蛋白質(zhì)與酶工程酶的提取分離和純化

蛋白質(zhì)與酶工程酶的提取、分離和純化檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院張雪梅當(dāng)前1頁，總共85頁。一、概述二、酶的提取三、酶的分離純化四、酶的結(jié)晶五、濃縮與干燥六、酶純化步驟的設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)酶的提取、分離和純化當(dāng)前2頁，總共85頁。一、概述1-1酶提取與分離純化的定義

將酶從細(xì)胞或其它含酶原料中提取出來，再與其它物質(zhì)分開，從而獲得所需酶的技術(shù)過程*酶的純化程度根據(jù)需要而定*純化方法多種多樣，為獲得較好的效果往往是2種或2種以上聯(lián)合應(yīng)用

當(dāng)前3頁，總共85頁。1-2提取純化之目的1)酶催化功能的應(yīng)用2)酶學(xué)研究

酶的結(jié)構(gòu)、功能、催化機(jī)制、催化動(dòng)力學(xué)酶的生物合成及其調(diào)控規(guī)律等

1-3純化的必要性1)生物細(xì)胞中同時(shí)存在多種多樣的酶2)多酶可能作用于同一個(gè)底物3)酶在生物細(xì)胞中的分布并不是均一的當(dāng)前4頁，總共85頁。二、酶的提?。╡xtraction)2-1了解所分離酶在細(xì)胞中的分布

1、細(xì)胞外酶：由細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到胞外發(fā)揮作用的酶；大多屬于水解酶，通常含量高，容易得到2、細(xì)胞內(nèi)酶：在細(xì)胞內(nèi)合成后并不分泌到細(xì)胞外，而在細(xì)胞內(nèi)起催化作用。該類酶在細(xì)胞內(nèi)往往與細(xì)胞器結(jié)合，不僅有一定的區(qū)域性，而且催化的反應(yīng)具有一定順序性

當(dāng)前5頁，總共85頁。真核細(xì)胞內(nèi)酶的分布①細(xì)胞膜：ATP酶、腺苷酸環(huán)化酶等②細(xì)胞核：DNA聚合酶、連接酶和RNA聚合酶等③線粒體：三羧酸循環(huán)、電子傳遞、氧化磷酸化、尿素循環(huán)、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白質(zhì)合成、DNA聚合酶、RNA聚合酶等④高爾基體：多糖、核蛋白粘液生成酶⑤溶酶體：各種水解酶等⑥葉綠體：參與光合作用形成ATP、NADPH有關(guān)的酶類、與暗反應(yīng)有關(guān)的酶系當(dāng)前6頁，總共85頁。線粒體主要酶的分布（約有120種酶）部位酶的名稱外膜單胺氧化酶、犬尿氨酸羥化酶、NADH-細(xì)胞色素C還原酶、脂類代謝有關(guān)的酶（?；o酶A合成酶、脂肪酸激酶等）特征酶：單胺氧化酶膜間隙腺苷酸激酶、核苷酸激酶、二磷酸激酶、亞硫酸氧化酶特征酶：腺苷酸激酶內(nèi)膜細(xì)胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶、NADH脫氫酶、肉堿?；D(zhuǎn)移酶、-羥丁酸和-羥丙酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、ATP合成酶系、腺嘌呤核苷酸載體特征酶：細(xì)胞色素（c）氧化酶基質(zhì)檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、延胡索酸酶、谷氨酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)和核酸合成酶系、脂肪酸氧化酶系特征酶：蘋果酸脫氫酶當(dāng)前7頁，總共85頁。2-2起始材料的選擇

