分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)2015

實(shí)驗(yàn)?zāi)夸泴?shí)驗(yàn)一植物基因組DNA提取及純化實(shí)驗(yàn)二PCR克隆目的基因?qū)嶒?yàn)三PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)四PCR產(chǎn)物凝膠回收實(shí)驗(yàn)五目的基因片段與載體連接實(shí)驗(yàn)六E.coliDH5α和DE3感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)七連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌實(shí)驗(yàn)八陽性單菌落篩選實(shí)驗(yàn)九重組質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)十重組質(zhì)粒及表達(dá)載體pET酶切分析與電泳實(shí)驗(yàn)十一目的片段回收及與表達(dá)載體連接實(shí)驗(yàn)十二連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α,質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)十三陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21實(shí)驗(yàn)十四蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白質(zhì)樣品制備實(shí)驗(yàn)十五SDS檢測誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)第一頁，共167頁。實(shí)驗(yàn)一植物基因組DNA提取

基本原理

1.基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交及PCR分離基因等。

2.不同生物（植物、動(dòng)物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同;不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。

3.在提取某種特殊組織的DNA時(shí)必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立相應(yīng)的提取方法,以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酚類物質(zhì)對隨后的酶切、PCR反應(yīng)等有較強(qiáng)的抑制作用,因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNA時(shí),應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。第二頁，共167頁。4.核酸是生物有機(jī)體中的重要成分，在生物體中核酸通常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分為DNA和RNA，在真核生物中，前者主要存在于細(xì)胞核中，后者主要存在于細(xì)胞質(zhì)和核仁里。在制備核酸時(shí)，通過研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來。第三頁，共167頁。5.植物基因組DNA的提取程序：（1）破碎組織（2）破壞細(xì)胞膜（3）去除雜質(zhì)（4）沉淀基因組DNA第四頁，共167頁。6.DNA的檢測方法（1）紫外分光光度法（2）電泳檢測DNA的質(zhì)量

第五頁，共167頁。本實(shí)驗(yàn)是通過SDS法提取擬南芥基因組DNA。第六頁，共167頁。1.通過SDS提取擬南芥基因組DNA;2.為從擬南芥基因組DNA克隆目的基因作準(zhǔn)備二實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡谄唔摚?67頁。儀器及耗材：研缽、微量移液器及吸頭、EP管、臺式離心機(jī)。材料：擬南芥小苗試劑：DNAExtractBuffer(0.2MNaCl,25mMEDTA,0.5%SDS,pH7.5);70%乙醇；酚；氯仿；異丙醇;RNase儀器、材料和試劑第八頁，共167頁。實(shí)驗(yàn)步驟1.取一定量的擬南芥組織;2.加入600μl抽提緩沖液（0.2MNaCl,25mMEDTA,0.5%SDS,pH7.5），室溫下快速研磨;3.把抽提液從研缽中移至1.5ml離心管中，混勻;4.12,000rpm,離心10min(RT)。取上清，加等體積的酚/氯仿（1：1）混合液，上下顛倒混勻；5.12,000rpm,5min(RT)，取上清，加等體積的異丙醇，上下顛倒混勻；6.12,000rpm,10min(RT)，棄上清，倒置于吸水紙上待壁上液體流盡后加入1ml的70%乙醇洗沉淀；7.12,000rpm,5min(RT)，棄上清，倒置于紙巾上待其干燥；8加20μlddH2O溶解沉淀;第九頁，共167頁。9.在溶解DNA中加入3-5μlRNase，37℃消化2-3h；10.補(bǔ)充ddH2O至總體積400μl

，加入等體積的酚/氯仿，混勻；11.12000rpm，5min（RT），12.取上清，加入1/10體積的乙酸鈉和2倍體積的無水乙醇，-20℃放置10min;13.12000rpm，4℃離心10min；14.去上清，70%乙醇洗滌沉淀,12000rpm，4℃離心5min;15.去上清，沉淀干燥后，加入20μlddH2O溶解DNA；16.分光光度計(jì)法檢測DNA的濃度和純度。第十頁，共167頁。實(shí)驗(yàn)報(bào)告分析A260=1時(shí)相當(dāng)于50μg的雙鏈DNA。A260/A280=1.8，DNA純度高。A260/A280<1.7，有蛋白質(zhì)的污染。A260/A280>1.9,有RNA的污染或者降解。A260/A230在2.0—2.5，DNA純度高。A260/A230<2.0,有糖類，鹽類或者有機(jī)溶劑污染。第十一頁，共167頁。注意事項(xiàng)（1）選用幼嫩植物組織，可減少淀粉類的含量。（2）植物組織充分勻漿。（3）DNA的二級結(jié)構(gòu)和雙鏈易受多種因素的影響引起雙鏈解開，即“變性”，因此抽提時(shí)避免使用變性的條件。（4）抑制內(nèi)外源DNase的活力。（5）防止化學(xué)降解。（6）防止物理因素降解。。第十二頁，共167頁。思考題.1在擬南芥基因組提取緩沖液中，EDTA和SDS的作用分別是什么？

1．溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。

EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。

2．溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。

但當(dāng)pH＞12或pH＜3時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。

在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，

因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。

SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：第十三頁，共167頁。

（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。

（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。

（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。

但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中

（用RNase去除RNA時(shí)）受到干擾。

3.

