分子生物學(xué)基礎(chǔ)與基因檢測(cè)技術(shù)-2016

基因的基本概念人體-組織-器官-細(xì)胞-細(xì)胞核-染色體-DNA-基因基因檢測(cè)的基本原理和檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)介基因芯片技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)分析和未來(lái)發(fā)展主要內(nèi)容第一頁(yè)，共39頁(yè)。？？？？？。。。206塊骨頭、650條肌肉、100多個(gè)關(guān)節(jié)3億個(gè)肺泡，體積為米的十分之一每晝夜跳動(dòng)十萬(wàn)次，每天排出9000升血液，血管長(zhǎng)約9000多公里平均重1.2公斤，體積1.5立方分米，150億個(gè)單元，耗能功率10w，信息容量10^15比特大數(shù)據(jù)第二頁(yè)，共39頁(yè)。神奇的人體第三頁(yè)，共39頁(yè)。人體九大系統(tǒng)（Ninehumanbodysystem）消化系統(tǒng)骨骼系統(tǒng)淋巴系統(tǒng)呼吸系統(tǒng)肌肉系統(tǒng)內(nèi)分泌系統(tǒng)循環(huán)系統(tǒng)神經(jīng)系統(tǒng)生殖系統(tǒng)第四頁(yè)，共39頁(yè)。器官（Organ）由幾種不同類(lèi)型的組織聯(lián)合形成的，具有一定的形態(tài)特征和一定生理機(jī)能的結(jié)構(gòu)。第五頁(yè)，共39頁(yè)。組織（Tissue）由形態(tài)相似，結(jié)構(gòu)、功能相同的細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)聯(lián)合在一起形成的細(xì)胞群叫做組織（tissue）上皮組織結(jié)締組織肌肉組織神經(jīng)組織第六頁(yè)，共39頁(yè)。細(xì)胞-人體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位第七頁(yè)，共39頁(yè)。遺傳深度壓縮的聚合體-染色體第八頁(yè)，共39頁(yè)。等位基因，在同一基因座上、但來(lái)源不同的同一基因單倍型，是指同一染色體區(qū)域中相互連鎖的兩個(gè)不同的基因位點(diǎn)等位基因和單倍型第九頁(yè)，共39頁(yè)。生物主要的遺傳物質(zhì)-DNA第十頁(yè)，共39頁(yè)?；蚴怯羞z傳效應(yīng)的DNA片段Gene第十一頁(yè)，共39頁(yè)。遺傳中心法則（geneticcentraldogma）第十二頁(yè)，共39頁(yè)。單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism,SNPs）：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性指在基因組中不同個(gè)體的DNA序列上的單個(gè)堿基差異。同一位置上的每個(gè)堿基類(lèi)型叫做一個(gè)等位位點(diǎn)。單核苷酸多態(tài)性（SNP）第十三頁(yè)，共39頁(yè)。甲基化（