原則：選取酶含量高的材料可以是天然的動(dòng)植物

或人工培養(yǎng)的微生物、動(dòng)植物細(xì)胞等

*注意材料的生長階段*注意酶在生物體內(nèi)的富集區(qū)域由于從動(dòng)物內(nèi)臟或植物果實(shí)中提取酶制劑受到原料和成本的限制，因此，目前工業(yè)上大多采用培養(yǎng)微生物的方法來獲得大量的酶制劑當(dāng)前8頁，總共85頁。2-3細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的破碎1、主要方法：當(dāng)前9頁，總共85頁。1）當(dāng)前10頁，總共85頁。當(dāng)前11頁，總共85頁。2）當(dāng)前12頁，總共85頁。當(dāng)前13頁，總共85頁。超聲波破碎法當(dāng)前14頁，總共85頁。3）當(dāng)前15頁，總共85頁。4）當(dāng)前16頁，總共85頁。2、選擇原則如酶法+超聲當(dāng)前17頁，總共85頁。

2-4酶的提取

1、定義

在適當(dāng)條件下，用適當(dāng)?shù)奶崛∫禾幚砗冈希姑赋浞秩苡谄渲械倪^程。

2、提取液的選擇

根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解特性來選擇適當(dāng)?shù)奶崛∫?/p>

*極性物質(zhì)易溶解于極性溶劑，反之，即相似相溶*酸性物質(zhì)易溶解于堿性溶液，反之亦然。當(dāng)前18頁，總共85頁。2-4酶的提取3、常用的提取液：酶通常都溶于水，因此通常用水作為溶劑，配制成一定濃度的稀酸、稀堿、稀鹽溶液進(jìn)行抽提4、有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑抽提，如：丙酮粉，有助于酶與脂肪或磷脂膜分離；高離子強(qiáng)度水溶液也有助于酶從結(jié)合的膜上解析下來。當(dāng)前19頁，總共85頁。2-5主要的提取方法1、鹽溶液提取該法用于在低濃度鹽溶液中溶解度大的酶的提取常用的鹽濃度：0.02-0.05mol/L，大多數(shù)P酶用該法提取

R酶常用0.14mol/L的NaCl溶液提取。

*鹽溶現(xiàn)象：低鹽條件下，酶在水中的溶解度隨鹽濃度升高而增加的現(xiàn)象

*鹽析現(xiàn)象：當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定界限后，酶的溶解度則隨鹽濃度升高而降低的現(xiàn)象當(dāng)前20頁，總共85頁。2、酸溶液提取

在酸性條件下溶解度大并穩(wěn)定的酶可用此法如：胰蛋白酶（pI=8.9）可用0.12mol/L的硫酸溶液3、堿溶液提取在堿性條件下溶解度大并穩(wěn)定的酶該法適用如：大腸埃希菌的L-天冬酰胺酶（pI=4.85）可用pH11-12.5的溶液當(dāng)前21頁，總共85頁。

4、有機(jī)溶劑提?。喝缑概c脂質(zhì)結(jié)合牢固，或含有較多非極性基團(tuán)的酶，可用與水混溶的有機(jī)溶劑（乙醇、丙酮、丁醇等），如：

P酶：膽堿酯酶、細(xì)胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶等用丁醇萃取，有較好效果

R酶：可用酸苯酚溶液提取當(dāng)前22頁，總共85頁。主要的提取方法小結(jié)地當(dāng)前23頁，總共85頁。5、影響酶提取的其它重要因素溫度：適當(dāng)提高，可以提高酶的溶解度和酶分子的擴(kuò)散速度；過高則引起酶失活pH:

在等電點(diǎn)條件下，酶的溶解度最?。粸樘岣呷芙舛?，要避開酶的等電點(diǎn);但是，也不宜偏離pI太遠(yuǎn)（過高或過低），以免引起酶變性失活當(dāng)前24頁，總共85頁。提取液體積