溶液III--3mol／L

NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。

所以該溶液實(shí)際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性，

使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol／L

NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、

RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合，

后者是因?yàn)殁c鹽與SDS－蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。

第十四頁，共167頁。

4．為什么用無水乙醇沉淀DNA？

用無水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，

乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。

DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67％左右。

因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因?yàn)闊o水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95％乙醇昂貴）。

但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，第十五頁，共167頁。實(shí)驗(yàn)二PCR克隆目的基因

一實(shí)驗(yàn)原理

PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA的方法.它包括三個(gè)基本步驟:(1)變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈;(2)退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(56℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下,以目的DNA為模板進(jìn)行合成.

由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。第十六頁，共167頁。PCR原理FLASH演示第十七頁，共167頁。PCR技術(shù)發(fā)展

PCR是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。

它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍。

PCR技術(shù)是生物科學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。第十八頁，共167頁。1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。

Mullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得1993年度諾貝爾化學(xué)。

第十九頁，共167頁。Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。

Klenow這些缺點(diǎn)給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。第二十頁，共167頁。

TaqDNAPolymerase1988年Saiki等從水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取耐高溫的TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)，此酶在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%。

缺點(diǎn)：

TaqDNAPolymerase只有5’→3’聚合酶活性，但沒有3’→5’外切活性，無法消除突變和錯(cuò)配，堿基錯(cuò)誤摻入率可達(dá)10-4/堿基/循環(huán)第二十一頁，共167頁。PfuDNAPolymerase

PfuDNA

聚合酶是已知保真度最高的聚合酶，來自于Pyrococcusfuriosis菌株，不僅具有摻入反應(yīng)迅速及熱穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)，更是當(dāng)前市場上所有DNA聚合酶中摻入出錯(cuò)率最低的一種。優(yōu)點(diǎn)：Pfu具有3’→5’校閱功能，其錯(cuò)配率分別僅為10-7。缺點(diǎn)：效率低，擴(kuò)增片段較短第二十二頁，共167頁。TaqPlusDNAPolymerase

是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物，與TaqDNA聚合酶相比，具有擴(kuò)增長度增加（簡單模板可有效擴(kuò)增20kb,復(fù)雜模板可有效擴(kuò)增10kb),保真度好的特點(diǎn)；與PfuDNA聚合酶相比，具有擴(kuò)增速度快，反應(yīng)效率高的優(yōu)勢。第二十三頁，共167頁。PCR反應(yīng)體系組成模板5’引物和3’引物4種dNTPDNA聚合酶Mg2+反應(yīng)緩沖液第二十四頁，共167頁。1.模板PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環(huán)狀分子就模板DNA而言,影響PCR的主要因素:

純度:蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會(huì)抑制PCR反應(yīng)完整性:模板降解會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無產(chǎn)物濃度:加量過多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加第二十五頁，共167頁。2.引物PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵引物影響因素：特異性：長度適當(dāng)、避免二級結(jié)構(gòu)和二聚體完整性：避免反復(fù)凍融濃度：應(yīng)適當(dāng),過高導(dǎo)致非特異性增加,過低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少第二十六頁，共167頁。引物設(shè)計(jì)原則(1)引物長度：約為16-30b(2)G+C含量：G+C含量通常為40%-60%,較短引物可粗略估計(jì)Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3)四種堿基隨機(jī)分布，在3‘端不存在連續(xù)3個(gè)G或C,因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。(4)在引物內(nèi)及兩引物之間,尤其在3‘端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)。(5)引物5‘端對擴(kuò)增特異性影響不大,可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)。(6)引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)第二十七頁，共167頁。4種dNTP

濃度適當(dāng)，避免反復(fù)凍融dNTP原液配成10mM或者2.5mM分裝,-20oC貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200μM。當(dāng)dNTP終濃度大于50mM時(shí)可抑制TaqDNA聚合酶的活性.4種dNTP的濃度應(yīng)該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。第二十八頁，共167頁。Mg2+

