分子熒光分析法

關(guān)于分子熒光分析法第一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日

發(fā)光分析法：物質(zhì)吸收一定能量后躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)以輻射的形式釋放能量返回低能態(tài)或基態(tài)的現(xiàn)象所建立的分析方法。

光致發(fā)光：

以光能激發(fā)而產(chǎn)生的發(fā)光

熒光和磷光

光照、加熱、化學(xué)反應(yīng)、生物代謝等第二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日

熒光分析法：利用物質(zhì)的熒光譜線位置及其強度，對物質(zhì)進行定性和定量分析的方法。

定性鑒別：

由于不同的物質(zhì)其組成與結(jié)構(gòu)不同，所吸收光的波長和發(fā)射光的波長也不同。

定量分析：如果該物質(zhì)的濃度不同，它所發(fā)射的熒光強度就不同。第三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日

1.根據(jù)發(fā)光物質(zhì)分類：分子熒光與原子熒光

2.根據(jù)激發(fā)光的波長范圍分類：紫外-可見熒光、紅外熒光、X射線熒光

熒光分析法分類

熒光分析法特點：靈敏度高、選擇型好、樣品用量少、操作簡便第四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)基本原理一、分子熒光的產(chǎn)生1.電子激發(fā)態(tài)的多重度電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；大多數(shù)有機分子的基態(tài)處于單重態(tài)；第五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日2.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛豫無輻射躍遷第六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫第七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日非輻射能量傳遞過程

振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10-12

s。

內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重度電子能級中,等能級間的無輻射能級交換。

通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。第八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日非輻射能量傳遞過程外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進行第九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日輻射能量傳遞過程

發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；

‘2>2>1

熒光：10-7～10-9

s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；第十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日二、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜固定熒光波長(選最大激發(fā)光波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與激發(fā)光波長的關(guān)系曲線（圖中曲線I）。選最強熒光強度的激發(fā)光波長λex為測定波長，以提高靈敏度。1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線第十一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日2.熒光光譜(或磷光光譜)

固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強度)與激發(fā)光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。第十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日第十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日2.三維熒光光譜IF

∝f(λex

、λem)蒽的激發(fā)光譜固定發(fā)射波長、掃描激發(fā)波長第十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日IF

∝f(λex

、λem)蒽的發(fā)射光譜固定激發(fā)波長、掃描發(fā)射波長第十五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日VB1和VB2的三維熒光光譜第十六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日3.熒光光譜的特征

a.Stokes位移:熒光光譜的波長比激發(fā)光譜的長b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

c.與激發(fā)光譜呈鏡像關(guān)系通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。

第十七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；

基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的二振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

第十八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜第十九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件

熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。（1）具有強的紫外-可見吸收的特征結(jié)構(gòu)(共軛大π鍵)（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率（）（1）具有強的紫外-可見吸收的特征結(jié)構(gòu)(共軛大π鍵)（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率（）第二十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日2.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電子基，使熒光增強吸電子基，使熒光減弱甚至熄滅第二十一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日第二十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日2.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（4）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強的熒光，酚酞卻沒有。第二十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日四、熒光強度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系

稀溶液第二十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日五、影響熒光強度的因素2.溶劑的影響除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化。3.溶液pH

對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制。1.溫度的影響熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去激活的幾率減少，增加熒光效率，從而增加熒光強度。第二十五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日pH值

pH<2pH7~12pH>13弱酸、弱堿藍色熒光

第二十六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日4.散射光：瑞利散射光：選擇適當(dāng)?shù)臒晒鉁y定波長或選用濾光片可消除

拉曼散射光：選擇適當(dāng)激發(fā)波長的方法消除

一部分光由于光子與物質(zhì)分子的相互碰撞，使光子的運動方向發(fā)生改變而向不同方向散射。第二十七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日硫酸奎寧在不同激發(fā)波長下的熒光(a)與拉曼光譜(b)熒光光譜拉曼光譜瑞利光320nm拉曼光360nm拉曼光400nm熒光448nm激發(fā)320nm激發(fā)350nm瑞利光350nm第二十八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日5.熒光熄滅熒光熄滅（熒光猝滅）：由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子碰撞而引起熒光強度降低或熒光強度與濃度不呈線性關(guān)系的現(xiàn)象。

熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質(zhì)。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子及硝基化合物、羰基、羧基化合物均為常見的熒光熄滅劑。