methylation）第十四頁(yè)，共39頁(yè)。胚胎發(fā)育早期多處于高甲基化狀態(tài)甲基化（

methylation）第十五頁(yè)，共39頁(yè)。人體四種組織：上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組織和神經(jīng)組織細(xì)胞是人體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位染色體：由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段甲基化是調(diào)控基因表達(dá)的一種方式小結(jié)第十六頁(yè)，共39頁(yè)?；驒z測(cè)的基本原理和檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)介基于構(gòu)象的檢測(cè)方法測(cè)序?qū)崟r(shí)熒光PCR以雜交為基礎(chǔ)（基因芯片）內(nèi)切酶技術(shù)光譜和電子信號(hào)其他方法，如磁性納米技術(shù)、飛行質(zhì)譜等第十七頁(yè)，共39頁(yè)。雙脫氧末端終止法(Sanger測(cè)序法)1970s同位素標(biāo)記，手工1980s熒光標(biāo)記，自動(dòng)1990s毛細(xì)管電泳合成測(cè)序法（第二代測(cè)序）焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing,Roche/454）合成測(cè)序（Sequencing-By-Synthesis,Illumina/Solexa）連接測(cè)序（Sequencing-By-Ligation,ABI/SOLiD）單分子測(cè)序技術(shù)（第三代測(cè)序）HelicosPacificBiosciencesOxfordNanopore測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷史第十八頁(yè)，共39頁(yè)。測(cè)序費(fèi)用不斷降低第十九頁(yè)，共39頁(yè)。Sanger法DNA測(cè)序的原理雙氧核苷三磷酸（ddTBP）作為鏈終止劑在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP后，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開(kāi)競(jìng)爭(zhēng)，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長(zhǎng)度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現(xiàn)過(guò)早鏈終止的位置之間的距離。在4組獨(dú)立的酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的每一個(gè)A、T、C和G的位置上。動(dòng)畫(huà)演示第二十頁(yè)，共39頁(yè)。測(cè)序的原理是DNA鏈終止法，這注定了一個(gè)反應(yīng)所測(cè)序列不可能太長(zhǎng)，目前為1000個(gè)核苷酸左右。測(cè)序反應(yīng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力測(cè)序準(zhǔn)確度不高結(jié)構(gòu)復(fù)雜的難于進(jìn)行PCR反應(yīng)的片段不能測(cè)序。一代測(cè)序技術(shù)的缺點(diǎn)第二十一頁(yè)，共39頁(yè)。第二代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)——循環(huán)陣列合成測(cè)序法新一代測(cè)序技術(shù)（NextGenerationGequencing，NGS）代表技術(shù)為羅氏公司(Roche)的454測(cè)序儀(RocheGSFLXsequencer)（2005）Illumina公司的Solexa基因組分析儀(IlluminaGenomeAnalyzer)ABI的SOLiD測(cè)序儀(ABISOLiDsequencer)（2007）動(dòng)畫(huà)演示第二十二頁(yè)，共39頁(yè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timefluorogeneticquantitativePCR,RQ-PCR)是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)它是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法實(shí)時(shí)熒光PCR的分類(lèi)：標(biāo)記方法：熒光標(biāo)記探針（Taqman）；雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合染料SYBRgreen檢測(cè)基因表達(dá)：絕對(duì)定量；相對(duì)定量檢測(cè)SNP：ARMS-PCR；HARM第二十三頁(yè)，共39頁(yè)。擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)多聚鏈酶式擴(kuò)增(ARMS-PCR)第二十四頁(yè)，共39頁(yè)。HRM進(jìn)行SNP檢測(cè)原理高分辨率融解曲線(HRM)是一種分析DNA融解曲線的新方法.第二十五頁(yè)，共39頁(yè)。