走水分，蒸發(fā)量大。（一）物理參數(shù)：

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制5、空氣濕度（尤其對固態(tài)發(fā)酵重要）濕度低，不易染菌，但太低，發(fā)酵液揮發(fā)速度上升，液體體積下降，不利于發(fā)酵。以空氣濕度60%利于發(fā)酵。（一）物理參數(shù)：

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制6、溶解氧濃度與氧的傳遞能力關：攪拌速率；發(fā)酵罐內的結構（擋板等）；料液黏度；發(fā)酵液本身攝氧率（一）物理參數(shù)：

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制7、發(fā)酵液的表觀黏度：表觀黏度越大，溶氧能力越弱與發(fā)酵液成分有關；與液化糖化程度有關；與菌體濃度，菌種種類（如有無莢膜）、菌種代謝特性有關；與噬菌體污染有關。（一）物理參數(shù)：

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制8、排氣中的氧含量和二氧化碳含量觀測微生物利用氧的情況，絕大多數(shù)微生物對氧的利用率為20%左右9、發(fā)酵液的OD值表示菌體的含量（例：微生物生長曲線測定）對清夜發(fā)酵而言。（一）物理參數(shù)：

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制1、基質濃度：糖濃度：還原糖——微生物直接利用的糖。氮濃度：氨基氮磷：無機磷轉化有機磷一般，碳、氮、磷等與反應中微生物生長、代謝物產量密切相關。殘?zhí)峭ǔ？煞从炒x物的濃度。一般而言，糖消耗率越大越好，但對于風味要求高的發(fā)酵食品，殘?zhí)抢诟纳聘泄倨焚|。（二）化學參數(shù)

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制2、pH值：關系到酶活和菌體生長。3、DNA的含量：

是細胞生長的真實參數(shù)，直到菌體自溶時才改變。當噬菌體侵染時也發(fā)生變化。4、代謝產物的濃度：

調節(jié)發(fā)酵條件，中止發(fā)酵與否通常由此參數(shù)檢測來定。（二）化學參數(shù)

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制1、菌體形態(tài)：能準確反應菌體生長情況及代謝產物形成情況。高活力的菌體形態(tài)均一，染色時著色較均勻。不同階段菌體形態(tài)有差異（三）生物參數(shù)

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制2、菌體干重（濕重、生物量）當培養(yǎng)基不含有不溶性物質時，可直接用離心分離，得到菌體干重當培養(yǎng)基含有不溶性物質時，可用密度梯度離心法對于清型發(fā)酵液，可用光密度反映菌體濃度，但不適于濃料，與基質本身的光密度有關（三）生物參數(shù)

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制3、菌體的比生長速率：即單位時間內單位菌體的增量。例如：t0=0時，x0=1g;t=5hrx=3g則比生長率=（3-1）/（5-0）=0.4克/克（菌）.小時（三）生物參數(shù)

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制4、氧的比消耗速率：糖的比消耗速率：氮的比消耗速率：5、代謝產物的比增長速率

單位時間內單位菌體所產生的產物量。（三）生物參數(shù)

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制

代謝曲線可以準確反映發(fā)酵過程各階段的代謝變化定義：代謝曲線是指以時間為橫坐標，以發(fā)酵過程中各參數(shù)為縱坐標用以反應發(fā)酵過程中各參數(shù)的變化情況。通過與典型代謝曲線的比較。通常可以判斷發(fā)酵進行是否正常。氧的臨界濃度：指不影響微生物呼吸強度的最低溶氧濃度。二、代謝變化和代謝曲線：

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制總糖下降，還原糖先升后降（說明酶解速度大于微生物利用葡萄糖的速度）溶氧濃度下降到臨界濃度，氮下降，菌體濃度上升至最高點產物尚未累積（一）菌體生長階段（前期）

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制

特征：菌體濃度基本恒定或略有增加；氧的比消耗速率較為恒定；可通過控制氮、磷、pH、溫度來抑制菌體生長，促進產物合成。產物合成速度持續(xù)上升，濃度達最大（二）產物合成階段

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制

特征：產物合成速度下降；由于菌體自溶釋放一些菌體物質，使pH上升，氨基氮上升。綜合以上特征，應在前期給與豐富的營養(yǎng)，中后期適當補料，為合成代謝產物提供營養(yǎng)，保證產物合成所需的酶量提高，當氨基氮回升時，不再補糖或少補糖。至菌體自溶解段必須結束發(fā)酵，否則可能發(fā)生產物降解（如抗生素等），還會給發(fā)酵液后處理帶來困難。（三）菌體衰亡階段

