以啤酒廢酵母為原料生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)酵母提取物

以啤酒廢酵母為原料生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)酵母提取物任光輝;王德良;林智平;郭立蕓;蘇東海【摘要】ABSTRACTThestudyfocusedonakindofhigh-qualityyeastextractprocessingtechnologybasedonspentbrew-er'syeast.Theprocessincludedremovalofimpurity,debittering,enzymolysis,concentrationandspraydehydration,afterwhichakindoflightyellowyeastextractpowderwithwellwater-solubilitycanbeobtained.Duringtheprocess,71.00%ofrawyeast'stotalamount,whichbemeasuredbyabsolutelydryweight,cameintothefinalproduct,andthepercentforcrudeproteinwas85.55%.AnalysisresultottheproductsnowedmatlotJgyeastextracteonta~neu52.90gcrudeprotein,26.48gCarbohydrate,0.20gfat,11.08gashand9.34gdietaryfiber.What'smore,freeaminoacidsandoligopeptidewasthemainformofnitrogenintheyeastextract,anditwillbeofgreatimportantpo-tentialmaterialforhealth-carefood.%研究了以啤酒生產(chǎn)中廢棄酵母為原料的優(yōu)質(zhì)酵母提取物制備工藝。啤酒廢酵母經(jīng)除雜、洗滌脫苦、細胞破碎、蛋白水解、濃縮干燥等加工程序,獲得一種水溶性良好淡黃色、粉末狀酵母提取物產(chǎn)品。該產(chǎn)品的原料利用率為71.00%,粗蛋白利用率為85.55%。100g絕干酵母提取物含有粗蛋白52.90g、膳食纖維9.34g、灰分11.08g、脂肪0.20g、碳水化合物26.48g,其中粗蛋白主要以游離氨基酸和低聚肽形式存在。【期刊名稱】《食品與發(fā)酵工業(yè)》年(卷),期】2012(038)011【總頁數(shù)】5頁(P184-188)【關(guān)鍵詞】啤酒廢酵母;酵母提取物;氨基酸;低聚肽【作者】任光輝;王德良;林智平;郭立蕓;蘇東?！咀髡邌挝弧恐袊称钒l(fā)酵工業(yè)研究院,北京100027;中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京100027;北京燕京啤酒股份有限公司,北京101300;北京燕京啤酒股份有限公司,北京101300;北京電子科技職業(yè)學(xué)院,北京100029【正文語種】中文【中圖分類】TS262.5啤酒廢酵母是啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在啤酒生產(chǎn)中以麥汁為生長介質(zhì)進行增殖發(fā)酵，且完成發(fā)酵后由于活力低于啤酒生產(chǎn)所需或產(chǎn)量超出啤酒廠正?；厥绽昧慷a(chǎn)生的副產(chǎn)物。每生產(chǎn)1000t啤酒可附帶產(chǎn)生1~1.5t廢棄酵母[1]。2002年~2011年，我國啤酒產(chǎn)量以年均7.46%的比例逐年遞增，所產(chǎn)生的廢酵母也越來越多，如何有效提高這部分酵母的附加值成為副產(chǎn)物利用研究領(lǐng)域的熱點。