*適當(dāng)增加其體積，可以提高酶的產(chǎn)率*過量，則降低[酶]，增加后續(xù)分離純化的難度一般為原始材料的3-5倍，且分3次使用

加入保護(hù)劑，以提高酶的穩(wěn)定性如酶的底物、輔酶和某些抗氧化劑當(dāng)前25頁，總共85頁。三、酶的分離純化

（isolation,separation)(purification)3-1分離純化方法分類1、基于分子大小或質(zhì)量

(1)離心(2)透析(3)凝膠過濾(4)超過濾2、基于電荷

(1)離子交換色譜(2)電泳(3)等電聚焦當(dāng)前26頁，總共85頁。3、基于溶解度

改變pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)等實(shí)現(xiàn)的沉淀分離：

(1)鹽析法(2)復(fù)合沉淀法(3)有機(jī)溶劑沉淀法(4)等電點(diǎn)沉淀法(5)選擇性變性沉淀法當(dāng)前27頁，總共85頁。4、基于特異性結(jié)合位置/親和力的差異

親和色譜（層析）5、其它方法（略）（1）基于分配系數(shù)的差異：雙水相系統(tǒng)萃取法（2）基于疏水作用的差異：疏水層析（3）在磷酸鈣凝膠柱上分級(jí)吸附（4）羥基磷灰石色譜（5）冷凍干燥（濃縮）當(dāng)前28頁，總共85頁。1、沉淀分離3-2常用的分離純化方法當(dāng)前29頁，總共85頁。取正常人血清5ml加等量生理鹽水混勻攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨使飽和度為20％

↓4℃，10min離心(3000rpm),10min，棄沉淀上清繼續(xù)滴加飽和硫酸銨使飽和度為50％。

↓置4℃，3小時(shí)以上離心(3000rpm),10min，棄上清所得沉淀物以0.02MPH7.4PBS溶解至5ml↓裝入透析袋中對(duì)PBS充分透析（換液3次）

↓萘氏試劑測(cè)透析外液無黃色

取少許透析袋液適當(dāng)倍數(shù)稀釋后，測(cè)蛋白含量。例鹽析純化血清免疫球蛋白當(dāng)前30頁，總共85頁。2、離心（centrifugation)（1）定義：利用離心機(jī)旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的顆粒分離的技術(shù)過程。*優(yōu)點(diǎn)：處理量大，可達(dá)幾升*離心條件的選擇：以靶酶與雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的差異為依據(jù)，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件當(dāng)前31頁，總共85頁。常速/低速離心機(jī)：主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)扔行挝镔|(zhì)分離，也可分離較大顆粒的酶結(jié)晶分離；高速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速1~2.5x104rpm。在酶的分離中，主要用于沉淀及細(xì)胞碎片和細(xì)胞器的分離；為防止離心過程中溫度升高而致酶失活，一般用高速冷凍離心機(jī)；超速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速達(dá)2.5~12x104rpm。主要用于DNA、RNA（酶）、蛋白質(zhì)(酶）等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化等。（2）離心機(jī)的常用分類當(dāng)前32頁，總共85頁。當(dāng)前33頁，總共85頁。當(dāng)前34頁，總共85頁。

①差速離心（differentialcentrifugation)：即采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使不同沉降速度的顆粒分批分離。主要用于分離那些差異大的顆粒；操作簡單、方便，但是分離效果較差，一般用于粗分。（3）離心方法的選擇當(dāng)前35頁，總共85頁。

差速離心舉例沉淀：細(xì)胞核上清液沉淀：線粒體溶酶體細(xì)胞膜碎片上清液沉淀：核糖核蛋白體上清液：可溶性成分500g,10min已經(jīng)破碎的細(xì)胞10,000g,10min100,000g,3h當(dāng)前36頁，總共85頁。

②密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，通過重力或離心力場(chǎng)的作用，使樣品中的組份依據(jù)其沉降速率和密度的不同而分層、分離這類分離又分為：

差速-區(qū)帶（Rate—Zonal，R-Z）等密度（Isopycnic）/平衡密度梯度離心當(dāng)前37頁，總共85頁。A.差速-區(qū)帶(R-Z)：是根據(jù)分離的顆粒在梯度液中沉降速度的不同，在離心力作用下處于不同密度梯度層，從而形成一系列區(qū)帶，達(dá)到彼此分離的目的。

