堿性磷酸酶的分離提取

關(guān)于堿性磷酸酶的分離提取第一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二2堿性磷酸酶

廣泛存在于微生物界和動物界。堿性磷酸酶能催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng)，產(chǎn)生無機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，磷酸基團(tuán)從磷酸酯轉(zhuǎn)移到醇、酚或糖等磷酸受體上。

第二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二3如何獲取堿性磷酸酶

堿性磷酸酶（AKP）溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中則形成沉淀。通過離心可以使AKP和其他蛋白分離，從而得到純化。反復(fù)進(jìn)行純化的操作，可以獲得較高純度的AKP。第三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二4

1.綜合運(yùn)用有機(jī)溶劑沉淀、離心、分光等方法，從組織中分離純化及鑒定特定蛋白質(zhì)的技能。2.掌握堿性磷酸酶制備的操作技術(shù)及鑒定的方法實驗?zāi)康牡谒捻?，共十九頁，編輯?023年，星期二5

實驗原理堿性磷酸酶在堿性環(huán)境中作用于磷酸苯二鈉，使之水解生成酚和磷酸鹽。酚在堿性溶液中與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化形成紅色醌類衍生物，其顏色深淺與AKP活性成正比。第五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二6堿性磷酸酶的提取稱取兔肝2g,剪碎后置于玻璃勻漿器中，加入0.01mol/L的醋酸鎂及醋酸鈉混合液4ml,進(jìn)行勻漿。將其轉(zhuǎn)入離心管，并加2ml0.01mol/L的醋酸鎂及醋酸鈉混合液清洗勻漿器，之后將之倒入離心管，與原來的勻漿液混合。記錄體積a，取0.1ml作為A液于EP管，待測比活性用。第六頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二7堿性磷酸酶的提取在離心管中剩余的液體加入2ml正丁醇，玻璃棒攪拌2min，室溫放置30min，紗布過濾，置于離心管。第七頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二8堿性磷酸酶的純化

濾液加入等體積的冷丙酮，邊倒邊搖，混勻后3000r/min5min。棄上清，沉淀用4ml0.5mol/LMg(AC)2溶解。記錄體積b。取0.1ml作為B液于EP管，待測比活性用。

在懸液中緩慢加入冷95%乙醇使其終體積為30%（0.46體積），混勻后2000r/min5min，轉(zhuǎn)移上清液于另一離心管。

上清液中緩慢加入冷95%乙醇使其終體積為60%（0.85體積），混勻后3000r/min5min，沉淀用4ml0.01MMg(AC)2、NaAC混合液攪拌混懸。第八頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二9堿性磷酸酶的純化

其余懸液中緩慢加入冷丙酮，使得丙酮的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到33%（0.5體積），混勻后2000r/min離心5min，取上清液丟棄沉淀。上清液中緩慢加入冷丙酮，使丙酮終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%(0.34體積），混勻后3000r/min離心15min。沉淀中加入Tris-醋酸鎂緩沖液5ml，即為純化酶液。作為D液用于比活性測定。第九頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二10第十頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二11堿性磷酸酶活性的鑒定磷酸苯二鈉

磷酸鹽+酚

酚+4-氨基安替比林

紅色醌類衍生物

AKP是一種底物特異性較低，在堿性環(huán)境中能水解磷酸基團(tuán)。最適pH范圍為8.8~10,需要鎂離子作為激活劑。AKP

鐵氰化鉀第十一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二12第十二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二13

管號空白標(biāo)準(zhǔn)ABCD酶液體0.10.10.10.1酚標(biāo)準(zhǔn)液0.1Tris-Mg(AC)20.1復(fù)合底物3.03.03.03.03.03.0第十三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二14

加入底物后,立即混勻,37℃準(zhǔn)確15min后加入0.5%鐵氰化鉀2.0ml終止反應(yīng),混勻,靜置15min,510nm比色第十四頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二15

酶活性單位（U/ml)=A樣A標(biāo)*0.1*稀釋倍數(shù)第十五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二16

蛋白質(zhì)含量測定基本原理——BCA法第