啤酒酵母是公認的安全可食用微生物，粗蛋白占其細胞干重的46%左右，還含有豐富的B族維生素和由胞壁多糖組成的膳食纖維[2],是理想的復(fù)合型保健食品加工原料。酵母提取物一般是酵母在酶促、化學(xué)或機械作用下細胞壁膜結(jié)構(gòu)被破壞而釋放的水溶性細胞成分，可用于微生物培養(yǎng)、肉味香精及調(diào)味料生產(chǎn)等諸多領(lǐng)域目前酵母提取物生產(chǎn)所用酵母主要是以糖蜜為原料培養(yǎng)的面包酵母，而啤酒廢酵母則主要是直接干燥后用作動物飼料。本文研究內(nèi)容是以啤酒廢酵母為原料的優(yōu)質(zhì)酵母提取物制備工藝，所得酵母提取物可用作保健食品加工原料。1材料和方法主要材料啤酒廢酵母，某啤酒公司;Alcalase2.4L堿性蛋白酶、Neutrase0.8L中性蛋白酶、Flavourzyme1000L風(fēng)味蛋白酶，諾維信(中國)投資有限公司。蛋白酶信息見表1。表1蛋白酶信息1)注1):參考諾維信相應(yīng)蛋白酶說明書及參考文獻數(shù)據(jù)[4－6]。蛋白酶密度/?mL-1)標注酶活力實測活力[3]/(u?g-1)最適溫度/°C最適pH值A(chǔ)lcalase2.4L缺2.4AU-A/g6.00x105507.0609.0Neutrase0.8L1.260.8AU-NH/g2.42x104557.5Flavourzyme1000L1.271000LAPU/g4.53x104主要儀器AH100D高壓均質(zhì)機，ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司；HZS-H水浴振蕩器，東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;Vapodest50s自動凱氏定氮儀，德國格哈特實驗儀器公司;高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。實驗方法工藝流程啤酒廢酵母-除雜-洗滌脫苦-細胞破碎-酶解蛋白-離心取上清-蒸發(fā)濃縮-噴霧干燥f酵母提取物除雜取發(fā)酵罐底部沉積的酵母泥漿，加入等體積水后攪勻，過80目篩子2次，濾除酵母中摻雜的酒花樹脂顆粒及麥糟，4000r/min離心10min后取酵母泥。洗滌脫苦用0.5%(w/v)NaHCO3溶液將除雜后的酵母泥依濕重配成20%(w/w)細胞懸浮液，常溫攪拌15min后離心(4000r/min,10min)[7],除去酵母細胞在啤酒發(fā)酵過程中吸附的以酒花a-酸為主的苦味質(zhì)，再以相同方法水洗1次脫除洗滌劑。細胞破碎20%(w/w)細胞懸浮液進入高壓均質(zhì)機循環(huán)均質(zhì)破碎，控制均質(zhì)壓力與循環(huán)次數(shù)。酶解蛋白調(diào)節(jié)細胞破碎液pH值，取適量到錐形瓶，加塞封口，85°C處理15min使蛋白變性，同時抑制酶解中微生物的繁殖。冷卻后添加蛋白酶，加塞并置于水浴振蕩器中120rpm振蕩水解，控制時間和溫度。酶解完成后立即在85C下滅酶15min。離心取上清液。綜合3種酶的最適作用條件(表1)、反應(yīng)溫和性與后處理方便性，設(shè)計A、B兩組酶解實驗，參數(shù)如表2所示。表2蛋白酶篩選試驗參數(shù)設(shè)計實驗設(shè)計/hA組添酶量/%(v/v)水解溫度/C初始pH值水解時間/h取樣時間間隔0.28556.19244B組0.14507.008.051.15細胞破碎率與細胞破碎后的蛋白溶出率測定利用血球計數(shù)板分別對破碎前后單位體積細胞懸浮液中外形完整細胞計數(shù)，計算細胞破碎率;測定破碎液及其離心(13000r/min,10min)后上清液的總氮含量，上清液中總氮含量占破碎液總氮含量的百分比即為蛋白溶出率。本文中破碎和酶解工藝涉及“含量”單位均為mg/L。