新概念疫苗總結(jié)

新概念疫苗總結(jié)

名詞解釋

新概念疫苗：與傳統(tǒng)疫苗成分，機(jī)制，作用不同,且能激發(fā)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答的新型疫苗

（1.成分不同：傳統(tǒng)疫苗多為死疫苗/減毒活疫苗或重組亞單位疫苗,新概念疫苗則為編碼無(wú)毒力抗原蛋白的病毒核酸

或能激發(fā)特異性機(jī)體免疫應(yīng)答的細(xì)胞疫苗2.機(jī)制不同：傳統(tǒng)疫苗主要靠病毒的抗原蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性保護(hù)抗

體，新型疫苗不僅刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性保護(hù)抗體，而且能激發(fā)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答3.作用不同：傳統(tǒng)疫苗只能起一定

預(yù)防作用，新型疫苗不僅能預(yù)防疾病，且更能起到特異性治療作用）

核酸疫苗：把編碼外源蛋白基因的質(zhì)粒DNA直接導(dǎo)入到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，通過(guò)產(chǎn)生抗原激活

機(jī)體的免疫系統(tǒng)以引發(fā)免疫反應(yīng)。

核酶：具有催化活性的RNA,其化學(xué)本質(zhì)是核糖核酸，卻具有酶的催化功能

T細(xì)胞疫苗：將引起自身免疫性疾病的自身反應(yīng)性T細(xì)胞或?qū)е峦N移植排斥反應(yīng)的同種反應(yīng)性T細(xì)胞活化并滅

活后作為疫苗，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)致病性T細(xì)胞或同種反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而消除或減輕這些細(xì)胞的致病

作用.稱(chēng)為T(mén)細(xì)胞疫苗

Thl：特征性分泌IL-2、1FN-Y、LT等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）和巨噬細(xì)胞活化等細(xì)胞免疫

反應(yīng)。

Th2：特征分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子，主要促成B細(xì)胞增殖并分化成漿細(xì)胞，分泌特異性

抗體，介導(dǎo)體液免疫和過(guò)敏反應(yīng)。

Tel:分泌Thl樣細(xì)胞因子的亞群稱(chēng)為T(mén)el,如IL-2、IFN-Y、LT等細(xì)胞因子。

Tc2：分泌Th2樣細(xì)胞因子的亞群稱(chēng)為T(mén)c2,如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子。

T細(xì)胞表位：抗原經(jīng)過(guò)抗原遞呈細(xì)胞（APC）加工后，由MHC分子遞呈給T細(xì)胞受體（TCR）的短肽。

顯性表位：在誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答時(shí)起關(guān)鍵作用或免疫原性強(qiáng)的表位稱(chēng)為顯性表位。

樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）疫苗：荷載抗原的DC具有疫苗的功能，故稱(chēng)~

抗原提呈細(xì)胞：能攝取、加工處理抗原，并將抗原遞呈給T淋巴細(xì)胞的一類(lèi)免疫細(xì)胞，在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要

作用，也稱(chēng)輔佐細(xì)胞

專(zhuān)職APC：能組成性表達(dá)MHC-H類(lèi)分子和T細(xì)胞活化的共刺激分子，抗原遞呈能力強(qiáng)，包括巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)

胞和B細(xì)胞等

內(nèi)源性抗原：APC內(nèi)合成的，如被病毒感染細(xì)胞合成的病毒蛋白

外源性抗原：來(lái)源于細(xì)胞外的抗原，如被吞噬的細(xì)胞或細(xì)菌等

交叉遞呈：有些APC的MHC-I類(lèi)分子具有提呈外源性抗原給CD8+細(xì)胞的能力。

簡(jiǎn)答題

簡(jiǎn)述DNA疫苗表達(dá)產(chǎn)物的免疫機(jī)制：

1質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)染體細(xì)胞

表達(dá)抗原蛋白，然后通過(guò)MHC-I進(jìn)行抗原遞呈，誘發(fā)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）應(yīng)答的產(chǎn)生。

2專(zhuān)職抗原呈遞細(xì)胞（APC）遞呈肌細(xì)胞表達(dá)的外源抗原

肌細(xì)胞作為體內(nèi)抗原庫(kù)，不斷地釋放抗原至細(xì)胞間隙，然后被APCs吞噬、加工、遞呈，進(jìn)入免疫途徑。

3質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)染APC

?誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的最有效的途徑。

?質(zhì)粒DNA在APC內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原作為“內(nèi)源性抗原”，經(jīng)蛋白酶降解形成8-10aa組成的肽，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔

內(nèi)與MHC-I分子形成聚體后到達(dá)APC膜表面，被T細(xì)胞的受體識(shí)別。

?交叉激活核交叉遞呈

簡(jiǎn)述用作DNA免疫的表達(dá)載體的特點(diǎn):

（1）在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)能高水平表達(dá)目的基因;

（2）本身不復(fù)制；

（3）不會(huì)整合到宿主染色體中

簡(jiǎn)述核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)

（1）免疫效果好

（2）易操作性和穩(wěn)定性

（3）能同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，交叉防御

（4）通過(guò)選擇免疫途徑或增加細(xì)胞因子，可誘發(fā)適合于特定病原體的Thl或Th2應(yīng)答

（5）易于構(gòu)建和使用聯(lián)合疫苗或嵌合疫苗

（6）能產(chǎn)生用常規(guī)方法不能產(chǎn)生的有效免疫原。

（7）能用各種投遞疫苗的方法

（8）具有熱穩(wěn)定性，無(wú)需特別的冷藏系統(tǒng)，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸

（9）規(guī)?；a(chǎn)，成本低廉

（10）母體抗體的存在不影響新生兒免疫

（11）使用相對(duì)安全

簡(jiǎn)述CD28與CTLA-4的功能？

90%CD4+和50%CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD28分子，而CTLA-4只表達(dá)在活化的T細(xì)胞表面

CD28和CTLA-4的天然配體都是B7分子

CD28接受APC細(xì)胞B7分子提供的刺激，向T細(xì)胞提供活化的輔助信號(hào)

CTLA-4僅表達(dá)于活化T細(xì)胞,其表達(dá)水平明顯低于CD28,它與配體結(jié)合，向活化的T細(xì)胞傳導(dǎo)抑制信號(hào)

簡(jiǎn)述T細(xì)胞表位識(shí)別抗原的特點(diǎn)

特異性：T細(xì)胞能識(shí)別大量的表達(dá)在APC表面的特異的肽-MHC復(fù)合體

敏感性：同樣的MHC分子可結(jié)合大量不同的肽，但APC上T細(xì)胞表位數(shù)很低

限制性：一個(gè)淋巴細(xì)胞只識(shí)別與一種類(lèi)型MHC分子結(jié)合的特異性抗原肽

非己性：T細(xì)胞須忽略無(wú)害的或自身抗原

順序性：T細(xì)胞僅識(shí)別多肽的順序表位

簡(jiǎn)述T細(xì)胞疫苗的制備方法

1.接種用T細(xì)胞的獲取

1）自身免疫性疾病

從發(fā)病機(jī)體的淋巴組織、炎癥浸潤(rùn)部位或外周血中分離，特異性自身抗原誘導(dǎo)，體外擴(kuò)增。

2）移植研究

用供體抗原使受體致敏，再收集相應(yīng)部位的淋巴細(xì)胞和脾細(xì)胞，制備淋巴細(xì)胞懸液，用低濃度的ConA在體外培養(yǎng)。

2.T細(xì)胞接種前的處理

1）T細(xì)胞的活化：通過(guò)特異抗原活化，或經(jīng)T細(xì)胞有絲分裂原活化

2）T細(xì)胞滅活：X射線、60C。照射或絲裂霉素C處理，低濃度戊二醛處理。

3）亞適量接種：自身免疫性T細(xì)胞的劑量低于過(guò)繼轉(zhuǎn)移自身免疫性疾病所需的劑量，無(wú)需滅活。

3.接種方式

自身免疫病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：靜脈注射臨床上：皮下多點(diǎn)免疫

同種移植實(shí)驗(yàn)：腹腔注射，術(shù)前術(shù)后多次

特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的體外功能檢測(cè)方法有那些？

1.淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

取T細(xì)胞或PBMC與不同稀釋度的抗原或APC遞呈的抗原混合培養(yǎng)3-5天，測(cè)細(xì)胞的增殖。據(jù)此判斷出淋巴細(xì)胞

對(duì)有關(guān)刺激的反應(yīng)性與功能狀態(tài)

所用方法：3H-TdR摻入法、MTT法等

2.細(xì)胞因子分泌

活化的T細(xì)胞會(huì)分泌一些細(xì)胞因子（IL-2、IFN-Y、TNF-a等）

所用方法：流式細(xì)胞術(shù)（FACS）,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA法），ELISPOT法，定量RT-PCR

3.直接細(xì)胞毒性分析

T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（LMC）是細(xì)胞毒性細(xì)胞（CTL）的特性，凡致敏的T細(xì)胞再次遇到相應(yīng)靶細(xì)胞抗原，均可

