抗體效價(jià)的Elisa測定課件

實(shí)驗(yàn)五

酶聯(lián)免疫吸附測定BSA抗體效價(jià)

1.目的要求(1)學(xué)習(xí)酶聯(lián)免疫吸附測定的基本原理。(2)掌握酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)，抗體的效價(jià)測定及酶聯(lián)免疫測定儀的使用。

2.基本原理免疫酶技術(shù):酶標(biāo)Ab/Ag,酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后，作用于厎物后顯色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定量測定Ab/Ag。免疫反應(yīng)：一次或數(shù)次具Ag,Ab特異的免疫學(xué)反應(yīng)酶促反應(yīng)：只進(jìn)行一次

顯示出生物放大作用，靈敏度ng,pg60年代初期，Averameas&Ram等建立了免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)

利用特殊的交聯(lián)劑研制出辣根過氧化物酶---人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶---抗體，統(tǒng)稱為酶標(biāo)記物或酶結(jié)合物，用于抗原或抗體的示蹤、定位或定量測定1974年Voller等用聚苯乙烯微量反應(yīng)板作為免疫吸附劑吸附抗體(抗原)，再與相應(yīng)的酶標(biāo)記物結(jié)合操作更方便，易重復(fù)靈敏度可高達(dá)ng（10-9g）至pg(10-12g)，(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)免疫標(biāo)記技術(shù)酶------性能穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)易得、底物無色、產(chǎn)物顯色，便于檢測常用的酶:堿性磷酸酯酶、辣根過氧化物酶(horseradperoxidase簡稱HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。酶標(biāo)技術(shù)戊二醛法，過碘酸氧化法將酶與Ab交聯(lián)在一起Ag-Ab-抗Ab-HRPTMB+H2O2產(chǎn)物（黃色，OD450)+H2O圖一直接型Elisa

圖三雙抗體夾心型ELISA圖四固相抗體競爭型ELISA未知抗原量=A（1）-A（2）每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌？保證反應(yīng)的定量反應(yīng)防止重疊反應(yīng)，引起非特異現(xiàn)象。Partiallypurified,inactivatedHIVantigensantigenspre-coatedontoanELISAplate部分純化，滅活病毒抗原抗原涂到酶標(biāo)板Patientserumwhichcontainsantibodies.IfthepatientisHIV+,thenthisserumwillcontainantibodiestoHIV,andthoseantibodieswillbindtotheHIVantigensontheplate.病人血清中含有抗體。如果病人是艾滋病毒+，那么這個(gè)血清含有艾滋病毒抗體，這些抗體可以綁定到病毒抗原板Anti-humanimmunoglobulincoupledtoanenzyme.Thisisthesecondantibody,anditbindstohumanantibodies.抗人免疫球蛋白耦合酶。這是繼抗體，并結(jié)合人類抗體

substratewhichchangescolorwhencleavedbytheenzymeattachedtothesecondantibody.基板而改變顏色，當(dāng)裂解酶附二抗體HIV(humanimmunodeficiencyvirus)detectionpositivenegative2.CompetitiveelisasameepitopeCoatwithbaitprIncubatewithprimaryantibodyantibaitprandvariousconcentrationpreyprotein(競爭同一表位。外套與誘餌蛋白培養(yǎng)初級抗體抗誘餌蛋白及不同濃度的獵物蛋白)4.操作方法4.1包被特異性抗原:固體抗原(如蛋白質(zhì))用包被液稀釋至10Oμg/ml，每凹孔加100μL，加蓋置4℃過夜(37℃2h)，次日傾去凹孔內(nèi)液體，用滴管取洗滌液在每孔中加3～4滴，靜置3min后傾去，重復(fù)3次，將反應(yīng)板扣放在濾紙上，以除凈液體。4.2封閉:每孔中加入200－400μL封閉液，加蓋或用封口膜封板，置37℃恒溫箱60min，傾去孔內(nèi)液體，按上法洗滌3次。12345678PBS/Tween1:100陰性血清1:1,0001:5,0001:10,0001:20,0001:50,0001:100,000陽性血清4.4加酶標(biāo)抗體:按說明書要求用稀釋液稀釋HRP-抗體(抗抗體)，每孔加l00μL，封板后置37℃溫育lh，按上法至少洗滌5次，最后用蒸餾水洗滌2次，扣在濾紙上吸干水分。4.5顯色:每孔加入OPD應(yīng)用液1OOuL、反應(yīng)板置室溫暗處5～30min。當(dāng)顯示橙色時(shí)應(yīng)及時(shí)終止反應(yīng)。4.6終止反應(yīng):每孔加入5OμL2mol/LH2SO4。穩(wěn)定3～5min即可比色測定。自動酶標(biāo)儀（Elx800UV）使用程序1開機(jī)，進(jìn)行Systemself-test…2按“DEFINE”鍵，進(jìn)入“SELECTASSAYNUMBER”，用“NUMERIC”或“OPTION”鍵輸入測試號（注：assay01為quickread，最大測試號為55）；按“ENTER”鍵修改測試的“NAME”；再按“ENTER”鍵進(jìn)入下列菜單：按“METHOD”鍵選擇測試的波長類型（Single或Dual）、波長大小(340、405、450、490或630nm)、微孔板類型(96孔、48孔或24孔)。按“MAP”鍵選擇閱讀方式(Auto或Manual)、閱讀方向（Down或Across）、重復(fù)方向（Down或Across）、閱讀起始位置（輸入編號）、空白Map（Air、Full、Const、Column、P-Down、P-Across）。3按“READ”鍵，酶標(biāo)板推進(jìn)入儀器，開始讀數(shù)并計(jì)數(shù)，打印機(jī)輸出數(shù)據(jù)。4按“MAINMENU”鍵回到主菜單，關(guān)閉電源。