第二十九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日熒光自熄滅：熒光物質(zhì)濃度超過1g/L時，增加熒光分子間碰撞幾率而產(chǎn)生的熒光熄滅現(xiàn)象。熒光熄滅法：利用熒光物質(zhì)熒光強度的減弱與熒光熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系測定熒光熄滅劑含量的方法。

(濃度限量1g~1mg/ml)第三十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日930型熒光計光路示意圖激發(fā)濾光片發(fā)射濾光片第二節(jié)熒光分析儀器第三十一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日一.主要組成及部件的功能熒光分光光度計工作原理基及儀器結(jié)構(gòu)框圖光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理儀器控制光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器發(fā)射單色器問題：熒光分光光度計與紫外-可見分光光度計有何異同點？第三十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日熒光分析儀器的主要部件激發(fā)光源：汞燈、鹵鎢燈、氙燈、分光系統(tǒng)：濾光片（兩個）、單色器（光柵）樣器池：低熒光材料或石英材料，四面透光檢測器：紫外-可見（光電倍增管）顯示系統(tǒng)：指針式、數(shù)字式及計算機顯示第三十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日二、熒光分析儀器的類型1.熒光光度計2.熒光分光光度計第三十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日熒光分光光度計熒光分光光度計結(jié)構(gòu)示意圖分光系統(tǒng)：光柵用途：測定激發(fā)光譜、熒光光譜及定量分析。最大激發(fā)波長exmax和最大熒光波長emmax是鑒定物質(zhì)的依據(jù)和定量測定時最靈敏的條件。

激發(fā)單色器發(fā)射單色器第三十五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日熒光分光光度計與紫外分光光度計的區(qū)別

紫外-可見分光光度計熒光分光光度計光路光源儀器校正吸收池入射光與吸收光同方向入射光與熒光垂直方向兩種光源(紫外+可見)一種光源(紫外)空白溶液(F=0)熒光對照品溶液(F=100%或50%)空白溶液(T=100%)紫外無吸收兩面透光低熒光材料四面透光第三十六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日紫外-可見分光光度計:光源樣品池單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制熒光(磷光)分光光度計:光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器第三十七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日紫外-可見分光光度計

測量池(吸收池)熒光分光光度計樣品池I0ItI0ItIF,p第三十八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)定性和定量分析定量依據(jù)：F=Kc定性依據(jù)熒光光譜和激發(fā)光譜一、定性分析二、定量分析第三十九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日1.標準曲線法直接熒光標準曲線法FCsFxCx第四十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日2.直接比較法第四十一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日第四節(jié)熒光分析新技術(shù)激光熒光分析時間分辨熒光分析一、熒光新技術(shù)三維熒光分析核酸分子熒光探針薄層掃描法中的熒光掃描法第四十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日熒光分析的應(yīng)用1.有機化合物的熒光分析研究對象：芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的化合物有機化合物：多環(huán)胺類、萘酚類、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸類及蛋白質(zhì)藥物：生物堿類；甾體類；抗生素類(青霉素、四環(huán)；維生素類(維生素A、B1、B2、B6、B12等)中草藥：有效成分（芳香性結(jié)構(gòu)的大分子雜環(huán)類）第四十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日熒光試劑熒光胺熒光條件：

ex=275、390nm，em=480nm適用：脂肪族和芳香族伯胺第四十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日鄰苯二甲醛(OPA)適用：伯胺類、-氨基酸（除半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸）熒光條件：

ex=340nm，em=455nm(2-巰基乙醇存在，pH9~10的緩沖溶液)第四十五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日2.無機化合物的熒光分析測定方法：與具有π電子共軛結(jié)構(gòu)的有機化合物形成熒光配合物研究對象陽離子：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr陰離子：CN-、F-與Al、Zr離子強烈配合→原有熒光配合物的熒光減弱甚至熄滅第四十六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日[課后練習(xí)]名詞解釋：熒光與磷光、振動弛豫溶液熒光光譜有哪些特征？能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)分子應(yīng)同時具備哪些條件？為什么熒光分析法適用于稀溶液的測定？第四十七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日填空題1．熒光是物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的

返回基態(tài)時發(fā)射出的光2．熒光和磷光的區(qū)別在于熒光是從單線激發(fā)態(tài)開始的，磷光是由

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