方法：在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、CsCl等），待分離的樣品以很薄的一層鋪在梯度液的上部，在離心過程中由于不同組份在梯度液中沉降速率的差別，而在離心的某一時(shí)刻形成了數(shù)個(gè)分別含不同組份顆粒的區(qū)帶。當(dāng)前38頁，總共85頁。B.平衡密度梯度離心法（equilibriumdensitygradientcentrifigation)/等密度梯度離心法當(dāng)欲分離的不同顆粒的

密度不同時(shí)，配制包含其密度范圍的離心介質(zhì)，在離心力作用下，不同浮力密度的顆粒或沉降、或上浮，只要時(shí)間足夠長，就可以一直移動(dòng)到與它們各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度點(diǎn)），形成區(qū)帶，從而實(shí)現(xiàn)分離目的

常用介質(zhì)：銫鹽（氯化銫，硫酸銫，溴化銫等）當(dāng)前39頁，總共85頁。

（4）注意離心溫度和介質(zhì)pH的影響，以免目的酶凝集、變性和失活，甚至引起轉(zhuǎn)子和離心機(jī)其它部件的腐蝕。

*一般4℃左右，耐熱酶除外*必須是酶穩(wěn)定的范圍內(nèi)，必要時(shí)采用緩沖液當(dāng)前40頁，總共85頁。3、過濾與膜分離當(dāng)前41頁，總共85頁。當(dāng)前42頁，總共85頁。當(dāng)前43頁，總共85頁。（1）透析

透析（dialysis)：利用小分子物質(zhì)的擴(kuò)散作用，使小分子不斷透過半透膜而擴(kuò)散到膜外，而大分子則被截留于膜內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)分離。用途：去除酶液中無機(jī)鹽、有機(jī)溶劑或低分子量的抑制劑缺點(diǎn)：耗時(shí)；透析結(jié)束后，樣品體積大，濃度低，難于工業(yè)化生產(chǎn)

透析膜是帶有微孔的篩子，其孔徑在一定范圍內(nèi)是可選的；可用動(dòng)物膜、羊皮紙、火棉膠等制成。當(dāng)前44頁，總共85頁。定義：以膜兩邊的流體靜壓差為推動(dòng)力的膜分離技術(shù)。在靜壓差作用下，小于孔徑的顆粒穿過膜孔，而大于孔徑者被截留。超濾膜截留的顆粒直徑為2--200nm，相等于分子量1x103-5x105，主要用于病毒和各種生物大分子的分離。（2）超濾（ultrafiltration)

當(dāng)前45頁，總共85頁。

超濾技術(shù)的優(yōu)勢(shì)：是純物理過程，不會(huì)改變產(chǎn)品的理化性能和活性與離心和層析法比，處理量大，時(shí)間短，易線性放大，成本較低收集細(xì)胞效果優(yōu)良，處理量大，保持細(xì)胞活性良好，操作簡單可以進(jìn)行多種工藝的處理，如：細(xì)胞、菌體收集、破碎后的澄清過濾、分離、濃縮、緩沖液更換等投資小，通用性強(qiáng)當(dāng)前46頁，總共85頁。超濾技術(shù)應(yīng)用：

濃縮和透析除熱源脫鹽和緩沖液交換小分子處理細(xì)胞收集/澄清病毒收集/澄清當(dāng)前47頁，總共85頁。4、色譜法（層析法）當(dāng)前48頁，總共85頁。（1）離子交換色譜（層析）定義：

IonExchangeChromatography：以離子交換劑為固定相，特定的離子溶液為流動(dòng)相，依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同進(jìn)行分離純化的層析方式。使用規(guī)?？纱罂尚?；純化倍數(shù)為10左右當(dāng)前49頁，總共85頁。離子交換劑分類

