番茄醬中番茄紅素和β-胡蘿卜素

-.z.番茄醬中番茄紅素和β—胡蘿卜素的提取別離及分析測定一、實驗目的

1、理解有機溶劑提取番茄紅素和β—胡蘿卜素的方法及原理

2、掌握萃取別離過程的根本操作

3、掌握層析柱的操作

4、掌握分光光度法的測定色素含量的方法

5、掌握實驗數(shù)據(jù)的處理及色素含量的計算方法二、實驗原理

番茄醬濃縮了番茄中的番茄紅素和β-胡蘿卜素，二者的構造均屬于類胡蘿卜素。因而在構造上極為相似。番茄紅素構造化學式如下：β-胡蘿卜素構造化學式如下：類胡蘿卜素為多烯類色素，不溶于水而溶于脂溶性有機溶劑。本實驗先用較高極性的溶劑提取較高極性的色素，同時脫去樣品中的存在的少量水分；再用較低極性的溶劑補充提取較低極性的色素。因為低極性溶劑不與水混溶，故先除去水分后才能有效地從組織中較完全地萃取類胡蘿卜素。根據(jù)番茄紅素與β-胡蘿卜素極性的差異，用柱層析可以將它們別離。

番茄紅素在不同的有機溶劑里均有類似的吸收峰,最大吸收峰的波長在500nm附近，將別離后的樣品溶解在適當?shù)娜軇┲?在最大吸收峰處用分光光度計測定溶液的吸光度；番茄紅素標準品價格昂貴,且本身穩(wěn)定性差,不宜長期保存。根據(jù)蘇丹紅〔Ⅰ〕在500nm附近和番茄紅素、β-胡蘿卜素具有一樣的吸收特性，以蘇丹紅代替番茄紅素作為標準品，用氯仿作為溶劑及參比液，在500nm附近測定蘇丹紅的系列吸光度，繪制標準曲線；用番茄紅素的提取液的吸光度值在此標準曲線上查取相應濃度，以此來表征番茄紅素的濃度。通過換算得到番茄醬中該色素的含量。

β-胡蘿卜素的含量采用色價的測定及計算方法。色價是色素在商業(yè)上的濃度計量方式，定義為單位質量原料的提取物在1％濃度、以1cm比色皿在其最大吸收峰處的吸光度。色價的特點是不需要校準樣，也不需作標準曲線，簡單快速。具體操作是取樣品m克，在天平上準確稱重，用Vml石油醚溶解，以石油醚作參比液，在λma*下測量樣品溶液的吸光度A，樣品色價E按下式計算：三、物理常數(shù)名稱分子式相對分子質量外觀熔點

℃溶解度最大吸收波長λ水乙醇氯仿石油醚番茄紅素536.88針狀深紅色晶體174不溶微溶可溶可溶485～500nmβ-胡蘿卜素536.88紫紅或暗紅色結晶或結晶性粉末176～182不溶微溶可溶可溶480nm四、試劑和儀器

1、試劑及原料

亨氏番茄醬、95%乙醇〔C.P〕、二氯甲烷〔C.P〕、石油醚〔60-90℃〕、氯仿〔A.R〕、中性氧化鋁〔C.P〕、氯化鈉〔C.P〕、無水硫酸鈉〔C.P〕、蘇丹紅Ⅰ〔C.P〕2、儀器

回流裝置、恒溫磁力攪拌器、層析柱(15cm左右內徑為1-1.2cm)、分析天平,移液管、容量瓶、VIS-7220分光光度計五、實驗步驟

1、混合色素的提取

稱取新鮮番茄漿[1]10g于50ml枯燥的圓底燒瓶中，加極性的試劑(建議用95%乙醇)［A］20ml，搖勻，裝上回流冷凝管及恒溫磁力攪拌器，在相應溫度的水浴中加熱，回流5分鐘，冷卻后抽濾，濾液直接進入一個的50ml錐形瓶中。殘渣轉入原50ml圓底燒瓶中瓶內，參加15ml低極性溶劑(建議用二氯甲烷)［A］，在相應溫度的水浴上回流5分鐘，冷卻，混合物常壓過濾，濾液直接濾入以上50ml錐形瓶中，再加5ml低極性溶劑洗滌殘渣，過濾。合并高極性提取液和兩次低極性提取液，倒入100ml分液漏斗中，加4ml飽和氯化鈉溶液[2]，振蕩萃取，靜置分層。分出較深色有機相后，使其流經(jīng)一個在頸部裝有疏松棉花且在棉花上鋪有6g無水硫酸鈉的漏斗，以除去其中的微量水份。再用5ml低極性溶劑洗滌枯燥劑，合并枯燥后所得的溶液于一枯燥的50ml圓底燒瓶中。水浴蒸餾溶液，蒸出大局部溶劑后，在通風櫥內直接水浴加熱圓底燒瓶[3]，并用洗耳球不斷向圓底燒瓶吹氣,直到完全蒸干為止備用。

2、層析柱的制備

取一支長15cm左右內徑為1-1.2cm的枯燥的層析柱，將其垂直固定于鐵架上，底部鋪上少量棉花，翻開活塞。稱取8g氧化鋁小心傾入層析柱中，在氧化鋁上鋪一層棉花[4]。然后向柱內參加15ml石油醚，讓溶劑浸潤并流過層析柱，注意柱頂部溶劑不能干涸。待溶劑液面剛好與氧化鋁外表相切時，關閉活塞，備用。3、柱層析別離

