微生物培養(yǎng)與檢驗(yàn)-微生物菌種保藏

微生物菌種保藏獲得微生物的純培養(yǎng)后，該如何保存呢？微生物菌種保藏P92內(nèi)容二、菌種保藏的目的三、菌種保藏的原理四、菌種保藏的方法一、為什么要進(jìn)行菌種保藏一、為什么要進(jìn)行菌種保藏請(qǐng)大家回顧微生物的特點(diǎn)：體積小，面積大吸收多，轉(zhuǎn)化快生長(zhǎng)旺，繁殖快適應(yīng)強(qiáng)，易變異分布廣，種類多吸收多，轉(zhuǎn)化快積極活動(dòng)的大腸桿菌，每小時(shí)能消耗它體重2000倍的乳糖；人呢？500年（400斤/年）繁殖速、轉(zhuǎn)化快： 大腸桿菌重量10-12g，一般每20分鐘即可分裂一次；加入給予充足的食物，那么長(zhǎng)多久能達(dá)到1mg？24h以后能達(dá)到多重？

適應(yīng)強(qiáng)，易變異

菌種衰退（degeneration）：指由于自發(fā)突變的結(jié)果，使某物種原有的一系列生物學(xué)性狀發(fā)生量變或質(zhì)變的現(xiàn)象。

純菌種自發(fā)突變突變個(gè)體傳代增殖原始個(gè)體不純菌種衰退菌種微生物個(gè)體微小，代謝活躍，生長(zhǎng)繁殖快，如果保存不妥容易發(fā)生變異，或被其他微生物污染，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。二、菌種保藏的目的1.節(jié)約試劑與時(shí)間2.在一定時(shí)間內(nèi)不死3.不被其他微生物污染4.不會(huì)因發(fā)生變異而丟失重要的生物學(xué)特性三、菌種保藏的原理因此在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)，才能在一定的時(shí)間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。菌種保藏要求各保藏管理中心所保藏的菌種，必須具有該菌種的詳細(xì)歷史及有關(guān)實(shí)驗(yàn)資料。并對(duì)其所負(fù)責(zé)保藏的菌種均應(yīng)采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌種的污染或死亡。

《中國(guó)微生物菌種保藏管理?xiàng)l例》

1986年菌種保藏的原理首先應(yīng)該挑選典型菌種的優(yōu)良純種來進(jìn)行保藏，最好保藏它們的休眠體，如分生孢子、芽孢等。其次應(yīng)人為地創(chuàng)造環(huán)境條件（如：干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)），使微生物長(zhǎng)期處于代謝不活潑、生長(zhǎng)繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。盡可能多的采用不同的手段保藏一些比較重要的微生物菌株

斜面低溫保藏法石蠟油封藏法甘油懸液保藏法液氮超低溫保藏法冷凍真空干燥保藏法砂土管保藏法麩皮保藏法宿主保藏法低溫定期移植法冷凍保藏法干燥保藏法（一）低溫定期移植法將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代，然后在一定的溫度下生長(zhǎng)和保存的傳代保存方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，無需任何特殊設(shè)備；但易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶和基因突變等1、斜面低溫保藏法－－常用保藏法

將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長(zhǎng)完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時(shí)間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。適用于各大類微生物菌種的短期保藏;此法的主要保藏措施是低溫。一般可保存1～6個(gè)月左右。優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行，容易推廣，存活率高；缺點(diǎn)是菌株仍有一定程度的代謝活動(dòng)能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較易發(fā)生變異和被污染。2、石蠟油封藏法

