RNA干擾抗乙肝病毒

RNA干擾抗乙肝病毒第1頁(yè)/共27頁(yè)引言世界衛(wèi)生組織估計(jì)世界已經(jīng)有20億人感染了乙肝病毒，其中3億5000萬(wàn)人已經(jīng)發(fā)展為慢性，持續(xù)的感染增加了肝細(xì)胞癌和肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)。肝細(xì)胞癌在世界上最常見(jiàn)癌癥中排行第六，并且在導(dǎo)致死亡的癌癥中排行第四。

第2頁(yè)/共27頁(yè)乙肝疫苗對(duì)于慢性攜帶者在預(yù)防感染和肝細(xì)胞癌方面卻幾乎沒(méi)有任何治療效果?？尚械腍BV治療方案包括核苷類似物和免疫調(diào)節(jié)劑，但是也僅有有限的功效，并且代價(jià)很高，包括相關(guān)的副作用和耐藥性發(fā)生。通過(guò)RNA干擾的途徑來(lái)抑制感染的方法依然占據(jù)主導(dǎo)地位第3頁(yè)/共27頁(yè)乙肝病毒基因結(jié)構(gòu)乙肝病毒的基因組包含部分開(kāi)環(huán)的雙鏈DNA(rcDNA),該核酸被衣殼包裹，同時(shí)被具有傳染性的乙肝病毒顆粒所包裹。負(fù)鏈DNA大約有3.2KB長(zhǎng)，該鏈包含了整個(gè)HBV的基因組。正短鏈DNA更短并且在長(zhǎng)度上更具有可變性。正鏈位于5’和3’負(fù)鏈的末端以維持rcDNA的圓形結(jié)構(gòu)。第4頁(yè)/共27頁(yè)肝細(xì)胞感染后rcDNA被釋放，同時(shí)在胞核被修復(fù)以形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，它也作為模板轉(zhuǎn)錄乙型肝炎病毒的RNA。共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的四重疊ORFs能編碼產(chǎn)生七種病毒蛋白。其中包括表面蛋白、酶、核心和e抗原。四種病毒激活子和兩個(gè)增強(qiáng)調(diào)控序列，大于3.5Kb基因組長(zhǎng)度的前基因組RNA以及2.4kb、2.1kb和0.9kb亞基因組mRNA的生成。前基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致乙型肝炎病毒的基因組rcRNA形成。第5頁(yè)/共27頁(yè)第6頁(yè)/共27頁(yè)RNAi機(jī)制RNAi的機(jī)制是高度保守的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，它被雙鏈RNA觸發(fā)，由22個(gè)核苷酸序列構(gòu)成的小分子核苷酸。第7頁(yè)/共27頁(yè)

RNA聚合酶II促進(jìn)因子初始小分子RNA前體小分子RNA加帽RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物第8頁(yè)/共27頁(yè)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物在5’端熱力學(xué)穩(wěn)定性很差，故被選擇為成熟miRNA的向?qū)АiRNA向?qū)cmRNA3‘端未翻譯區(qū)域結(jié)合實(shí)現(xiàn)基因沉默。即與同源靶向mRNA之間完整互補(bǔ)，從而使mRNA降解。第9頁(yè)/共27頁(yè)外源性RNA干擾活化劑合成的小片段RNA是由21-25核苷酸長(zhǎng)并帶有特征性的2個(gè)核苷酸3’末端的雙鏈組成。這些合成的siRNA有效的表達(dá)抗病毒序列使乙肝病毒在體內(nèi)外的復(fù)制沉默，從而達(dá)到治療慢性乙肝病毒感染的目的。第10頁(yè)/共27頁(yè)為了能有效的在肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表達(dá)基因盒通常合并為重組病毒載體，而siRNA通常使用合成物或非病毒載體來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)。第11頁(yè)/共27頁(yè)抗乙肝病毒RNA干擾藥物的開(kāi)發(fā)階段首先要解決RNAi能否有效的釋放到已經(jīng)被乙肝病毒感染的肝細(xì)胞內(nèi)，其次是實(shí)現(xiàn)持續(xù)的病毒復(fù)制沉默。分析評(píng)估療效通常使用分步法，包括有效的選擇抗HBV活化劑，融合于一個(gè)合適的載體里，同時(shí)測(cè)量抗病毒活性以及描述非目標(biāo)效應(yīng)。第12頁(yè)/共27頁(yè)RNA干擾活化劑的優(yōu)化首先需要考慮的是有效性和安全性避免錯(cuò)誤的細(xì)胞內(nèi)mRNA的沉默確定有效沉默所需要的最低濃度防止病毒逃逸藥物同時(shí)減少源于先天免疫應(yīng)答誘導(dǎo)以及細(xì)胞內(nèi)mRNA錯(cuò)誤沉默所造成的毒性。第13頁(yè)/共27頁(yè)人工合成RNAi活化劑