過高非特異性嚴(yán)重，過低無擴(kuò)增產(chǎn)物Mg2+濃度對DNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性,影響引物退火和解鏈溫度,影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+濃度范圍為0.5-3mM。試劑公司通常會(huì)將Mg2+加入到DNA聚合酶的反應(yīng)緩沖液中：

10×ReactionBuffer(includingMg2+)10×ReactionBuffer(withoutMg2+)第二十九頁，共167頁。DNA聚合酶TaqDNAPolymerase活性半衰期為95℃40min,97℃5min.TaqDNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下,30min,摻入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率,一般PCR中出錯(cuò)率為2×10-4

核苷酸/每輪循環(huán),100μlPCR反應(yīng)中,1.5-2單位的TaqDNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán).反應(yīng)結(jié)束后，如果需要利用這些產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn),需要預(yù)先滅活TaqDNA聚合酶,滅活TaqDNA聚合酶的方法有：(1)PCR產(chǎn)物經(jīng)酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。(2)加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。(3)99-100℃加熱10min.目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。Taq/Pfu/TaqPlusDNAPolymerase第三十頁，共167頁。DNA聚合酶單位定義：1個(gè)酶單位是指在以下分析條件下，于74℃，30min內(nèi)使10nmol/L的dNTP摻入核酸中所需的酶。不同公司提供的酶U的定義也不同。第三十一頁，共167頁。反應(yīng)緩沖液各種DNA聚合酶都有自己特定反應(yīng)緩沖液；TaqDNAPolymerase反應(yīng)緩沖液一般含：

10-50mMTris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)50mMKCl

適當(dāng)濃度的Mg2+第三十二頁，共167頁。緩沖液10mmol/lTris.Cl提供適合反應(yīng)的pH值（pH8.4）50mmol/lKCl促進(jìn)引物退火10μg/ml明膠或血清白蛋白為Taq酶的保護(hù)劑第三十三頁，共167頁。PCR反應(yīng)主要參數(shù)：1.預(yù)變性：94°C，3--5min2.變性：94°C，30s-1min3.復(fù)性：56

°C，20s--2min4.延伸：72

°C，30s--3min5.總延伸：72°C，10min第三十四頁，共167頁。預(yù)變性和變性在第一輪循環(huán)前,在94℃下變性3－5min非常重要,它可使模板DNA完全解鏈。變性不完全,往往使PCR失敗,因?yàn)槲醋冃酝耆腄NA雙鏈會(huì)很快復(fù)性,減少DNA產(chǎn)量.一般變性溫度與時(shí)間為94℃1min。在變性溫度下,雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全,所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟取５谌屙?，?67頁。退火引物退火的溫度和所需時(shí)間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度.實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低5℃。通常退火溫度和時(shí)間為55℃左右,1-2min。第三十六頁，共167頁。延伸延伸反應(yīng)通常為72℃,接近于TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度75℃.實(shí)際上。延伸反應(yīng)時(shí)間的長短取決于目的序列的長度和濃度。TaqDNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長的DNA。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后,都需要一步較長時(shí)間(10-30min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物,這對以后進(jìn)行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。第三十七頁，共167頁。循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會(huì)使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。第三十八頁，共167頁。1.通過PCR從擬南芥基因組中擴(kuò)增目的基因片段2.學(xué)習(xí)PCR儀等儀器的使用實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡谌彭?，?67頁。材料：擬南芥基因組DNA器材：移液器及吸頭，PCR管，PCR儀，臺式離心機(jī)。實(shí)驗(yàn)材料和器材第四十頁，共167頁。所需試劑10×PCR反應(yīng)緩沖液dNTPMix:每種10mM5’和3’引物：各10pmol/μl

（10μmmol/L）TaqDNA聚合酶

5U/μl無菌去離子水；第四十一頁，共167頁。實(shí)驗(yàn)步驟1.在PCR管中依次混勻下列試劑(總體積50μl)5μl10×Buffer(IncludingMgCl2)1μldNTPmix（各10mM）

1μl5’上游引物（10μM）

1μl3’下游引物（10μM）模板DNA(1000ng)0.25μlTaqDNA聚合酶補(bǔ)充ddH2O至50μl

混勻后短暫離心（點(diǎn)離）。第四十二頁，共167頁。2.將PCR管放置到PCR儀中，蓋好蓋子3.用94oC預(yù)變性3-5分鐘；94oC變性1分鐘，58oC退火1分鐘,72oC延伸2分鐘,30個(gè)循環(huán)；最后一輪循環(huán)結(jié)束后,于72oC下保溫10分鐘，4.終止反應(yīng)，從PCR儀取出PCR管，放置4oC存第四十三頁，共167頁。1.PCR非常靈敏,盡可能避免污染。吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌,每次吸頭用畢應(yīng)更換,不要互相污染試劑；