①按其活性基團(tuán)的不同來分

*陽離子交換劑：其活性基團(tuán)為酸性基團(tuán)（如磺酸基，磷酸基，羧基等），在一定條件下，可以解離出氫離子（H+)與其它陽離子進(jìn)行交換，故稱（如：

*陰離子交換劑：其活性基團(tuán)為堿性基團(tuán)（季胺，叔胺，仲胺，伯胺等），在一定條件下可解離出OH-與其它陰離子交換。如：當(dāng)前50頁，總共85頁。

②按母體的種類分：母體（基質(zhì)）一般是不溶性聚合物，如樹脂、纖維素、葡聚糖、醇脂糖等

*離子交換纖維素:是纖維素作為母體，交換容量大（0.2-1.0mg/克干膠）*離子交換樹脂:聚苯乙烯樹脂為母體*離子交換凝膠:葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠為母體，交換容量更大2.5-4.5mg/克干膠）當(dāng)前51頁，總共85頁。離子交換層析的基本步驟當(dāng)前52頁，總共85頁。解吸方法--洗脫原理

蛋白質(zhì)是通過靜電引力可逆結(jié)合在相應(yīng)的離子交換劑上，洗脫蛋白質(zhì)（即打開蛋白質(zhì)與離子交換劑之間的離子鍵）的常用方法：

①加大反離子的濃度，常用的反離子是NaCl

②改變?nèi)芤旱膒H

（改變結(jié)合基團(tuán)的電荷）

③同時(shí)改變pH與離子強(qiáng)度當(dāng)前53頁，總共85頁。分離酶蛋白時(shí)交換劑選擇的一般原則：

根據(jù)酶穩(wěn)定性的需要：

*酶蛋白穩(wěn)定存在的pH<pI，用陽離子交換劑*酶蛋白穩(wěn)定存在的pH>pI，用陰離子交換劑*兩種pH條件下均能穩(wěn)定存在，二種交換劑均可當(dāng)前54頁，總共85頁。

也稱凝膠層析、凝膠過濾或分子排阻層析：是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含有各種組份的相對(duì)分子量不同而達(dá)到分離的一種層析技術(shù)

20世紀(jì)50年代末發(fā)展起來的快速簡便的分離技術(shù)—操作簡便，不需要再生處理即可反復(fù)使用，適用于分子量不同的各種物質(zhì)的分離（2）分子篩層析當(dāng)前55頁，總共85頁。原理：

其分離是因?yàn)椴煌笮〉姆肿踊蜻M(jìn)入或不進(jìn)入凝膠微孔，因而所經(jīng)過的路程不同、走過柱全長所需的時(shí)間各異，實(shí)現(xiàn)彼此分離的目的：能進(jìn)入微孔的小分子不斷地進(jìn)出于一個(gè)個(gè)凝膠顆粒的微孔，做無定向的分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)（布朗運(yùn)動(dòng)），因而其向下移動(dòng)的速度就很慢；不能進(jìn)入微孔的大分子則只能分布于凝膠顆粒的間隙，隨溶液流動(dòng)而進(jìn)行垂直向下的移動(dòng)，以較快的速度通過凝膠柱。當(dāng)前56頁，總共85頁。當(dāng)前57頁，總共85頁。凝膠材料種類層析用的微孔凝膠是凝膠材料與交聯(lián)劑交聯(lián)聚合而成的；凝膠內(nèi)部具有微細(xì)的、多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。*常用的交聯(lián)劑：環(huán)氧氯丙烷*常用的凝膠材料：葡聚糖凝膠（SephadexG）交聯(lián)丙烯基葡聚糖（Sephacryl）聚丙烯酰胺凝膠（Bio-gelP）瓊脂糖凝膠（Sepharose)