酶標(biāo)板的清洗：采用ELx50TM型微孔板洗板機(jī)，注射泵驅(qū)動的液體輸送，條狀單排清洗或全板清洗

了解轉(zhuǎn)膜電泳原理的應(yīng)用及操作WesternBlottingorimmunoblottingaspecificprimaryantibody1979,Towbin1975,Southern,Southernblotting1977,Alwine,Northernblotting1979,Towbin,WesternBlotting1982,Reihart,Easternblotting,雙向蛋白質(zhì)印記Westernblotting:AntibodiescanbeusedtodetectspecificproteinsAlternatedetectionmethod–SecondaryantibodiesMemebrane:吸附生命大分子的固體材料NC,nitrocellulose硝酸纖維素膜0.45um

結(jié)合率：80ugPr/cm2

便宜，可簡單快速封閉非特異性抗體的結(jié)合NDM,nylon-densedmembrane尼龍膜結(jié)合率：480ugPr/cm2DBM,diazobenzyloxymethyl重氮芐氧甲基膜濕法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)：將gel和membrane夾在blotterpaper中，浸在轉(zhuǎn)移裝置的buffer中，通電45min或overnight可完成。TransferBuffer(500ml,pH8.3)

glycine1.450g(39mM)Trisbase2.900g(48mM)SDS0.185g(0.037%)UsingtheSemi-DryTransferUnit

Removethestackinggelfromthegel.去除堆積凝膠的凝膠。2.Cutpiecesofblotterpapertothesizeofthegel.

note:theblotterpaper(andthemembrane)notbelargerthanthegel.Largerpiecesmaymakecontactaroundthegel,andallowthecurrentanalternateroute,therebymakingtransferinefficient.裁片的記事簿紙張的大小的凝膠。注：本記事簿紙（和膜）不大于凝膠。大塊的可能使接觸周圍的凝膠，并允許目前的替代路線，從而使傳輸效率。3.Wearingglovesrinsedofpowder,cutapieceofmembranetothesizeofthegel.Markthelowerright-handcornertoallowfororientation.Pre-wetthemembraneintransferbufferfor2to5minutes.戴手套清洗粉，剪下一塊膜大小的凝膠。標(biāo)記右下角以便方向。濕膜轉(zhuǎn)移緩沖液為2到5分鐘。4.sandwichblotterpaper–membrane-gel-blotterpaper

makesurenoairbubblesaretrappedThemembranemustthereforebepositionedcorrectlythefirsttime.Donottrytoadjust.三明治吸墨紙紙–膜凝膠-記事簿紙確保沒有氣泡被困膜因此必須正確定位第一時(shí)間。不要試圖調(diào)整。5.Holdthecoverlevelandslideitgentlydownontothestack.持有的封面和滑動它輕輕地放到堆棧6.weighdownthelidinordertoensureevencontactwiththestack.權(quán)衡下來的蓋子，以確保即使接觸堆棧。7.Connecttheunittoasuitablepowersupply.Turnthepowersupplytozerobeforeturningon.Turnonthepowersupplyandsettoapproximately0.8mA/cm2ofgel.Largergelsmustbelimitedto0.8mA/cm2toavoidexcessiveheatbuildup.。連接到一個(gè)合適的電源供應(yīng)裝置。打開電源供應(yīng)零之前打開。打開電源并設(shè)定約0.8毫安/厘米~2凝膠。較大的凝膠必須被限制在0.8毫安/厘米~2避免過度生熱。8mmx7mmmini-gelsat100mA.MolecularWeightTransferPeriod<20,00015minutes20,000-80,000030minutes>80,00045minutesProblem：蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率低？（轉(zhuǎn)移后對凝膠或膜染色進(jìn)行觀察）transferbuffer中加入20％甲醇或加入終濃度為0.1%SDS,可增加膜結(jié)合蛋白質(zhì)的能力；使用小孔徑的硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移后的膜在含0.2%戊二醛的TBS中浸泡45mi