2.加試劑前,應(yīng)短促離心10秒鐘,然后再打開管蓋,以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面；

3.應(yīng)設(shè)含除模板DNA所有其它成分的負(fù)對照。注意事項(xiàng)第四十四頁，共167頁。思考題簡述PCR技術(shù)克隆的主要原理。第四十五頁，共167頁。實(shí)驗(yàn)三PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳第四十六頁，共167頁。一、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶第四十七頁，共167頁。影響DNA遷移速率因素DNA分子泳動(dòng)主要的因素分兩方面：DNA分子特性和電泳條件。1.DNA的分子大小:2.DNA分子的構(gòu)象3.瓊脂糖濃度4.電源電壓5.嵌入染料的存在6.離子強(qiáng)度影響第四十八頁，共167頁。

瓊脂糖是從瓊脂中分離得到，由1,3連接的吡喃型b-D-半乳糖和1,4連接的3,6脫水吡喃型阿a-L-半乳糖組成，形成相對分子量為104～105的長鏈。

瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機(jī)線團(tuán)狀分布，當(dāng)溫度降低時(shí)鏈間糖分子上的羥基通過氫鍵作用相連接，形成孔徑結(jié)構(gòu)，而隨著瓊脂糖濃度不同形成不同大小的孔徑

第四十九頁，共167頁。瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍第五十頁，共167頁。核酸電泳緩沖液有三種Tris-乙酸(TAE)、Tris-硼酸(TBE)和Tris-磷酸(TPE).

第五十一頁，共167頁。DNA電泳上樣緩沖液

DNALoadingBuffer作用

1.螯合Mg2＋，防止電泳過程中DNA被降解，一般上樣緩沖液中含10mMEDTA。

2.增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。

3.指示劑監(jiān)測電泳的行進(jìn)過程，一般加入泳動(dòng)速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿，它的速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同。第五十二頁，共167頁。DNA電泳的標(biāo)準(zhǔn)分子量

目前各廠商開發(fā)了各種類型的標(biāo)準(zhǔn)分子量，有廣泛用于PCR產(chǎn)物鑒定的小分子Marker，也有常規(guī)用的大分子Marker常用的DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量電泳圖第五十三頁，共167頁。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法2通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增的目的基因第五十四頁，共167頁。儀器及耗材：天平、電泳設(shè)備、臺式離心機(jī)、稱量紙、藥勺、微量移液器及吸頭、EP管、封口膜、三角瓶、微波爐、凝膠成像系統(tǒng)。材料：PCR產(chǎn)物試劑：瓊脂糖，1×TAE電泳緩沖液、溴化乙錠（EB）、6×Loadingbuffer、無菌去離子水、DNAMarker；三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑第五十五頁，共167頁。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.1g瓊脂糖加入100ml0.5×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。2.將制膠板放好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固3.充分凝固后將膠板取出，小心垂直向上拔出梳子，置入電泳槽中，加0.5×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm。第五十六頁，共167頁。第五十七頁，共167頁。4.用移液器吸取3μl的6×loadingbuffer于封口膜上，再加入5μlDNA樣品，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。5.打開電源開關(guān)，一般紅色為正極黑色為負(fù)極，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，電泳約30min-60min。6.在瓷盤中加入適量的水，再加入5－10μlEB，將凝膠放入盤中5－10分鐘

7.將凝膠置于凝膠成像儀內(nèi)，在紫外燈下檢測PCR產(chǎn)物的DNA條帶第五十八頁，共167頁。第五十九頁，共167頁。思考題瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素影響？1、DNA的分子大小及構(gòu)型