向蒸干的粗樣品中參加2ml苯使其溶解。用一長頸滴管取樣，小心滴入層析柱內，注意產(chǎn)品不能接觸柱壁[5]。翻開活塞，讓溶液自然流下，待液面剛好與柱頂氧化鋁外表相切時，參加2ml石油醚，用50ml枯燥的錐形瓶[6]接收滴出的溶液。待溶劑液面與氧化鋁外表相切時，再參加8ml或更多的石油醚，至滴出的溶液無色，關閉活塞，收集黃色的β-胡蘿卜素溶液(a)；翻開活塞，再往層析柱中先后參加2ml及8ml的氯仿，洗至滴出的溶液無色，用另一50ml枯燥的錐形瓶[6]接收，關閉活塞，收集溶液紅色的番茄紅素〔b〕。然后用相應溫度的水浴蒸干(a)、(b)，差重法分別稱出相應濃縮物的重量Wa、Wb(準確到0.0002)。

4、蘇丹紅(Ⅰ)工作曲線

用分析天平準確稱取約5.0mg蘇丹紅(Ⅰ)于小燒杯中，參加少量溶劑(建議用氯仿)［B］在通風櫥內水浴加熱攪拌溶解，待溶液冷卻至室溫后全部轉移到100ml的容量瓶中，用溶劑(建議用氯仿)稀釋定容至刻度線，可得到50μg/ml的標準液。然后用10ml的移液管分別移取該溶液2ml、4ml、6ml、8ml、10ml于五個25ml的容量瓶中，然后參加溶劑將其稀釋定容至刻度，它們濃度分別為4μg/ml、8μg/ml、12μg/ml、16μg/ml、20μg/ml。用該溶劑作參比溶液，在波長為510nm下分別測其吸光度，以吸光度對濃度作圖，可得到吸光度對濃度的標準工作曲線圖及關系式。

5、番茄紅素及β-胡蘿卜素含量的測定［D］

5.1、番茄紅素含量的測定及百分含量的計算

往蒸干〔b〕所得的濃縮物中參加5ml的氯仿溶解，此溶液的濃度為C1；用1ml移液管移取0.5ml該溶液于25ml錐形瓶中，用定量的氯仿分步稀釋該溶液，使溶液的顏色與吸光度為0.5左右的蘇丹紅(Ⅰ)溶液的顏色接近，此時溶液的濃度為C2［7］。在400-600nm區(qū)間測定番茄紅素最大吸收波長λma*，在此λma*下測其吸光度［C］。將該吸光度值代入標準工作曲線，求出其濃度C2，從而推算出番茄醬中番茄紅素的含量。

其中：f是C1稀釋到C2倍數(shù)；各值的單位：C2：μg/ml;W番茄醬：g.

5.2、β-胡蘿卜素含量的測定及色價的計算［D］

用5ml石油醚作溶劑溶解(a)的濃縮物，取出１ml，再用石油醚稀釋3-5倍，使其吸光度值落在0.3-0.7的范圍內。然后以石油醚作參比溶液,在480nm測其吸光度。由色價公式算出稀釋后的濃縮物中β-胡蘿卜素的色價，從而推算出樣品番茄醬中β-胡蘿卜素的色價。色價計算公式：

E：稀釋后濃縮物的色價、A：吸光度、V：稀釋濃縮物所用石油醚的總體積(ml)、m：濃縮物〔b〕的質量Wb(g)

番茄醬中β-胡蘿卜素的色價計算公式：

m稀釋后濃縮物E稀釋后濃縮物

=

m番茄醬E番茄醬實驗探究局部(下劃線局部為實驗探究內容，可以選擇不同條件)

［A］、較高極性溶劑可選擇:95%乙醇〔C.P〕，丙酮〔C.P〕，甲醇〔C.P〕；較低極性溶劑可選擇：二氯甲烷〔C.P〕、乙醚〔C.P〕，石油醚〔C.P〕〔30-60℃〕

［B］、溶解蘇丹紅的溶劑選擇：氯仿，甲苯，石油醚。選擇條件參考物理常數(shù)表中

［C］、波長位點選擇：根據(jù)實驗測定番茄紅素、β-胡蘿卜素吸光度的最大波長來選擇測定時的λma*

［D］、含量的數(shù)據(jù)處理方法的選擇：科研中常用的使用標準樣的百分含量計算法；商業(yè)中常用的不使用校準樣的色價計算法。注釋

[1]、番茄醬采用"亨氏番茄醬〞.稱取番茄醬時，可直接用大口膠頭滴管從瓶里吸取番茄醬參加到圓底燒瓶底。

[2]、飽和氯化鈉可防止乳化并有利于分層.

[3]、進展該操作時，邊振蕩邊拿著洗耳球向瓶中吹氣，有利于加速蒸干溶劑。

[4]、棉花的作用是防止氧化鋁被傾入的溶劑沖散，從而保證氧化鋁外表的平整。

[5]、使層析中各成分能同步流出。

[6]、稱空錐形瓶的重量,以備用差重法計算產(chǎn)物重量：m稀釋后濃縮物E稀釋后濃縮物

=

m番茄醬E番茄醬

[7]、顏色深淺與吸光度的大小有對應關系，故相近顏色表相近的吸光度。從而根據(jù)溶液的吸光度