*新型凝膠材料：superose，superdex

*分離性能：凝膠孔徑大小決定其能夠分離的顆粒的大??；凝膠顆粒越細(xì)，流速越慢，分離效果越好。

當(dāng)前58頁，總共85頁。相對(duì)分子量不是唯一的分離依據(jù)；

對(duì)于分子量相同的分子，也可依據(jù)其分子形狀的不同，再加上各種物質(zhì)與凝膠之間的非特異性吸附作用的差異，也可以分離。當(dāng)前59頁，總共85頁。分子篩層析的優(yōu)缺點(diǎn)當(dāng)前60頁，總共85頁。（3）親和色譜(層析）（1）定義：利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，分離純化生物分子的技術(shù)，是酶分離純化的重要技術(shù)

專一而可逆的結(jié)合包括：酶蛋白與底物、競爭性抑制物和輔助因子酶蛋白（抗原）與抗體酶RNA與互補(bǔ)的RNA當(dāng)前61頁，總共85頁。

（2）原理：

酶的底物或競爭性抑制劑等通過共價(jià)鍵與惰性載體（如瓊脂糖）相連接，形成親和載體；當(dāng)含酶混合物通過親和載體時(shí)，靶酶便與底物或競爭性抑制劑發(fā)生特異性結(jié)合，保留在柱子上，其它酶和雜蛋白則因“無處可依”而被洗出柱子

最后通過解吸附，將酶洗脫：

*通過加入底物與親和載體競爭酶分子*也可改變pH或離子強(qiáng)度使結(jié)合的酶解吸當(dāng)前62頁，總共85頁。（3）特點(diǎn)①因其結(jié)合的專一性，所以產(chǎn)品的純度高②步驟少③親和載體的制備較難④造價(jià)高、規(guī)模小當(dāng)前63頁，總共85頁。四、酶的結(jié)晶4-1定義：溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程，是酶分離純化的手段之一

時(shí)間可以從幾小時(shí)，幾天，幾個(gè)月，甚至幾年。為獲得較高純度的酶創(chuàng)造了條件。為酶結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了適宜的樣品；

當(dāng)前64頁，總共85頁。Artorscience？當(dāng)前65頁，總共85頁。1、鹽析結(jié)晶法：在適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H條件下，于接近飽和的酶液中緩慢增加某種中性鹽的濃度，使酶的溶解度慢慢降低，達(dá)到稍微過飽和狀態(tài)，而析出酶晶體的過程;多用硫酸銨，也用硫酸鈉等4-2結(jié)晶方法當(dāng)前66頁，總共85頁。

通過汽相擴(kuò)散的方式增加鹽濃度，使蛋白析出結(jié)晶。使用的試劑盒為商品化的HamptonResearchCrystalScreenI&II和PEGScreen篩選試劑盒進(jìn)行，分別采用懸滴法和坐滴法。SP0987、SPD0280蛋白質(zhì)的結(jié)晶SP0987在0.2M檸檬酸鋰、20%PEG3350條件晶體質(zhì)量較好SPD0280在0.2M硫酸鎂、20%PEG3350條件下晶體質(zhì)量較好當(dāng)前67頁，總共85頁。圖3SPD0280蛋白質(zhì)母體晶體圖4SPD0280蛋白質(zhì)硒代晶體

圖1SP0987蛋白質(zhì)母體晶體圖2SP0987蛋白質(zhì)硒代晶體

當(dāng)前68頁，總共85頁。2、有機(jī)溶劑結(jié)晶法：是在接近飽和的酶液中慢慢加入某種有機(jī)溶劑，使酶的溶解度降低而析出酶晶體的過程；常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙醇、甲醇等3、透析平衡結(jié)晶法：將酶液裝進(jìn)透析袋，對(duì)一定濃度的鹽溶液進(jìn)行透析，使酶液逐漸達(dá)到飽和態(tài)而析出結(jié)晶的過程4、等電點(diǎn)結(jié)晶法：是通過緩慢改變酶液的pH，使之逐漸達(dá)到其等電點(diǎn)，而使酶析出結(jié)晶的過程當(dāng)前69頁，總共85頁。