表現(xiàn)出對(duì)靶細(xì)胞的破壞和溶解作用，它是評(píng)價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫水平的一種常用指標(biāo)，特別是測(cè)定腫瘤患者CTL殺傷

腫瘤的能力，常作為判斷預(yù)后和觀察療效的指標(biāo)之一

論述題

論述DNA疫苗免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià)？

一、細(xì)胞免疫

評(píng)價(jià)方法：T細(xì)胞功能和細(xì)胞因子的檢測(cè)

（一）淋巴細(xì)胞增殖功能的檢測(cè)（淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)）：3H-TdR摻入法，MTT法，Brdu檢測(cè)法，CFSE標(biāo)記淋巴細(xì)

胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

?原理：T細(xì)胞表面具有識(shí)別抗原的受體和有絲分裂原

受體，經(jīng)特異性抗原刺激后發(fā)生一系列的變化而轉(zhuǎn)變成

為淋巴母細(xì)胞，所以又稱(chēng)為淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

?淋巴細(xì)胞增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中的重要階段。

?檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖水平，了解核酸疫苗接種后，淋巴細(xì)胞

的反應(yīng)能力和免疫功能。

（二）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（即殺傷試驗(yàn)）

?殺傷性作用：抗原特異性，致敏的T細(xì)胞再次遇到相應(yīng)靶細(xì)胞抗原，對(duì)靶細(xì)胞的破壞和溶解作用。

?殺傷機(jī)制：①穿孔素和顆粒酶②靶細(xì)胞的程序性死亡

原則：

適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞一標(biāo)記一按一定比例與淋巴細(xì)胞混合一共溫一段時(shí)間一觀察殺傷情況

1.放射測(cè)定法

（1）51Cr釋放試驗(yàn)

（2）3H-TdR釋放試驗(yàn)

2.非放射測(cè)定法

乳酸脫氫酶（LDH）釋放試驗(yàn)

（三）細(xì)胞因子（cytokines）的檢測(cè)

?定義：免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞合成和分泌的具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理功能的小分子多肽類(lèi)因子。

?常見(jiàn)：IL、IFN、CSF、TNF、TGF

（1）免疫學(xué)方法

基本原理：細(xì)胞因子（或受體）與相應(yīng)的特異性抗體（單克隆抗體或多克隆抗體）結(jié)合，通過(guò)同位素、熒光或酶等

標(biāo)記技術(shù)加以放大和顯示，從而定性或定量顯示細(xì)胞因子（或受體）的水平。

常用檢測(cè)方法：ELISA,ELISPOT,熒光標(biāo)記法（FIA）、放免法（RIA）

（2）生物學(xué)方法

1.細(xì)胞增殖法

2.靶細(xì)胞殺傷法

3.細(xì)胞因子誘導(dǎo)的產(chǎn)物分析法

4.減少細(xì)胞損傷法

（3）分子生物學(xué)法

?原理：利用細(xì)胞因子的基因探針檢測(cè)待定細(xì)胞因子基因表達(dá)的技術(shù)。

?檢測(cè)法

1.分子雜交：斑點(diǎn)雜交、Northernblot等。

2.RT-PCR

二、體液免疫

(-)B細(xì)胞增殖試驗(yàn)

(1)不同刺激物誘發(fā)增殖試驗(yàn)

抗IgM抗體、細(xì)菌脂多糖(LPS)

3H-TDR、臺(tái)盼藍(lán)法或DNA特異性染色

(2)葡萄球菌誘導(dǎo)試驗(yàn)

葡萄球菌表面SPA含量與激發(fā)B細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力成正比。

(二)抗體檢測(cè)

(1)抗體形成細(xì)胞計(jì)數(shù)

反相溶血空斑檢測(cè)

(2)抗體滴度的監(jiān)測(cè)

1.酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)

2.免疫熒光法：直接和間接法

3.流式細(xì)胞儀(FACS)

4.放射免疫法(RIA):液相法和固相法

5.免疫印跡法(WesternBlot)

論述在自身免疫性疾病中，TCV的作用機(jī)制？

1.抗獨(dú)特型反應(yīng)：TCV通過(guò)活化特異性識(shí)別病理相關(guān)性自身反應(yīng)性T細(xì)胞TCR的T細(xì)胞而發(fā)揮作用。病理性T細(xì)

胞上的TCR作為抗原表位，TCV產(chǎn)生的效應(yīng)T細(xì)胞識(shí)別該表位,產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，抗獨(dú)特型T細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞

TCR上的獨(dú)特型表位，對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用受MHC限制。

2.抗活化型反應(yīng)：針對(duì)TCR的抗獨(dú)特型調(diào)節(jié)并不是TCV的唯一作用方式；也涉及到抗動(dòng)力性免疫，即抗活化型免

