蛋白酶活性的測定方法及原理

蛋白酶活性的測定方法及原理羅老師組員寧舒婷陳麗君陳海梅王熙棟當前1頁，總共15頁。各種測定方法及原理考馬斯亮藍法甲醛滴定法DHT-酪蛋白法DNA-溴乙錠熒光分析法X-光膠片法福林酚法當前2頁，總共15頁。甲醛滴定法3考馬斯亮藍染料與蛋白質(zhì)在酸性條件下結(jié)合，主要是染料與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色，在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質(zhì)濃度成正比?？捡R斯亮藍法當前3頁，總共15頁。4蛋白酶催化蛋白質(zhì)水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成的氨基酸，從而測定其酶活?？捡R斯亮藍法甲醛滴定法當前4頁，總共15頁。5用5-氨基四唑重氮鹽將氨基酸中部分組氨酸和酪氨酸重氮化，得到黃色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白為底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二價離子可與DHT-蛋白與DHT-肽形成穩(wěn)定的可溶性紅色螯合物，而鋅離子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。選用合適濃度的鋅離子和鎳離子作為沉淀劑和顯色劑，利用比色法可測定蛋白酶酶活?？捡R斯亮藍法DHT-酪蛋白法當前5頁，總共15頁。6溴乙錠插入雙鏈DNA的堿基對之間時，可使DNA的熒光增加25倍。接近飽和的溴乙錠(0.5μg/mL)與DNA混合時，其熒光增加量與DNA的濃度呈正比。在DNA-組蛋白-溴乙錠溶液中加入蛋白酶時，蛋白酶水解結(jié)合在DNA鏈上的組蛋白，使DNA結(jié)合部位暴露出來，溴乙錠重新插入DNA雙鏈中，熒光增加量與蛋白酶活性呈正比。通過測定DNA溶液的熒光增量來計算蛋白酶的活性?？捡R斯亮藍法DNA-溴乙錠熒光分析法當前6頁，總共15頁。7酶的底物明膠涂抹在X-光膠片上，當待測酶液滴加到X-光膠片上時，酶將X-光膠片上的明膠水解，用水沖洗膠片，即可看到膠片上明膠被酶水解的地方，出現(xiàn)透明的圓圈。酶活性的高低與透明圓圈的面積成正比。測定圓圈的面積以測定蛋白酶的活性。?？捡R斯亮藍法X-光膠片法當前7頁，總共15頁。8福林-酚試劑在堿性條件下可被酚類化合物還原呈藍色鉬藍和鎢藍混合物，而蛋白質(zhì)分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物呈上述反應，利用此原理測定蛋白酶酶活?？捡R斯亮藍法福林酚法重點本次實驗就是采用福林酚法測定蛋白酶活性當前8頁，總共15頁。