五、酶的濃縮與干燥

濃縮（concentration)與干燥（Drying)都是酶與溶劑（通常是水）分離的技術(shù)過程，是酶分離純化的一個(gè)重要環(huán)節(jié)1、濃縮：是從低濃度溶液中除去水分或其它溶劑而成為高濃度溶液的過程

蒸發(fā)濃縮，即通過加熱或減壓方法使溶液中的部分溶劑汽化蒸發(fā)，得以濃縮：真空蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器真空蒸發(fā)器薄膜蒸發(fā)器當(dāng)前70頁，總共85頁。2、干燥：將固體、半固體或濃縮液中的水分或其它溶劑除去一部分，獲得含水較少的固體物質(zhì)的過程干燥時(shí)，首先是從其表面蒸發(fā)，隨后才是其內(nèi)部的水分子擴(kuò)散到表面繼續(xù)蒸發(fā)。干燥后的物質(zhì)穩(wěn)定性好，利于保存、運(yùn)輸和使用

常用的方法：真空干燥冷凍干燥噴霧干燥氣流干燥吸附干燥等

獲得的酶質(zhì)量最高的是冷凍干燥當(dāng)前71頁，總共85頁。3、酶的保存

在合適的條件下，酶一般可保存較長的時(shí)間。在4℃下，可將酶懸浮在濃硫酸銨或PEG溶液中保存，10mg/ml的濃酶液可加入25%～50%甘油保存可將酶液過濾除菌，以減少微生物降解作用需還原性巰基維持催化活性的酶，可與1mmol.L-1EDTA和還原性巰基試劑一起在液氮中保存許多酶在冰凍狀態(tài)下保存得很好當(dāng)前72頁，總共85頁。1、防止酶變性失活：（1）低溫（2）一般在中性pH環(huán)境操作（pH<4或>10不穩(wěn)定）（3）防重金屬,有機(jī)溶劑,微生物及蛋白酶污染2、追蹤酶分離每一步的總活力和比活力，評(píng)判每個(gè)步驟的可行性。6-1酶分離純化的基本原則六、酶純化步驟的設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)當(dāng)前73頁，總共85頁。6-2選擇純化方法時(shí)注意事項(xiàng)1、樣品體積、酶和雜質(zhì)的量、pH及離子強(qiáng)度2、酶的物理化學(xué)性質(zhì)：大小、等電點(diǎn)、溶解度、親水性3、需要純化的酶的生物學(xué)性質(zhì)：穩(wěn)定性、輔助因子當(dāng)前74頁，總共85頁。6-3分離方法的順序選擇樣品量由大到小分辨率由低到高酶的回收率由低到高預(yù)處理-→粗分-→細(xì)分-→酶的制品當(dāng)前75頁，總共85頁。粗分：初步純化細(xì)分1細(xì)分2檢查純化的進(jìn)展情況有機(jī)溶劑、硫酸銨沉淀、磷酸鈣分級(jí)吸附、超濾等離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析、聚焦層析等SDS電泳、等電聚焦當(dāng)前76頁，總共85頁。6-4純化步驟的定量評(píng)價(jià)測(cè)定試樣中酶的活力和蛋白質(zhì)濃度計(jì)算比活力制作純化表酶單位/mg蛋白質(zhì)當(dāng)前77頁，總共85頁。酶活性及比活性測(cè)定酶的活性是指酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力，其衡量的標(biāo)準(zhǔn)是酶促反應(yīng)速度。酶的活性單位是衡量酶活力大小的尺度，它反映在規(guī)定條件下，酶促反應(yīng)在單位時(shí)間（s、min或h）內(nèi)生成一定量（mg、μg、μmol等）的產(chǎn)物或消耗一定數(shù)量的底物所需的酶量。

酶活性測(cè)定的目的：反映組織、體液或提純?nèi)芤褐忻傅拇嬖谂c多寡（含量鑒定）。當(dāng)前78頁，總共85頁。國際單位(IU)在特定的條件下，每分鐘催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為