第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化第四章發(fā)酵代謝及其調節(jié)控制

第二節(jié)發(fā)酵過程控制主要控制的是碳、氮、水、pH、磷等（一）碳源濃度的變化及控制前期碳過高，滲透壓過大，不利生長；后期碳過高，會繼續(xù)生長，不利合成代謝產物；速效碳，利于菌體生長但過高易產生反饋抑制；緩效碳，利于次生代謝產物的產生，但一次投入太多，易使菌體老化。補碳常稱：“中間補糖”，可有效帶來發(fā)酵單位的上升。一、基質濃度的變化及其控制：第三節(jié)、發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵過程及控制第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制1、補糖時間：過早，刺激生長，次生代謝產物量下降過遲，整個系統(tǒng)能量跟不上，回復難，干擾代謝。所以，時間宜選擇還原糖從最高峰開始下降時補糖（補量不要超過原有最高量）（一）碳源濃度的變化及控制第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制2、補糖數(shù)量：以菌體濃度不增加或略增加為原則，當發(fā)酵已獲得菌體為目的時，可多加，但太多容易引起菌體自溶。3、補糖方式連續(xù)滴加流加法，少量多次間歇流加大量分次補糖無論何種方式，要防止不增加產物的現(xiàn)象出現(xiàn)。（一）碳源濃度的變化及控制第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制1、氮的作用：形成菌體蛋白、核酸、菌體代謝產物消長規(guī)律與糖基本相似；菌體自溶時，氮含量上升菌體營養(yǎng)所需的碳氮比一般發(fā)酵用的工業(yè)培養(yǎng)基，碳氮比為100：0.2-2Glu發(fā)酵：C：N=100：0.5-2時，僅菌體生長，幾乎無Glu合成C：N達100：11時，Glu開始合成C：N達100：15-21時，適于Glu合成極少情況下阻遏代謝產物的合成

（二）氮源濃度的變化及控制第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制2、氮源種類速效氮：緩效氮：3、控制：在基礎培養(yǎng)基中控制碳氮比（用于不含氮的代謝產物）發(fā)酵過程中補氮源一般原則：代謝產物含氮時，才需要補氮（二）氮源濃度的變化及控制第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制1、作用：是DNA、RNA、ATP的原料促進細胞的分裂、生長2、慎用往往容易抑制次生代謝物，特別是抗生素；會改變代謝途徑；抑制抗生素前體合成；抑制磷酸酯酶的活性及作用。（三）補磷第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制補無菌水因為菌體濃度上升，會造成缺氧，水用于提高溶氧。（四）補水：第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制一般，接種后宜適當提高培養(yǎng)溫度，利于孢子萌發(fā)或微生物生長繁殖。菌體大量增殖，溫度開始上升。主發(fā)酵期，溫度適當控制低些（比最適生長溫度）方式：夾套冷卻升濕、保溫——10T罐以下，小型罐盤管式冷卻升溫——10T以上，大型罐二、發(fā)酵過程溫度的控制第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制通常，1atm，25℃，（空氣中氧）在發(fā)酵液內的濃度為0.2mMol/L,攝氧量為10-50mMol/L.hr。無菌空氣的獲得：發(fā)酵設備的空氣系統(tǒng)三、溶氧的濃度及控制第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制發(fā)酵過程中溶解氧的變化初期：耗氧量大，氧濃度下降，菌體攝氧量達高峰；中后期，耗氧量較恒定，氧濃度變化較小；后期，呼吸強度下降，氧濃度上升。三、溶氧的濃度及控制第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制最適pH：細菌——6.5-7.5 霉菌——4.0-5.8 酵母——3.8-6.0pH影響發(fā)酵過程的機制影響酶的活性影響微生物細胞膜所帶電荷影響培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)物質和中間代謝產物的離解，從而影響微生物對其利用。四、pH的變化及控制第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制發(fā)酵過程pH變化： 菌體生長期，pH變化較大，因為微生物利用營養(yǎng)物質產生酸或堿，使pH下降或上升； 產物合成期，pH相對穩(wěn)定； 菌體自溶期，基質耗盡，蛋白酶活躍，氨基氮上升，pH上升四、pH的變化及控制第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制控制pH的方法:在基礎培養(yǎng)基內加入生理酸性或生理堿性物質 添加氮源物質，如尿素，氨水等；增加溶氧，提高攪拌速度（中間產物被氧化，pH上升）： 利用緩沖溶液配制緩沖能力強、pH變化不大的基礎培養(yǎng)基。四、pH的變化及控制第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制1、泡沫帶來的危害影響裝液量導致逃液，若密封較好，泡沫從排氣管排出，致染菌；若密封不好，沿軸上升，致污染；影響通氣攪拌的正常進行，從而妨礙菌的呼吸，造成代謝異常，導致產物減少和菌體過早自溶；影響后提取。五、泡沫的消除第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制2、泡沫的產生培養(yǎng)基成分：產生泡沫物質——蛋白胨、玉米漿、豆餅粉、酵母膏、發(fā)酵用水不清潔持泡物質——糖、淀粉糊精、菌體本身菌體本身有產生泡沫的作用，感染噬菌體或雜菌污染時泡沫更多機械攪拌五、泡沫的消除第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制3、消泡物理法：改變溫度法——改變泡沫、黏度或彈性→泡沫破裂，工業(yè)上少用機械法：罐內消泡法——利用消泡漿（碟片式、耙式）罐外消泡法——利用旋風分離器分離氣體、液體、無氣體入缸化學消泡法：消泡劑五、泡沫的消除第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制A.消泡劑特點及要求：表面活性劑：泡沫本身表面張力比較低，泡沫表面張力平衡被打破在氣液界面上具有足夠大的鋪展性能和一定的親水性；在水中的溶解度極小，以便長久消泡功能；無菌、安全，對菌體代謝沒有影響，不影響提?。粊碓捶奖悖瑑r格便宜。五、泡沫的消除第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制B.常用消泡劑天然油脂：豆油、菜油、花生油，主要用精煉油。缺點：不含親水基團，不易鋪展用量：1‰-2‰聚醚類：優(yōu)點:不易揮發(fā)，穩(wěn)定性高；用量：萬分之一至萬分之三GP:用于稀發(fā)酵液GPE:消泡能力強，但作用時間短，用于稠液一般將GPE與植物油混用五、泡沫的消除第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制醇類：正十一醇、聚二醇（霉菌發(fā)酵用）硅酮類：須與分散劑（微晶二氧化硅）一起使用才行聚二甲基硅氧烷及其衍生物增效措施：a.將泡敵與豆油1：1.5混合使用，效果較好b.將泡敵、玉米油和水比例1:1.5:9五、泡沫的消除第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制