疫。有絲分裂原活化的T細(xì)胞制成的疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)所有活化的T細(xì)胞免疫。調(diào)控機(jī)制較抗獨(dú)特型弱，

作用時(shí)間短，殺傷靶細(xì)胞不受MHC限制，無(wú)特異性。

機(jī)體存在對(duì)所有活化狀態(tài)T細(xì)胞起反應(yīng)的抗活化型T細(xì)胞

3.Thl/Th2細(xì)胞平衡的改變：TCV通過(guò)活化自身免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子表型轉(zhuǎn)換，改變Th1/Th2細(xì)胞平衡。Thl促進(jìn)

器官特異性自身免疫病的發(fā)生有關(guān),Th2則能防止此類(lèi)疾病的發(fā)生,Thl引發(fā)同種移植排斥反應(yīng),Th2可延長(zhǎng)同種移植

物的成活。

部分選擇題

工具前功能

限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNA

DNA連接酶催化DNA中相鄰的5,磷酸基和3,羥基形成二酯鍵

DNA聚合酶Ia.合成cDNA的第二條鏈b.缺口平移c.測(cè)序d.補(bǔ)平

反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA

多聚核甘酸激酶催化多聚核甘酸5,羥基末端磷酸化

末端轉(zhuǎn)移酶同聚物加尾

堿性磷酸酶切除末端磷酸基

免疫刺激序列ISS特點(diǎn)：

?具有回文結(jié)構(gòu)(palindromicstructure)的六聚體

?一般為5，』票吟喋吟CG喀咤喀咤3

?CpG一般為非甲基化

增強(qiáng)免疫的常用策略：

■優(yōu)化載體

■使用肌肉再生誘導(dǎo)劑

■與細(xì)胞因子聯(lián)合

■使用免疫激活DNA序列CpGODN

■注射共刺激信號(hào)分子

■與抗原蛋白聯(lián)合應(yīng)用

■形成嵌合型或多重抗原型DNA疫苗

■多表位聯(lián)合疫苗

■MVA可加強(qiáng)DNA疫苗抵抗瘧疾

■電脈沖增強(qiáng)核酸疫苗的免疫原性

■與趨化因子聯(lián)合

■微生物蛋白的佐劑效應(yīng)

目前，疫苗的安全性問(wèn)題主要有：

■導(dǎo)致腫瘤形成

■長(zhǎng)期表達(dá)抗原

■抗DNA抗體的形成

■其他因素

目的基因的篩選原則？

1.選擇病原的主要保護(hù)性抗原基因，最好是可對(duì)多數(shù)毒株都有保護(hù)作用的抗原基因。

2.可以是單個(gè)基因或具有協(xié)同保護(hù)功能的一組基因，也可以是編碼抗原決定簇的一段核昔酸序列。

3.該抗原基因遺傳的分子機(jī)制己經(jīng)研究清楚。

4.基因已經(jīng)被克隆，且表達(dá)調(diào)控機(jī)制較為清楚。

5.目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)最好能完整地、穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的染色體中，并能適時(shí)、適量表達(dá)功能性蛋白。

DC與功能相關(guān)的特性：

DC相對(duì)特異性表面標(biāo)志：DC-SIGN

表達(dá)豐富的黏附分子及共刺激因子，如ICAM、LFA-3、整合素等

DC具有顯著區(qū)別于其他細(xì)胞的表面標(biāo)志：高表達(dá)CD83、CD80、CD86、HLA-DR,HLA-DQ等典型表面標(biāo)記

?膜表面高表達(dá)MHCII類(lèi)分子并具有一些相對(duì)特異性表面標(biāo)志：

■小鼠DC：33D1和NLDC145、CDllc

■大鼠DC：0X62

■人DC：CDla、CD83和BDCA2等

陽(yáng)性選擇：排除所有非己MHC限制性T細(xì)胞

陰性選擇：排除或抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆

特性T細(xì)胞表位B細(xì)胞表位

表位受體TCRBCR

MHC分子必需無(wú)需

表位性質(zhì)主要是線性多肽天然的多肽、多糖、脂多糖、

有機(jī)化合物

表位大小8T2個(gè)氨基酸（CD&T細(xì)胞）5T5個(gè)氨基酸、5~7個(gè)單糖

12~17個(gè)氨基酸（CD4-T細(xì)胞）或5~7個(gè)核昔酸

表位類(lèi)型線性表位構(gòu)象表位：線性表位

表位位置抗原分子任意部位抗原分子表面

T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原表位的特性比較

必須至少有一個(gè)T細(xì)胞表位，才能使抗原具有免疫原性

新概念疫苗總結(jié)