福林酚法測定蛋白酶活性

蛋白酶對酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷鎢酸和磷鉬酸混合試劑，即福林-酚試劑，堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原而呈藍色反應（鎢蘭和鎢蘭混合物）。由于蛋白質(zhì)中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物也呈此反應。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反應，來間接測定蛋白酶的活力。原理當前9頁，總共15頁。分析天平：精度0.0001g恒溫水浴：精度±0.2℃計時表分光光度計沸水浴器振蕩混合器pH計:精度0.01pH單位乳酸緩沖液（pH=3.0）適用于酸性蛋白酶磷酸緩沖液（pH=7.5）適用于中性蛋白酶硼酸緩沖液(pH=10.5)適用于堿性蛋白酶0.4mol/L碳酸鈉溶液0.4mol/L的三氯醋酸液0.5mol/L的NaOH10.00mg/ml酪素溶液100μg/ml酪氨酸標準溶液試劑儀器當前10頁，總共15頁。標準曲線的繪制試管0試管1試管2試管3試管4試管5100μg/ml酪氨溶液（ml）O12345蒸餾水（ml）1098765酪氨酸實際濃度（μg/ml）O1020304050L-酪氨酸標準溶液按下表配制分別取上述溶液各1.00ml(須做平行試驗)，各加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5.00ml。福林試劑使用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中顯色20min,取出用分光光度計于波長680nm,比色，以不含酪氨酸的0管為空白管調(diào)零點，分別測定其吸光度值，以吸光度值為縱坐標，酪氨酸的濃度為橫坐標，繪制標準曲線或計算回歸方程。計算出當OD為1時的酪氨酸的量（μg），即為吸光常數(shù)K值，其K值應在95~100范圍內(nèi)。當前11頁，總共15頁。實驗步驟②③①先將酪素溶液放入40±0.2℃恒溫水浴中，預熱5min取4支試管，各加入1ml酶液取一支作為空白管，加2ml三氯乙酸，其他3管作為測試管各加入1ml酪素，搖勻，40℃保溫10min⑤⑥④取出試管，3支測試管中各加入2ml三氯乙酸，空白管中加1ml酪素。靜置10min，過濾沉淀各取1ml濾液，加入0.4mol/L的碳酸鈉5ml、福林試劑1ml。在40℃顯色20min680nm處測OD值。以空白管調(diào)零點。當前12頁，總共15頁。蛋白酶活性的計算K：吸光常數(shù)Title1g固體酶粉（或1ml液體酶），在40℃（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、堿性pH=10.5）條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸為一個酶活力單位。定義計算蛋白酶的活力=A×K×4/10×nU/g(ml)A：樣品平行試驗的平均OD值K：吸光常數(shù)4：反應試劑的總體積0：酶解反應時間n：酶液稀釋總倍數(shù)1當前13頁，總共15頁。思考題Title蛋白酶有哪幾類？①按蛋白酶水解蛋白質(zhì)的方式：A內(nèi)肽酶：切開蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵，生成相對分子質(zhì)量較小的多肽類；B外肽酶：切開蛋白質(zhì)或多肽分子氨基或羧基末端的肽鍵，而游離出氨基酸的酶類；C水解蛋白質(zhì)或多肽的酯鍵；D水解蛋白質(zhì)或多肽的酰胺鍵。②按酶的來源可分為：動物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶③微生物蛋白酶又可分為：細菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放線菌蛋白酶④按蛋白酶作用的最適PH可以分為（A）PH2.5~5.0的酸性蛋白酶，（B）PH9.5~10.5的堿性蛋白酶，（C）PH7~8的中性蛋白酶影響酶活力的因素有哪些？①酶濃度對酶活力的影響：酶促反應速率與酶分子的濃度呈正比，在一定范圍內(nèi)，當?shù)孜锓肿訚舛茸銐驎r，酶分子越多，底物轉(zhuǎn)化的速度越快。②底物濃度對酶活力的影響：若酶的濃度為定值，底物的起始濃度越低時，酶促反應速度與底物濃度呈正比，即隨底物濃度的增加而增加。當

所有的酶與底物結(jié)合生成中間產(chǎn)物后，即使再增加底物濃度，中間產(chǎn)物濃度也不會增加，酶促反應速度也不會增加。③溫度對酶活力的影響：在適宜的溫度范圍內(nèi)，酶促反應速度隨溫度升高而增加，超過最適反應溫度，酶活力將會下降。④PH對酶活力的影響：酶在最適PH范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性，大于或小于最適PH，都會降低酶活性。⑤激活劑對酶活力的影響：某些無機陽離子、陰離子、有機化合物可作為激活劑，能夠激活酶，使其表現(xiàn)出催化活性或強化其催化活性。⑥抑制劑對酶活力的影響：酶的抑制劑能夠減弱、抑制甚至破壞酶的活力，它可降低酶促反應速度。使用紫外分光光度計時應注意哪些問題？①使用的比色皿必須潔凈，并注意配對使用。手指應拿毛玻璃面的兩側(cè)，裝