2、瓊脂糖濃度3、DNA分子的構(gòu)象4、電源電壓5、嵌入染料的存在

6、離子強(qiáng)度影響

第六十頁，共167頁。實(shí)驗(yàn)四目的基因與載體連接第六十一頁，共167頁。一、實(shí)驗(yàn)原理第六十二頁，共167頁。目的基因與載體連接平末端連接粘性末端連接T載體策略連接第六十三頁，共167頁。平末端連接TaqDNA聚合酶往往在PCR產(chǎn)物3'端加上多余的非模板依賴堿基,在用平末端連接克隆PCR產(chǎn)物前,可用Klenow片段或T4DNA聚合酶處理補(bǔ)平末端。有些DNA聚合酶（pfuDNA聚合酶）擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為平端，可以直接用于平端連接第六十四頁，共167頁。粘性末端連接利用引物中附加在5'端的限制酶位點(diǎn),直接將PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端,與載體連接,產(chǎn)生重組DNA.如果下游兩個(gè)引物中含有兩個(gè)不同的限制酶位點(diǎn).經(jīng)酶切后定向克隆到載體中。第六十五頁，共167頁。T-載體連接TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3‘末端加一個(gè)非模板依賴堿基(A或T),所加堿基多為A。利用這一特點(diǎn),可以經(jīng)限制酶(如EcoRV)切割載體,使其產(chǎn)生平末端,再利用TaqDNA聚合酶向載體雙鏈DNA的3‘末端加上T,使載體與PCR產(chǎn)物末端互補(bǔ)并進(jìn)行連接第六十六頁，共167頁。pMD18-TVectorpMD18-TVector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物（TACloning）的專用載體。用EcoRV進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3‘端添加“T”而成。，本制品中的高效連接液SolutionI可以在短時(shí)間內(nèi)（約30分鐘）完成連接反應(yīng)，大大方便了實(shí)驗(yàn)操作。第六十七頁，共167頁。pMD18-TVector的結(jié)構(gòu)第六十八頁，共167頁。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.通過T載體策略進(jìn)行目的基因與載體的連接第六十九頁，共167頁。儀器及耗材：臺式離心機(jī)、微量移液器及吸頭、EP管、封口膜、水浴鍋。材料：PCR產(chǎn)物試劑：無菌去離子水；pMD18-T

三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑第七十頁，共167頁。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.將PCR產(chǎn)物移入1.5mLEP管中，加去離子水至400μl，加入1/10倍體積的3MNaAc和2.5倍體積的無水乙醇，混勻，-20℃放置10min；2.12000rpm，4℃，離心10min；3.去上清，將EP管倒置于吸水紙上；4.向EP管加入適量70%乙醇，將DNA沉淀重懸；5.12000rpm，4℃，離心5min；6.去上清，倒置吸水紙上，晾干，加入10μl去離子水溶解DNA。第七十一頁，共167頁。7.測定DNA的濃度；8.沉淀的目的基因DNA與T載體連接：取一新的PCR管，加入下列反應(yīng)成分(總體積10μl)

：

目的DNA4.5μl(0.1pmol～0.3pmol)pMD18-TVector0.5μl

加入5μl（等量）的SolutionI；9.16OC水浴中反應(yīng)30分鐘。10.將連接產(chǎn)物-20℃保存。第七十二頁，共167頁。思考題簡述目的DNA片段與載體連接的不同策略。第七十三頁，共167頁。實(shí)驗(yàn)五大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備第七十四頁，共167頁。一實(shí)驗(yàn)原理

在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能憑自己的能力進(jìn)入細(xì)菌。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。第七十五頁，共167頁。感受態(tài)細(xì)胞制備方法化學(xué)法:CaCl2

處理后細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞;物理法:

大腸桿菌暴露在電荷中時(shí)，其細(xì)胞膜會(huì)不穩(wěn)定而誘導(dǎo)形成孔洞，于是DNA分子可由該孔進(jìn)入細(xì)胞。第七十六頁，共167頁。感受態(tài)細(xì)胞制備中應(yīng)注意因素細(xì)胞生長狀態(tài)和密度不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600

來控制。DH5α菌株的OD600

為0.5時(shí),細(xì)胞密度在5×107個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。2.試劑的質(zhì)量所用的試劑,如CaCl2

等均需較高純度，冰箱保存。3.防止雜菌和雜DNA的污染整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行,所用器皿,如離心管,tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染。第七十七頁，共167頁。二實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)以E.coliDH5α菌株為受體細(xì)胞，用CaCl2處理受體菌使其處于為感受態(tài)；2.制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)作準(zhǔn)備。第七十八頁，共167頁。儀器及耗材：培養(yǎng)皿、細(xì)菌投布器、三角瓶、牙簽、恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、分光光度計(jì)、冷凍離心機(jī)、1.5mL離心管、無菌工作臺材料：E.coliDH5α菌株試劑：LB固體和液體培養(yǎng)基、100mMCaCl2、甘油。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑第七十九頁，共167頁。LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani)配方：

蛋白胨(Tryptone)1g

酵母提取物(Yeastextract)0.5gNaCl1g

加去離子水至總體積100mL，用NaOH調(diào)pH至7.0,高壓滅菌LB固體培養(yǎng)基配方：每100mLLB液體培養(yǎng)基中加1.2g瓊脂粉,高壓滅菌。第八十頁，共167頁。四實(shí)驗(yàn)步驟