首選方法是使用位于子區(qū)域的核苷酸的化學(xué)修飾引導(dǎo)化學(xué)合成的小干擾RNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)涵體，這些siRNA常被視為異己，從而導(dǎo)致先天免疫應(yīng)答的激活。第14頁(yè)/共27頁(yè)表達(dá)RNAi活化劑理想情況下，表達(dá)的活化劑應(yīng)該是專門(mén)針對(duì)乙肝病毒的，因此應(yīng)該有一個(gè)偏移以利于誘導(dǎo)引導(dǎo)鏈抗乙肝shRNA盒的另一種途徑涉及到前體miRNA往返序列的利用。由于它經(jīng)常出現(xiàn)多順?lè)醋?，使往返序列多聚化，因此可以同步沉默多個(gè)目標(biāo)HBV。第15頁(yè)/共27頁(yè)病毒復(fù)制模型中RNAi激活劑的功效和毒性測(cè)試乙肝病毒復(fù)制模型的一個(gè)重要缺點(diǎn)是它們不模擬乙肝病毒生命周期自然初始感染步驟。模型中的復(fù)制只是暫時(shí)的，并且這個(gè)過(guò)程本身就有肝毒性。液體注射和轉(zhuǎn)基因小鼠模型的一個(gè)重要限制是CCCDNA不在這些動(dòng)物肝細(xì)胞中形成。第16頁(yè)/共27頁(yè)鴨乙肝病毒和土撥鼠肝炎病毒與HBV高度相似，故也已被用來(lái)模擬人類乙肝病毒感染。黑猩猩可能適合RNAi激活劑藥物的療效評(píng)估，但也有很大局限性第17頁(yè)/共27頁(yè)提供乙肝病毒載體的RNA干擾活化劑載體能夠高效安全的轉(zhuǎn)導(dǎo)抗病毒藥物，并且適合大規(guī)模制備，并且可以實(shí)現(xiàn)重復(fù)給藥。包括病毒載體和非病毒載體第18頁(yè)/共27頁(yè)病毒載體重組腺病毒：具有天然的肝臟親和性，能夠?qū)崿F(xiàn)外源性基因在體內(nèi)持久的表達(dá)。聚乙二醇化的重組腺病毒載體中的聚乙二醇由于減弱了免疫刺激和肝毒性，同時(shí)改進(jìn)了重復(fù)給藥后的沉默，故以成為主流基因治療載體。第19頁(yè)/共27頁(yè)重組慢病毒載體也可用于RNAi抗乙肝病毒治療，優(yōu)點(diǎn)：在細(xì)胞周期G1階段感染增強(qiáng)前病毒DNA穩(wěn)定整合使RNAi表達(dá)延長(zhǎng)第20頁(yè)/共27頁(yè)慢病毒載體能夠?qū)崿F(xiàn)體外肝細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，優(yōu)勢(shì)：選擇性肝細(xì)胞修飾消除免疫刺激導(dǎo)致的抗原呈遞細(xì)胞載體轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱有系統(tǒng)的全身給藥所帶來(lái)的全身毒性或炎癥反應(yīng)。第21頁(yè)/共27頁(yè)面臨的問(wèn)題：如何獲得足夠的移植細(xì)胞以供轉(zhuǎn)導(dǎo)乙肝病毒耐藥肝細(xì)胞的選擇優(yōu)勢(shì)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期轉(zhuǎn)基因治療的表達(dá)避免插入突變避免植入轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞具有的潛在致癌性第22頁(yè)/共27頁(yè)非病毒載體包括陽(yáng)離子脂質(zhì)核酸復(fù)合物，脂質(zhì)，核酸聚合物以及修飾的脂質(zhì)復(fù)合物NVVs能被濃縮以及中和核酸的負(fù)電荷以形成統(tǒng)一的直徑小于100納米的小顆粒，從而有利于與有窗孔的肝毛細(xì)管交聯(lián)。siRNA有效負(fù)載的保護(hù)和避免與宿主蛋白的相互作用是其優(yōu)點(diǎn)。第23頁(yè)/共27頁(yè)優(yōu)勢(shì)：能夠被化學(xué)修飾可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的合成與siRNA能夠良好的兼容免疫原性可以隨著配方的不同而變化第24頁(yè)/共27頁(yè)結(jié)論以RNAi為基礎(chǔ)的抗HBV藥物尚未達(dá)到臨床測(cè)試的階段。RNAi有效和特異性HBV復(fù)制比例通常大于90%，對(duì)于治療以足夠，但由合成間接siRNARNAi激活劑造成短暫的失效需要重復(fù)給藥。第25頁(yè)/共27頁(yè)