名詞解釋

新概念疫苗：與傳統(tǒng)疫苗成分，機(jī)制，作用不同,且能激發(fā)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答的新型疫苗

（1.成分不同：傳統(tǒng)疫苗多為死疫苗/減毒活疫苗或重組亞單位疫苗,新概念疫苗則為編碼無(wú)毒力抗原蛋白的病毒核酸

或能激發(fā)特異性機(jī)體免疫應(yīng)答的細(xì)胞疫苗2.機(jī)制不同：傳統(tǒng)疫苗主要靠病毒的抗原蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性保護(hù)抗

體，新型疫苗不僅刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性保護(hù)抗體，而且能激發(fā)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答3.作用不同：傳統(tǒng)疫苗只能起一定

預(yù)防作用，新型疫苗不僅能預(yù)防疾病，且更能起到特異性治療作用）

核酸疫苗：把編碼外源蛋白基因的質(zhì)粒DNA直接導(dǎo)入到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，通過(guò)產(chǎn)生抗原激活

機(jī)體的免疫系統(tǒng)以引發(fā)免疫反應(yīng)。

核酶：具有催化活性的RNA,其化學(xué)本質(zhì)是核糖核酸，卻具有酶的催化功能

T細(xì)胞疫苗：將引起自身免疫性疾病的自身反應(yīng)性T細(xì)胞或?qū)е峦N移植排斥反應(yīng)的同種反應(yīng)性T細(xì)胞活化并滅

活后作為疫苗，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)致病性T細(xì)胞或同種反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而消除或減輕這些細(xì)胞的致病

作用.稱(chēng)為T(mén)細(xì)胞疫苗

Thl：特征性分泌IL-2、IFN-丫、LT等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）和巨噬細(xì)胞活化等細(xì)胞免疫

反應(yīng)。

Th2：特征分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子，主要促成B細(xì)胞增殖并分化成漿細(xì)胞，分泌特異性

抗體，介導(dǎo)體液免疫和過(guò)敏反應(yīng)。

Tel:分泌Thl樣細(xì)胞因子的亞群稱(chēng)為T(mén)el,如IL-2、IFN-Y、LT等細(xì)胞因子。

Tc2：分泌Th2樣細(xì)胞因子的亞群稱(chēng)為T(mén)c2,如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子。

T細(xì)胞表位：抗原經(jīng)過(guò)抗原遞呈細(xì)胞（APC）加工后，由MHC分子遞呈給T細(xì)胞受體（TCR）的短肽。

顯性表位：在誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答時(shí)起關(guān)鍵作用或免疫原性強(qiáng)的表位稱(chēng)為顯性表位。

樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）疫苗：荷載抗原的DC具有疫苗的功能，故稱(chēng)~

抗原提呈細(xì)胞：能攝取、加工處理抗原，并將抗原遞呈給T淋巴細(xì)胞的一類(lèi)免疫細(xì)胞，在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要

作用，也稱(chēng)輔佐細(xì)胞

專(zhuān)職APC：能組成性表達(dá)MHC-II類(lèi)分子和T細(xì)胞活化的共刺激分子，抗原遞呈能力強(qiáng)，包括巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)

胞和B細(xì)胞等

內(nèi)源性抗原：APC內(nèi)合成的，如被病毒感染細(xì)胞合成的病毒蛋白

外源性抗原：來(lái)源于細(xì)胞外的抗原，如被吞噬的細(xì)胞或細(xì)菌等

交叉遞呈：有些APC的MHC-I類(lèi)分子具有提呈外源性抗原給CD8+細(xì)胞的能力。

簡(jiǎn)答題

簡(jiǎn)述DNA疫苗表達(dá)產(chǎn)物的免疫機(jī)制：

1質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)染體細(xì)胞

表達(dá)抗原蛋白，然后通過(guò)MHC-I進(jìn)行抗原遞呈，誘發(fā)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）應(yīng)答的產(chǎn)生。

2專(zhuān)職抗原呈遞細(xì)胞（APC）遞呈肌細(xì)胞表達(dá)的外源抗原

肌細(xì)胞作為體內(nèi)抗原庫(kù)，不斷地釋放抗原至細(xì)胞間隙，然后被APCs吞噬、加工、遞呈，進(jìn)入免疫途徑。

3質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)染APC

?誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的最有效的途徑。

?質(zhì)粒DNA在APC內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原作為“內(nèi)源性抗原”，經(jīng)蛋白酶降解形成8-10aa組成的肽，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔

內(nèi)與MHC-I分子形成聚體后到達(dá)APC膜表面，被T細(xì)胞的受體識(shí)別。

?交叉激活核交叉遞呈

簡(jiǎn)述用作DNA免疫的表達(dá)載體的特點(diǎn)：

（1）在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)能高水平表達(dá)目的基因；

（2）本身不復(fù)制；

（3）不會(huì)整合到宿主染色體中

簡(jiǎn)述核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)

（1）免疫效果好

（2）易操作性和穩(wěn)定性

（3）能同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，交叉防御

（4）通過(guò)選擇免疫途徑或增加細(xì)胞因子，可誘發(fā)適合于特定病原體的Thl或Th2應(yīng)答

（5）易于構(gòu)建和使用聯(lián)合疫苗或嵌合疫苗

（6）能產(chǎn)生用常規(guī)方法不能產(chǎn)生的有效免疫原。

（7）能用各種投遞疫苗的方法

（8）具有熱穩(wěn)定性，無(wú)需特別的冷藏系統(tǒng)，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸

（9）規(guī)?；a(chǎn)，成本低廉

（10）母體抗體的存在不影響新生兒免疫

（11）使用相對(duì)安全

簡(jiǎn)述CD28與CTLA-4的功能？

90%CD4+和50%CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD28分子，而CTLA-4只表達(dá)在活化的T細(xì)胞表面

CD28和CTLA-4的天然配體都是B7分子

CD28接受APC細(xì)胞B7分子提供的刺激，向T細(xì)胞提供活化的輔助信號(hào)

CTLA-4僅表達(dá)于活化T細(xì)胞,其表達(dá)水平明顯低于CD28,它與配體結(jié)合，向活化的T細(xì)胞傳導(dǎo)抑制信號(hào)

簡(jiǎn)述T細(xì)胞表位識(shí)別抗原的特點(diǎn)

特異性：T細(xì)胞能識(shí)別大量的表達(dá)在APC表面的特異的肽-MHC復(fù)合體

敏感性：同樣的MHC分子可結(jié)合大量不同的肽，但APC上T細(xì)胞表位數(shù)很低

限制性：一個(gè)淋巴細(xì)胞只識(shí)別與一種類(lèi)型MHC分子結(jié)合的特異性抗原肽

非己性：T細(xì)胞須忽略無(wú)害的或自身抗原

順序性：T細(xì)胞僅識(shí)別多肽的順序表位

簡(jiǎn)述T細(xì)胞疫苗的制備方法

1.接種用T細(xì)胞的獲取

1）自身免疫性疾病

從發(fā)病機(jī)體的淋巴組織、炎癥浸潤(rùn)部位或外周血中分離，特異性自身抗原誘導(dǎo)，體外擴(kuò)增。

2）移植研究

用供體抗原使受體致敏，再收集相應(yīng)部位的淋巴細(xì)胞和脾細(xì)胞，制備淋巴細(xì)胞懸液，用低濃度的ConA在體外培養(yǎng)。

2.T細(xì)胞接種前的處理

1）T細(xì)胞的活化：通過(guò)特異抗原活化，或經(jīng)T細(xì)胞有絲分裂原活化

2）T細(xì)胞滅活：X射線、60C。照射或絲裂霉素C處理，低濃度戊二醛處理。

3）亞適量接種：自身免疫性T細(xì)胞的劑量低于過(guò)繼轉(zhuǎn)移自身免疫性疾病所需的劑量，無(wú)需滅活。

3.接種方式

自身免疫病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：靜脈注射臨床上：皮下多點(diǎn)免疫

同種移植實(shí)驗(yàn)：腹腔注射，術(shù)前術(shù)后多次

特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的體外功能檢測(cè)方法有那些？

1.淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

取T細(xì)胞或PBMC與不同稀釋度的抗原或APC遞呈的抗原混合培養(yǎng)3—5天，測(cè)細(xì)胞的增殖。據(jù)此判斷出淋巴細(xì)胞

對(duì)有關(guān)刺激的反應(yīng)性與功能狀態(tài)

所用方法：3H-TdR摻入法、MTT法等

2.細(xì)胞因子分泌

活化的T細(xì)胞會(huì)分泌一些細(xì)胞因子（IL-2、IFN-Y、TNF-a等）

所用方法：流式細(xì)胞術(shù)（FACS）,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA法），ELISPOT法，定量RT-PCR

3.直接細(xì)胞毒性分析

T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（LMC）是細(xì)胞毒性細(xì)胞（CTL）的特性，凡致敏的T細(xì)胞再次遇到相應(yīng)靶細(xì)胞抗原，均可