菌株活化1．用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌DH5α，在LB培養(yǎng)基平板表面劃線，于37℃培養(yǎng)16小時(shí)；2．挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到10mlLB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)3－5小時(shí)；3．將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到100mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2－3小時(shí)，到OD600＝第八十一頁，共167頁。感受態(tài)細(xì)胞制備4.將1.5ml菌液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上10min;4oC，4,000rpm，離心5min；6.去上清，將沉淀重懸于0.5ml用冰預(yù)冷的

100mMCaCl2中，置于冰上10min；7.4oC，4,000rpm，離心5min；8.去上清，將沉淀重懸于100μL用冰預(yù)冷的

100mMCaCl2溶液中，再加入75%甘油至終濃度為15-20%(25μl),混勻；9.即成感受態(tài)細(xì)胞，-70oC冰箱中保存.第八十二頁，共167頁。思考題感受態(tài)細(xì)胞有什么特點(diǎn)？簡述感受態(tài)細(xì)胞制備的原理特點(diǎn)：處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)

CaCl2法：

操作：

1.將快速生長的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0℃）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會(huì)造成細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，極易與外源DNA相粘附并在細(xì)胞表面形成復(fù)合物。

2.此時(shí)，將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激，外源DNA就可能被細(xì)胞吸收。進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。

3.將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選出帶有外源DNA分子的陽性克隆。

意義：

將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，不僅可以檢驗(yàn)重組載體是否構(gòu)建成功，最主要的是感受態(tài)細(xì)胞作為重組載體的宿主可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如蛋白質(zhì)表達(dá)純化等工作。

第八十三頁，共167頁。實(shí)驗(yàn)六連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌第八十四頁，共167頁。一實(shí)驗(yàn)原理

轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。第八十五頁，共167頁。

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞與重組質(zhì)粒DNA放置在冰浴(0oC)，CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基—鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)突然熱激（42oC）處理，更有利于細(xì)胞對DNA復(fù)合物的攝取，外源DNA分子通過吸附、轉(zhuǎn)入、自穩(wěn)而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并且開始進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。第八十六頁，共167頁。

將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時(shí)間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型(如Ampr等)得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上。第八十七頁，共167頁。ＤＮＡ分子轉(zhuǎn)化分以下幾步:１．吸附－－雙鏈ＤＮＡ分子吸附于受體菌表面；２．轉(zhuǎn)入－－雙鏈ＤＮＡ分子解鏈。一條鏈進(jìn)入受體菌，另一條降解；３．自穩(wěn)－－外源質(zhì)粒ＤＮＡ分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈；４．表達(dá)一供體基因隨同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制，分裂，轉(zhuǎn)錄翻譯。第八十八頁，共167頁。二實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

將目的基因與質(zhì)粒的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌（DH5α）感受態(tài)細(xì)胞，為重組載體的篩選最準(zhǔn)備第八十九頁，共167頁。儀器及耗材：培養(yǎng)皿、細(xì)菌投布器、三角瓶、恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、無菌工作臺材料：目的基因與載體的連接產(chǎn)物；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞試劑：

LB固體和液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素(100mg/mL)、IPTG(200mg/mL)、X-gal(20mg/mL),。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑第九十頁，共167頁。氨芐青霉素(Amp)配置：無菌水配制氨芐青霉素成100mg/mL溶液，過濾除菌，-20oC冰箱保存；X-gal配置：將X-gal溶于二甲基甲酰胺中，配成20mg/mL濃度的溶液，裝于玻璃或聚丙烯管中，以錫鉑紙包裹避光保存于-20oC，X-gal不需要過濾除菌；IPTG配置：將2gIPTG溶于8mL水中，用水調(diào)節(jié)體積到10mL,過濾除菌，-20oC冰箱保存。第九十一頁，共167頁。固體LB平板的準(zhǔn)備1.固體LB培養(yǎng)基的配置：每100mL液體LB培養(yǎng)基加入1.2g瓊脂粉，pH7.0，高溫滅菌；2.固體LB培養(yǎng)基融化后，冷卻到50oC，加入氨芐青霉素（100μg/mL），再倒入滅菌的平板內(nèi)；3.在LB固體培養(yǎng)基表面均勻投布4μLIPTG(200mg/mL)和40μLx-gal(20mg/mL),吹干;四實(shí)驗(yàn)步驟第九十二頁，共167頁。4.從-70oC冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞,置冰上解凍；5.在超凈臺上，取10l連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，充分混勻，冰上放置30min；6.42oC熱激處理90sec，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘；7.加入600－800l無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37oC，50－60rpm溫育45min，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因；8.菌液均勻涂布到含有抗生素（Amp100g/ml,并均勻的涂布有IPTG和X-gal）的LB平板上吹干，將培養(yǎng)皿倒置于37oC，培養(yǎng)16h；第九十三頁，共167頁。思考題觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，你的平板上出現(xiàn)單菌落沒有？分析總結(jié)一下影響轉(zhuǎn)化效率的因素。4.2.1