無菌條件下將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端1cm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏此法廣泛適用于各大類微生物菌種的中期保藏，不適用于保藏某些能分解烴類的菌種。此法的主要保藏措施是低溫、阻氧。一般可保存1～2年左右。（二）冷凍保藏法冷凍時(shí)微生物代謝活動(dòng)停止，一般來說，冷凍溫度越低，效果越好。通常加入一定的冷凍保護(hù)劑3、甘油懸液保藏法此法是將菌種懸浮在甘油蒸餾水中，置于低溫下保藏，本法較簡(jiǎn)便，但需置備低溫冰箱。保藏溫度若采用－20℃，保藏期約為0.5～1年，而采用－70℃，保藏期可達(dá)10年。將擬保藏菌種對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)液直接與經(jīng)121℃蒸汽滅菌20min的甘油混合，并使甘油的終濃度在10％～15％，再分裝于小離心管中，置低溫冰箱中保藏?；蚬こ叹２捎帽痉ū２?。4、液氮超低溫保藏法以甘油、二甲基亞砜等作為保護(hù)劑，在液氮超低溫（－196℃）下保藏的方法。適用于各種微生物菌種的保藏。此法的主要保藏措施是超低溫、有保護(hù)劑，保藏期一般可達(dá)到15年以上，是目前公認(rèn)的最有效的菌種長(zhǎng)期保藏技術(shù)之一。此法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、高效，且可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進(jìn)行保藏。其缺點(diǎn)是需購(gòu)置超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費(fèi)用較高。（三）干燥保藏法使生長(zhǎng)合適的微生物吸附在一定的載體上進(jìn)行干燥常用的載體有砂土、麩皮、濾紙等5、冷凍真空干燥保藏法基本方法：減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護(hù)劑，國(guó)內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖是菌種長(zhǎng)期保藏的最為有效的方法之一，大部分微生物菌種可保藏10年；且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸此法適用于各大類微生物。該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè)備。6、砂土管保藏法

該法是將砂與土分別洗凈、烘干、過篩，按一定比例分裝于小試管中，砂土的高度約1cm，121℃蒸汽滅菌1～1.5h，間歇滅菌3次。50℃烘干后經(jīng)檢查無誤后備用。將待保藏的菌株制成菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約2～4h，用火焰熔封管口(或用石蠟封口)，置于干燥器中，在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。一種常用的長(zhǎng)期保藏菌種的方法，適用于產(chǎn)孢子的微生物及形成芽孢的細(xì)菌，對(duì)于一些對(duì)干燥敏感的細(xì)菌及酵母則不適用。

砂土管法兼具低溫、干燥、隔氧和無營(yíng)養(yǎng)物等條件，故保藏期較長(zhǎng)、效果較好，且微生物移接方便，經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便。它的保藏期約1～10年。7、宿主保藏法此法適用于專性活細(xì)胞寄生微生物（如病毒、立克次氏體等）。植物病毒可用植物幼葉的汁液與病毒混合，冷凍或干燥保存。噬菌體可以經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)擴(kuò)大后，與培養(yǎng)基混合直接保存。動(dòng)物病毒可直接用病毒感染適宜的臟器或體液，然后分裝于試管中密封，低溫保存。在上述的菌種保藏方法中，以斜面低溫保藏法、石蠟油封藏法、宿主保藏法最為簡(jiǎn)便；砂土管保藏法、麩皮保藏法和甘油懸液保藏法次之；以冷凍真空干燥保藏法和液氮超低溫保藏法最為復(fù)雜，但其保藏效果最好。應(yīng)用時(shí)，可根據(jù)實(shí)際需要選用。國(guó)際著名微生物菌種保藏機(jī)構(gòu)ATCC：美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心NRRL：美國(guó)農(nóng)業(yè)部北方地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室NCTC：英國(guó)國(guó)家典型培養(yǎng)物保藏所CBS：荷蘭真菌中心保藏所IFO：日本大阪發(fā)酵研究所

中國(guó)微生物菌種保藏機(jī)構(gòu)CGMCC：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心ACCC：中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心CICC：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心CCTCC：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心菌種的復(fù)壯

一、菌種的復(fù)壯

狹義的復(fù)壯－－消極的措施指在菌種已經(jīng)發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測(cè)定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施。

廣義的復(fù)壯－－積極的措施指在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識(shí)地采取純種分離和生產(chǎn)性狀測(cè)定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個(gè)體。菌種復(fù)壯的主要方法1、純種分離法

菌落純（“菌種純”）細(xì)胞純（“菌株純”）

通過純種分離,可將衰退菌種細(xì)胞群體中一部分仍保持原有典型性狀的單細(xì)胞分離出來,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng),就可恢復(fù)原菌株的典型性狀。平板表面涂布法平板劃線分離法瓊脂培養(yǎng)基澆注法用分離小室進(jìn)行單細(xì)胞分離用顯微操作器進(jìn)行單細(xì)胞分離菌絲尖端切割進(jìn)行單細(xì)胞分離2、宿主體內(nèi)復(fù)壯法