生物芯片將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷虾笈c帶熒光標(biāo)記的DNA或其他樣品分子（例如蛋白，因子或小分子）進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。第二十六頁(yè)，共39頁(yè)。生物芯片被動(dòng)式芯片主動(dòng)式芯片基因（DNA）芯片蛋白質(zhì)芯片微流控芯片：樣品制備芯片、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）芯片、毛細(xì)管電泳芯片和色譜芯片cDNA芯片寡核苷酸芯片組織芯片細(xì)胞芯片芯片實(shí)驗(yàn)室：樣品制備、試劑輸送、生化反應(yīng)、結(jié)果檢測(cè)、信息處理和傳遞等一系列復(fù)雜工作生物芯片分類(lèi)第二十七頁(yè)，共39頁(yè)。將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段有規(guī)律地排列固定于支持物（如膜、硅片、陶瓷片及玻片）上，然后通過(guò)類(lèi)似于Northern，Southern的方法與待測(cè)的標(biāo)記樣品按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行掃描，并用相應(yīng)軟件對(duì)信號(hào)進(jìn)行比較和檢測(cè)，得到所需的大量信息，進(jìn)行基因的高通量、大規(guī)模、平行化、集約化的信息處理和功能研究?；蛐酒诙隧?yè)，共39頁(yè)?；蛐酒瑑?yōu)勢(shì)比較疾病狀態(tài)下不同時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)的差異對(duì)復(fù)雜疾病的鑒定藥物發(fā)現(xiàn)和藥物毒性測(cè)試病原微生物分析多位點(diǎn)SNP分析第二十九頁(yè)，共39頁(yè)。人類(lèi)的疾病與遺傳基因密切相關(guān)，基因芯片可以對(duì)遺傳信息進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析，用于分子診斷是臨床研究中一種新的、強(qiáng)有力的分子工具。遺傳病相關(guān)基因的定位腫瘤診斷感染性疾病的診斷耐藥菌株和藥敏檢測(cè)疾病的診斷和治療第三十頁(yè)，共39頁(yè)。DNA芯片第三十一頁(yè)，共39頁(yè)。微流控芯片（microfluidicdevice）微流控是指在一個(gè)微小系統(tǒng)中對(duì)微量液體進(jìn)行控制操作。最為人們熟知的微流控技術(shù)的應(yīng)用是噴墨打印。第三十二頁(yè)，共39頁(yè)。微流控芯片（第二代生物芯片）是微陣列芯片（第一代生物芯片）的延伸微陣列芯片具有快速，高信息量的優(yōu)點(diǎn)，但至今廣泛使用上仍受限制，除價(jià)格因素外（只有建立在大樣本量的基礎(chǔ)上才能夠適當(dāng)降低成本），樣品制備的復(fù)雜繁瑣是妨礙其廣泛使用的主要原因。微流控芯片，把前置處理過(guò)程微縮在芯片上，目的是把實(shí)驗(yàn)微型化，最終制成芯片實(shí)驗(yàn)室（lab-on-a-chip）有了它，就可以告別步驟繁復(fù)，儀器雜亂的實(shí)驗(yàn)室。微流控芯片（microfluidicdevice）第三十三頁(yè)，共39頁(yè)。進(jìn)一步提高探針陣列的集成度。提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。高自動(dòng)化、方法趨于標(biāo)準(zhǔn)化、簡(jiǎn)單化，成本降低。高穩(wěn)定性。研制新的應(yīng)用芯片。研制芯片新檢測(cè)系統(tǒng)和分析軟件，以充分利用生物信息。芯片技術(shù)將與其它技術(shù)結(jié)合使用，如基因芯片PCR、納米芯片。不同生物芯片間綜合應(yīng)用，如蛋白質(zhì)芯片與基因芯片間相互作用等，可用于了解蛋白質(zhì)與基因間相互作用的關(guān)系?；蛐酒夹g(shù)未來(lái)方向第三十四頁(yè)，共39頁(yè)。變性高效液相色譜分析熒光原位雜交一代測(cè)序等位基因特異性PCR二代測(cè)序熒光PCR轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增法單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR多重PCR巢式PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性基因芯片重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增法第三十五頁(yè)，共39頁(yè)。選擇合適的方法至關(guān)重要第三十六頁(yè)，共39頁(yè)。方法選擇的影響因素費(fèi)用目的用途特異性標(biāo)本類(lèi)型方法選擇靈敏度第三十七頁(yè)，共39頁(yè)。方法

PCR

測(cè)序

芯片背景針對(duì)科研需求:低拷貝基因的擴(kuò)增滿(mǎn)足科研需求:全基因組未知序列測(cè)定滿(mǎn)足檢測(cè)需求:已知序列的再驗(yàn)證特點(diǎn)高靈敏度廣泛用于臨檢標(biāo)準(zhǔn)化成熟靈敏度適中臨檢叫停需規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)化靈敏度適中已用于臨檢標(biāo)準(zhǔn)化趨于成熟局限影響因素多不夠穩(wěn)定