細(xì)胞的生長狀態(tài)和密度

最好從-70℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5×107個(gè)左右為佳。即應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細(xì)菌，可通過測定培養(yǎng)液的OD600控制。

4.2.2

質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度

用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但外源DNA的量過多時(shí)，則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。一般來說，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%，1ng的超螺旋DNA即可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低。此外，重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10~100倍。第九十四頁，共167頁。4.2.3

試劑的質(zhì)量

化合物及無機(jī)離子的影響：所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，分裝保存于4℃。在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高。

4.2.4

防止雜菌和雜DNA的污染

整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管、移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的制劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。第九十五頁，共167頁。實(shí)驗(yàn)七陽性克隆的鑒定和篩選第九十六頁，共167頁。

將目的基因與載體進(jìn)行連接形成重組子并轉(zhuǎn)化后，在連接產(chǎn)物中既有載體和目的基因的連接，也有載體的自連和目的基因的自連，更多的是未發(fā)生連接反應(yīng)的載體和目的DNA片斷。這就需要我們對陽性克隆進(jìn)行鑒定和篩選，將含有外源DNA的宿主細(xì)胞和不含外源DNA的宿主細(xì)胞分開，將含有正確重組子的宿主細(xì)胞和含有其他外源DNA的宿主細(xì)胞分開。一實(shí)驗(yàn)原理第九十七頁，共167頁。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，目的基因與T載體(pMD18-T)連接產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α菌株。由于pMD18-T上帶有Ampr

和lacZ基因,故重組子的篩選首先采用Amp抗性篩選與α-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選相結(jié)合的方法。第九十八頁，共167頁。pMD18-TVector的結(jié)構(gòu)第九十九頁，共167頁。

因pMD18-T帶有Ampr

基因而外源片段上不帶該基因,故轉(zhuǎn)化受體菌后只有帶有pMD18-TDNA的轉(zhuǎn)化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來（質(zhì)粒自身環(huán)化和重組載體）;而只帶有自身環(huán)化的外源片段的轉(zhuǎn)化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。第一百頁，共167頁。α-互補(bǔ)

pMD18-T上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和β-半乳糖苷酶N端146個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn),但并沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。E.coliDH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨(dú)立的情況下,pMD18-T和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。當(dāng)這種載體轉(zhuǎn)入可編碼－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞中時(shí)，在異丙基--D硫代半乳糖苷（IPTG）的誘導(dǎo)下，宿主可同時(shí)合成這兩種肽段，雖然它們各自都沒有酶活性，但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。所以稱這種現(xiàn)象為-互補(bǔ)現(xiàn)象。第一百零一頁，共167頁。

由互補(bǔ)產(chǎn)生的－半乳糖苷酶(LacZ)能夠作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－－D－半乳糖苷(X-gal)而產(chǎn)生藍(lán)色的菌落，所以利用這個(gè)特點(diǎn)，在載體的該基因編碼序列之間人工放入一個(gè)多克隆位點(diǎn)，當(dāng)插入一個(gè)外源DNA片段時(shí)，會(huì)造成LacZ()基因的失活，破壞-互補(bǔ)作用，就不能產(chǎn)生具有活性的酶。所以，有重組質(zhì)粒的菌落為白色，而沒有重組質(zhì)粒的菌落為藍(lán)色。第一百零二頁，共167頁。第一百零三頁，共167頁。重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌過程示意圖第一百零四頁，共167頁。菌落PCR鑒定陽性克隆

并不是所有白斑菌落是含有重組質(zhì)粒的陽性菌落，存在假陽性現(xiàn)象?？梢酝ㄟ^菌落PCR進(jìn)一步鑒定含有重組質(zhì)粒的陽性菌落。第一百零五頁，共167頁。常規(guī)的PCR鑒定需要進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取等多步操作后才能進(jìn)行基因擴(kuò)增，操作繁瑣，耗時(shí)較長，為了簡化操作程序，Gussow和Clackon提出菌落PCR方法，即用無菌牙簽挑取單菌落到TE緩沖液中，煮沸5min，渦旋振蕩后短暫離心，用1－2μL裂解液作DNA模板，這樣就省去了抽提模板DNA這一步，大大節(jié)省了時(shí)間和成本。后來該方法進(jìn)一步改進(jìn)，利用牙簽直接沾取一點(diǎn)單菌落作為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)更大量節(jié)省了時(shí)間，簡化了操作程序，單菌落PCR可以有效的篩選陽性重組克隆。第一百零六頁，共167頁。二實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)通過藍(lán)白斑篩選陽性重組菌落；2.學(xué)習(xí)菌落PCR技術(shù)及通過菌落PCR鑒定白斑菌落。第一百零七頁，共167頁。儀器及耗材：培養(yǎng)皿、電熱恒溫培養(yǎng)箱、無菌工作臺、牙簽、PCR管、各種tip、PCR儀。材料：連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后的菌落平板三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑第一百零八頁，共167頁。試劑：LB液體培養(yǎng)基氨芐青霉素(100mg/mL)