總氮、酸溶性蛋白氮、游離氨基酸態(tài)氮及肽氮的測定總氮(totalnitrogen,TN):自動凱氏定氮儀法[8];酸溶性蛋白氮(acid-solubleproteinnitrogen,ASPN)測定依據(jù)國家標準[9]修改:16mL水解液中加入75%三氯乙酸(w/v)溶液4mL，充分混勻后靜置10min,4000r/min離心10min,取上清測TN含量，結(jié)果乘以1.25即ASPN含量;游離氨基酸態(tài)氮(freeaminoacidnitrogen,FAN):甲醛值法[10];ASPN含量扣除FAN含量，即為肽氮(peptidenitrogen,PN)[9];ASPN轉(zhuǎn)化率、PN轉(zhuǎn)化率為各自含量占水解液TN含量的百分比。提取物分析及計算方法原料利用率分別精確稱量酶解前破碎液和酶解后離心除去殘渣的上清液重量，測定含水量［11］，計算絕干固形物總量，以后者絕干固形物總量占前者的百分比作為原料利用率。粗蛋白利用率分別測定酶解前破碎液和酶解后離心除去殘渣的上清液中TN總量，以后者TN總量占前者的百分比作為粗蛋白利用率。基本成分分析方法粗蛋白:酶解后離心除去殘渣后的上清液中TN總量乘以6.25作為粗蛋白總量;灰分:馬弗爐灼燒法［12］;脂肪:索氏提取法［13］;膳食纖維:酶重量法［14］;碳水化合物:減差法［15］;各成分含量:各成分總量占上清液中絕干固形物總量的百分比。肽分子量測定采用高效凝膠過濾色譜法［16］。2結(jié)果與分析酵母細胞破碎均質(zhì)壓力分別采用4個不同壓力對酵母細胞懸浮液循環(huán)均質(zhì)3次，結(jié)果見圖1。圖1均質(zhì)壓力對細胞破碎率與蛋白溶出率的影響從圖1看來，細胞破碎率隨均質(zhì)壓力提高呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢，而蛋白溶出率僅在100MPa以下有此趨勢，120MPa與100MPa處理的蛋白溶出率同為43%?？紤]到工業(yè)化生產(chǎn)的可行性，選擇100MPa作為酵母細胞破碎壓力。均質(zhì)次數(shù)100MPa壓力下對同一酵母細胞懸浮液循環(huán)均質(zhì)破碎，對不同均質(zhì)次數(shù)的破碎液取樣測定細胞破碎率和蛋白溶出率。從圖2可以看出，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，細胞破碎率逐漸提高，而蛋白溶出率幾乎沒有變化。這種現(xiàn)象可能是由酵母“非碎片化細胞破損”造成的，即在400倍放大視野中部分酵母細胞外形完整，而實際已經(jīng)出現(xiàn)較大破損，這種破損可能比酶溶法造成的細胞壁膜孔洞更大，足以使內(nèi)容物釋放達到極限。試驗中蛋白極限溶出率為48%左右，另有52%粗蛋白不溶于水或附著在不溶性細胞碎片上。圖2循環(huán)均質(zhì)次數(shù)對細胞破碎率與蛋白溶出率的影響后續(xù)工藝中破碎液經(jīng)蛋白酶處理，粗蛋白進一步游離，酵母“非碎片化細胞破損”對最終粗蛋白溶出情況影響如圖3所示。圖3中所示是采用優(yōu)化后酶解參數(shù)對不同均質(zhì)次數(shù)破碎液的水解結(jié)果：100MPa壓力下反復(fù)均質(zhì)無益于提高酶解后ASPN和PN轉(zhuǎn)化率;酶解后，均質(zhì)處理的細胞懸浮液中ASPN轉(zhuǎn)化率是未經(jīng)處理的2.7倍。因此，均質(zhì)1次即可達到最大程度提高粗蛋白利用率的目的。此外，細胞內(nèi)容物釋放情況作為判斷微生物細胞破碎效果的指標比直接計數(shù)法更為科學(xué)。圖3均質(zhì)次數(shù)對酶解后ASPN和PN轉(zhuǎn)化率的影響酵母蛋白的水解蛋白酶篩選圖4中A組3種蛋白酶處理水解液的ASPN轉(zhuǎn)化率峰值接近，Neutrase峰值略高;三者均在4h時達到峰值并平衡，相對24h的水解時間，0.28%的酶添加量屬過量添加。圖5中A組3種水解液的PN轉(zhuǎn)化率變化趨勢差異明顯，雖同在4h附近達到峰值，其后Neutrase保持平穩(wěn)，Alcalase轉(zhuǎn)而下降，而Flavourzyme的峰值則比前兩者低很多。