合理判斷對提高發(fā)酵單位時間內產量和質量有很大影響，不同類型發(fā)酵達到終點目標不同，因而對發(fā)酵終點判斷也不同放罐前的補料：根據(jù)糖的消耗速率，計算到放罐時允許殘留量。一般：

40~50噸罐，放罐前10小時不能補料；大于90噸罐，放罐前16小時不能補料六、發(fā)酵終點的判斷第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制1、確定放罐時間。放罐過早：原料利用率不高，浪費影響終產物提取（因為有許多糖、脂肪、蛋白質、微生物殘留）縮短了產物合成期，總產量下降放罐過遲：增加單位產品的原料的能耗由于菌體自溶影響過濾及產品提取代謝產物分解六、發(fā)酵終點的判斷：第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制2、判斷放罐指標:產物的產量增加率開始下降（產物量/體積.小時稱增長率）菌體形態(tài)出現(xiàn)衰老（胞內出現(xiàn)顆粒），部分菌體出現(xiàn)自溶；過濾速度明顯下降（用移液管吸取發(fā)酵液看其流出時間）殘?zhí)堑?，還原糖<0.5%；氨基氮上升，pH上升培養(yǎng)液的外觀和黏度等：菌絲碎片增加，黏度增加六、發(fā)酵終點的判斷：第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制3、放罐標準產物的產量后提取的收率設備的利用率能源的消耗率資金的周轉率六、發(fā)酵終點的判斷：第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制

定義：發(fā)酵過程中，生產菌以外的其他微生物侵入了發(fā)酵培養(yǎng)液均稱為雜菌污染，無菌檢查則是用顯微鏡檢查，微生物培養(yǎng)檢查等發(fā)現(xiàn)分析是否染菌及染菌的根本原因。七、無菌檢查及異常發(fā)酵的處理第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制1、無菌檢查的方法：顯微鏡檢查法：革蘭氏染色，顯微鏡觀察，據(jù)形態(tài)特征辨別是否有染菌存在平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法培養(yǎng)基平板→37℃，24hr（無菌）→劃線→37℃，27℃各培養(yǎng)8hr后觀察有無雜菌。七、無菌檢查及異常發(fā)酵的處理第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制肉湯培養(yǎng)檢查法（酚紅肉湯培養(yǎng)基，每隔2-3小時，抽樣，37℃，6小時看培養(yǎng)基變黃或混濁→染菌）常用于檢查培養(yǎng)基和無菌空氣是否帶菌或是否被噬菌體污染還可以發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象來判斷是否染菌，如溶解氧，pH值、排氣中二氧化碳含量和菌體酶活的變化來判斷。七、無菌檢查及異常發(fā)酵的處理第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制2、發(fā)酵染菌率的計算：是指一年內發(fā)酵染菌的批數(shù)與總投料發(fā)酵批數(shù)之比總染菌率=發(fā)酵染菌批數(shù)/總投料批數(shù)*100%降至2%之下七、無菌檢查及異常發(fā)酵的處理第二節(jié)發(fā)酵過程調節(jié)控制第四章發(fā)酵代謝及調節(jié)控制1、種子帶菌引起污染9.64%2、培養(yǎng)基未滅好引起0.79%3、總過濾器失效19.96%4、泡沫沖入軸封內0.48%5、夾套和盤管穿孔12.36%6、接種管0.39%7、閥門滲漏0.45%8、軸封密封不好2.09%9、罐滅滲漏1.54%10、其他設備