表現(xiàn)出對(duì)靶細(xì)胞的破壞和溶解作用，它是評(píng)價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫水平的一種常用指標(biāo)，特別是測(cè)定腫瘤患者CTL殺傷

腫瘤的能力，常作為判斷預(yù)后和觀察療效的指標(biāo)之一

論述題

論述DNA疫苗免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià)？

一、細(xì)胞免疫

評(píng)價(jià)方法：T細(xì)胞功能和細(xì)胞因子的檢測(cè)

（-）淋巴細(xì)胞增殖功能的檢測(cè)（淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)）：3H-TdR摻入法，MTT法，Brdu檢測(cè)法，CFSE標(biāo)記淋巴細(xì)

胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

?原理：T細(xì)胞表面具有識(shí)別抗原的受體和有絲分裂原

受體，經(jīng)特異性抗原刺激后發(fā)生一系列的變化而轉(zhuǎn)變成

為淋巴母細(xì)胞，所以又稱(chēng)為淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

?淋巴細(xì)胞增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中的重要階段。

?檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖水平，了解核酸疫苗接種后，淋巴細(xì)胞

的反應(yīng)能力和免疫功能。

（-）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（即殺傷試驗(yàn)）

?殺傷性作用：抗原特異性，致敏的T細(xì)胞再次遇到相應(yīng)靶細(xì)胞抗原，對(duì)靶細(xì)胞的破壞和溶解作用。

?殺傷機(jī)制：①穿孔素和顆粒酶②靶細(xì)胞的程序性死亡

原則：

適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞一標(biāo)記一按一定比例與淋巴細(xì)胞混合一共溫一段時(shí)間一觀察殺傷情況

1.放射測(cè)定法

（1）51Cr釋放試驗(yàn)

（2）3H-TdR釋放試驗(yàn)

2.非放射測(cè)定法

乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗(yàn)

(三)細(xì)胞因子(cytokines)的檢測(cè)

?定義：免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞合成和分泌的具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理功能的小分子多肽類(lèi)因子。

?常見(jiàn)：IL、IFN、CSF、TNF、TGF

(1)免疫學(xué)方法

基本原理：細(xì)胞因子(或受體)與相應(yīng)的特異性抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)結(jié)合，通過(guò)同位素、熒光或酶等

標(biāo)記技術(shù)加以放大和顯示，從而定性或定量顯示細(xì)胞因子(或受體)的水平。

常用檢測(cè)方法:ELISA、ELISPOT、熒光標(biāo)記法(FIA)、放免法(RIA)

(2)生物學(xué)方法

1.細(xì)胞增殖法

2.靶細(xì)胞殺傷法

3.細(xì)胞因子誘導(dǎo)的產(chǎn)物分析法

4.減少細(xì)胞損傷法

(3)分子生物學(xué)法

?原理：利用細(xì)胞因子的基因探針檢測(cè)待定細(xì)胞因子基因表達(dá)的技術(shù)。

?檢測(cè)法

1.分子雜交：斑點(diǎn)雜交、Northernblot等。

2.RT-PCR

二、體液免疫

(-)B細(xì)胞增殖試驗(yàn)

(1)不同刺激物誘發(fā)增殖試驗(yàn)

抗IgM抗體、細(xì)菌脂多糖(LPS)

3H-TDR、臺(tái)盼藍(lán)法或DNA特異性染色

(2)葡萄球菌誘導(dǎo)試驗(yàn)

葡萄球菌表面SPA含量與激發(fā)B細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力成正比。

(二)抗體檢測(cè)

(1)抗體形成細(xì)胞計(jì)數(shù)

反相溶血空斑檢測(cè)

(2)抗體滴度的監(jiān)測(cè)

1.醐聯(lián)免疫分析法(ELISA)

2.免疫熒光法：直接和間接法

3.流式細(xì)胞儀(FACS)

4.放射免疫法(RIA):液相法和固相法

5.免疫印跡法(WesternBlot)

論述在自身免疫性疾病中，TCV的作用機(jī)制？

1.抗獨(dú)特型反應(yīng)：TCV通過(guò)活化特異性識(shí)別病理相關(guān)性自身反應(yīng)性T細(xì)胞TCR的T細(xì)胞而發(fā)揮作用。病理性T細(xì)

胞上的TCR作為抗原表位，TCV產(chǎn)生的效應(yīng)T細(xì)胞識(shí)別該表位,產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，抗獨(dú)特型T細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞

TCR上的獨(dú)特型表位，對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用受MHC限制。

2.抗活化型反應(yīng)：針對(duì)TCR的抗獨(dú)特型調(diào)節(jié)并不是TCV的唯一作用方式；也涉及到抗動(dòng)力性免疫，即抗活化型免

疫。有絲分裂原活化的T細(xì)胞制成的疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)所有活化的T細(xì)胞免疫。調(diào)控機(jī)制較抗獨(dú)特型弱，

作用時(shí)間短，殺傷靶細(xì)胞不受MHC限制，無(wú)特異性。

機(jī)體存在對(duì)所有活化狀態(tài)T細(xì)胞起反應(yīng)的抗活化型T細(xì)胞

3.Thl/Th2細(xì)胞平衡的改變：TCV通過(guò)活化自身免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子表型轉(zhuǎn)換，改變Thl/Th2細(xì)胞平衡。Thl促進(jìn)

器官特異性自身免疫病的發(fā)生有關(guān),Th2則能防止此類(lèi)疾病的發(fā)生,Thl引發(fā)同種移植排斥反應(yīng),Th2可延長(zhǎng)同種移植

物的成活。

部分選擇題

工具酶功能

限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNA

DNA連接酶催化DNA中相鄰的5,磷酸基和3,羥基形成二酯鍵

DNA聚合酶Ia.合成cDNA的第二條鏈b.缺口平移&測(cè)序d.補(bǔ)平

反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA

多聚核甘酸激酶催化多聚核甘酸5,羥基末端磷酸化

末端轉(zhuǎn)移酶同聚物加尾

堿性磷酸酶切除末端磷酸基

免疫刺激序列ISS特點(diǎn)：

?具有回文結(jié)構(gòu)(palindromicstructure)的六聚體

?一般為5U票吟喋吟CGR密咤口密咤3

?CpG一般為非甲基化

增強(qiáng)免疫的常用策略：

■優(yōu)化載體

■使用肌肉再生誘導(dǎo)劑

■與細(xì)胞因子聯(lián)合

■使用免疫激活DNA序列CpGODN

■注射共刺激信號(hào)分子

■與抗原蛋白聯(lián)合應(yīng)用

■形成嵌合型或多重抗原型DNA疫苗

■多表位聯(lián)合疫苗

■MVA可加強(qiáng)DNA疫苗抵抗瘧疾

■電脈沖增強(qiáng)核酸疫苗的免疫原性

■與趨化因子聯(lián)合

■微生物蛋白的佐劑效應(yīng)

目前，疫苗的安全性問(wèn)題主要有：

■導(dǎo)致腫瘤形成

■長(zhǎng)期表達(dá)抗原

■抗DNA抗體的形成

■其他因素

目的基因的篩選原則？

1.選擇病原的主要保護(hù)性抗原基因，最好是可對(duì)多數(shù)毒株都有保護(hù)作用的抗原基因。

2.可以是單個(gè)基因或具有協(xié)同保護(hù)功能的一組基因，也可以是編碼抗原決定簇的一段核甘酸序列。

3.該抗原基因遺傳的分子機(jī)制已經(jīng)研究清楚。

4.基因已經(jīng)被克隆，且表達(dá)調(diào)控機(jī)制較為清楚。

5.目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)最好能完整地、穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的染色體中，并能適時(shí)、適量表達(dá)功能性蛋白。

DC與功能相關(guān)的特性：

DC相對(duì)特異性表面標(biāo)志：DC-SIGN

表達(dá)豐富的黏附分子及共刺激因子，如ICAM、LFA-3、整合素等

DC具有顯著區(qū)別于其他細(xì)胞的表面標(biāo)志：高表達(dá)CD83、CD80、CD86、HLA-DR,HLA-DQ等典型表面標(biāo)記

?膜表面高表達(dá)MHCII類(lèi)分子并具有一些相對(duì)特異性表面標(biāo)志:

■小鼠DC：33D1和NLDC145、CDllc

■大鼠DC：0X62

■人DC：CDla、CD83和BDCA2等

陽(yáng)性選擇：排除所有非己MHC限制性T細(xì)胞

陰性選擇：排除或抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆

特性T細(xì)胞表位B細(xì)胞表位

表位受體TCRBCR

MHC分子必需無(wú)需

表位性質(zhì)主要是線性多肽天然的多肽、多糖、脂多糖、

有機(jī)化合物

表位大小8T2個(gè)氨基酸(CD8F細(xì)胞)5T5個(gè)氨基酸、5~7個(gè)單糖

12T7個(gè)氨基酸(CD4-T細(xì)胞)或5~7個(gè)核首酸

表位類(lèi)型線性表位構(gòu)象表位；線性表位

表位位置