圖6、圖7分別表示B組3種蛋白酶處理水解液的ASPN轉(zhuǎn)化率和PN轉(zhuǎn)化率。A、B2組試驗條件不同，但兩指標的變化趨勢相似。分析以上現(xiàn)象原因:Flavourzyme中端肽酶活力高，所處理水解液的ASPN中FAN比例在50%以上;Alcalase中也有一定量端肽酶，故PN在達到峰值后又逐漸轉(zhuǎn)化為FAN;Neutrase則以內(nèi)切酶為主，端肽酶活力低，水解液中肽含量較前兩者高。圖4A組ASPN轉(zhuǎn)化率圖5A組PN轉(zhuǎn)化率圖6B組ASPN轉(zhuǎn)化率圖7B組PN轉(zhuǎn)化率研究表明，在動物小腸內(nèi)一部分蛋白質(zhì)是以小肽形式被吸收和轉(zhuǎn)運的，相比游離氨基酸，小肽的吸收轉(zhuǎn)運機制具備能耗低、轉(zhuǎn)運快、載體不易飽和等優(yōu)點，營養(yǎng)作用高于游離氨基酸[17],而吸收利用率高于大分子蛋白。本文以PN轉(zhuǎn)化率作為水解效果的主要評價指標，次要指標為ASPN轉(zhuǎn)化率。兩組實驗中Neutrase處理水解液的PN轉(zhuǎn)化率和ASPN轉(zhuǎn)化率均為最高，故選用Neutrase0.8L中性蛋白酶。酶解參數(shù)的回歸正交試驗經(jīng)單因素試驗確定正交優(yōu)化參數(shù)范圍:酶添加量0.07-0.11%;水解溫度46~50工；細胞破碎液初始PH6.8-7.2。通過Minitab15.1軟件設(shè)計3因素3水平Box-behnken二次回歸正交試驗，分別建立PN轉(zhuǎn)化率Y1、ASPN轉(zhuǎn)化率Y2關(guān)于酶添加量XI、水解溫度X2、細胞破碎液初始pH值X3的多項回歸方程，并確定最優(yōu)水解條件。試驗設(shè)計與結(jié)果如表3所示。表3試驗設(shè)計與結(jié)果1)注1):各因素單位:X1,單位u/g;X2，單位°C。2):酶添加量1038.56、1335.30、1632.03u/g為水解液中1g酵母粗蛋白對應(yīng)的酶活力添加量，分別相當于0.07%、0.09%、0.11%的酶液體積添加量。運行序X12)X2X3Y1Y211335.30487.00.49290.946421632.03467.00.56320.996331335.30466.80.53970.982941038.56486.80.50140.949851038.56467.00.53340.976761632.03486.80.54750.995871335.30507.20.49940.939681632.03487.20.53190.985391335.30487.00.50560.9458101038.56487.20.49710.9577111335.30487.00.46570.9344121038.56507.00.47840.9268131632.03507.00.52740.9758141335.30467.20.53980.9882151335.30506.80.56181.0000擬合回歸方程如下:方程回歸關(guān)系的方差分析結(jié)果:兩方程的總回歸及各項因素P值均小于0.05，說明Y1、Y2與試驗因素存在顯著的回歸關(guān)系;失擬性檢驗P值均大于0.01,失擬性不顯著，說明兩方程在整個回歸空間內(nèi)擬合度較好。Y1經(jīng)軟件響應(yīng)優(yōu)化器（目標“望大”，下限0.57，望目0.60）確定采用Neutrase0.8L水解酵母破碎液的最理想條件:1g酵母粗蛋白添加酶1632.03u，水解溫度46工，細胞破碎液初始pH6.8。將此參數(shù)帶入回歸方程:PN轉(zhuǎn)化率58.41%,ASPN近100%。驗證試驗中，該條件下PN轉(zhuǎn)化率56.42%、ASPN轉(zhuǎn)化率100%，前者雖不及理論值，仍高于正交試驗所有結(jié)果。提取物分析制備工藝的原料利用率、蛋白利用率及提取物基本成分分析如表4所示，該提取物具有明顯的高蛋白、高膳食纖維、低脂肪特點。肽分子質(zhì)量（表5）全部低于10000u,1000u以上的肽占5.32%，提取物中粗蛋白主要以1000u以下的低聚肽和游離氨基酸形式存在。表4原料利用率與基本成分分析/%蛋白質(zhì)基本成分含量52.90灰分11.08膳食纖維9.34脂類0.20碳水化合物26.48原料利用率/%71.00蛋白利用率/%85.55表5肽分子質(zhì)量測定結(jié)果/%分子質(zhì)量范圍/u重均分子質(zhì)量/u峰面積百分比10000以上005000~1000059870.06613000-500038210.20091000~300013705.0621500-100069015.7554140~50026560.2819140以下5314.5579總平均重均分子質(zhì)量/u3573結(jié)論形成酵母提取物制備工藝如下:啤酒廢酵母泥與等體積水混勻，過80目篩子兩次，離心(4000r/min，10min);用0.5%(w/v)NaHCO3溶液依酵母泥濕重配成20%(w/w)細胞懸浮液，常溫攪拌15min后離心，以同樣方式水洗1次;配成20%(w/w)細胞懸浮液，經(jīng)高壓均質(zhì)機100MPa壓力下處理1次;以NaOH調(diào)節(jié)破碎液pH值為6.8，經(jīng)蛋白熱變性處理(85工保溫15min)后，以每1g粗蛋白加入1632.03u活力單位的中性蛋白酶的量(體積添加量為0.11%的Neutrase0.8L,或等活力添加量的其他中性蛋白酶)添加酶液，120r/min振蕩、46工水解8h;立即進行滅酶處理;離心除去殘渣后經(jīng)蒸發(fā)濃縮、噴霧干燥即得酵母提取物產(chǎn)品。酵母細胞水解液中原酵母粗蛋白幾乎全部轉(zhuǎn)化為ASPN，產(chǎn)品粗蛋白利用率較高。提取物中粗蛋白含量52.90%，主要以低聚肽和氨基酸形式存在，膳食纖維豐富，脂肪較低，是生產(chǎn)復(fù)合型保健食品的理想原料。參考文獻[1]管敦儀?啤酒工業(yè)手冊(修訂版)[M].北京:中國輕工業(yè)出版社，2007:606.[2]BoonyeunP，ShotiprukA，PrommuakC，etal.Enhancementofaminoacidproductionbytwo-stepautolysisofspentbrewer'syyeast[J]．ChemicalEngineeringCommunications，2011，198(12):1594－1602.[3]中華人民共和國國家標準?蛋白酶制劑[S].GB/T23527-2009.GuerarF，DufosseL，BroiseD.L.etal.，Enzymatichydrolysisofproteinsfromyellowfintuna(Thunnusalbacores)wastesusingAlcalase[J].JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic，2001，11(4-6):1051-1059.MotamedzadeganA，DavarniamB，AsadiG，etal.OptimizationofenzymatichydrolysisofyellowfintunaThunnusalbacaresviscerausingNeutrase[J]．InternationalAquaticResearch，2010，2(3):173－181.BenjakulS，MorrisseyMT.Proteinhydrolysatesfrompacificwhitingsolidwastes[J]．JournalofAgriculturalandFoodChemistry，1997，45(9):3423－3430.謝閣，楊瑞金，盧蓉蓉等.高壓脈沖電場和超聲波協(xié)同作用破碎啤酒廢