10×PCR反應(yīng)緩沖液;

dNTPMix(每種2.5mM);5’和3’引物（10μmM）;

TaqDNA聚合酶

2.5U/μl;

無菌去離子水；第一百零九頁，共167頁。1.建立PCR體系(總體積20μl)

可以以小組為單位，現(xiàn)將上述各試劑混合，再分裝，如小組為4人，就在EP管中加入4倍體積的上述各組分（除菌液），在分裝到PCR管，這樣便于試劑取樣。

ddH2O16.482μl10×Buffer(IncludingMgCl2)2.010μldNTPmix（各10mM）0.42μl5’上游引物（10μM）0.42μl3’下游引物（10μM）0.42μlTaqDNA聚合酶0.42μl2.用牙簽從LB固體平板上挑取白斑單菌落在PCR管中攪拌。四實(shí)驗(yàn)步驟第一百一十頁，共167頁。3.將PCR管放置到PCR儀中，蓋好蓋子；4.用94oC預(yù)變性3-5分鐘；94oC變性1分鐘，58oC退火1分鐘,72oC延伸2分鐘,32個(gè)循環(huán)；最后一輪循環(huán)結(jié)束后,于72oC下保溫10分鐘；5.終止反應(yīng)，從PCR儀取出PCR管，放置4oC存。第一百一十一頁，共167頁。五注意事項(xiàng)1.X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖以半乳糖苷酶水解后生成的吲哚衍生物顯藍(lán)色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷為非生理性的誘導(dǎo)物，它可以誘導(dǎo)lacZ的表達(dá)。3.在含有X-gal、IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉(zhuǎn)化子為藍(lán)色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在37℃培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時(shí)可使顯色反應(yīng)充分，藍(lán)色菌落明顯。第一百一十二頁，共167頁。思考題簡述利用藍(lán)白斑篩選重組子的原理第一百一十三頁，共167頁。實(shí)驗(yàn)八重組質(zhì)粒的提取第一百一十四頁，共167頁。一、實(shí)驗(yàn)原理

從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA方法包括3個(gè)基本步驟:1.培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；

2.收集和裂解細(xì)胞;3.分離和純化質(zhì)粒DNA。第一百一十五頁，共167頁。1.細(xì)菌培養(yǎng)質(zhì)粒的擴(kuò)增與質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)和細(xì)菌個(gè)數(shù)正相關(guān)。質(zhì)?？截悢?shù)是指在正常生長條件下，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞所對應(yīng)的平均質(zhì)粒數(shù)。在質(zhì)粒復(fù)制子調(diào)控下，質(zhì)?？截悢?shù)可隨細(xì)菌培養(yǎng)條件變化而在較窄的范圍波動(dòng)，生長條件恒定，質(zhì)粒增殖速度與宿主細(xì)胞增殖速度完全一致，拷貝數(shù)保持不變。第一百一十六頁，共167頁。2.細(xì)菌的收獲與裂解細(xì)菌的收獲可以通過離心來進(jìn)行；細(xì)菌的裂解可以采用多種方法，這些方法包括非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及加熱處理等。采用何種方法取決于三個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株和裂解后用于純化質(zhì)粒DNA技術(shù)。第一百一十七頁，共167頁。大質(zhì)粒（＞15kb）采用溫和方法小質(zhì)粒（＜15kb）可采用較劇烈方法有些大腸桿菌菌株不能采用加熱的方法裂解；第一百一十八頁，共167頁。3.分離和純化質(zhì)粒DNA

當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA變性,而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的兩條鏈不會(huì)相互分開，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性,而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起,而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。第一百一十九頁，共167頁。

在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會(huì)產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開環(huán)DNA；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí),同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動(dòng)速度快。第一百二十頁，共167頁。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1了解質(zhì)粒各種提取方法2通過堿法提取重組質(zhì)粒第一百二十一頁，共167頁。儀器及耗材：三角瓶、超凈工作臺、臺式離心機(jī)、微量移液器及吸頭、EP管、DNA振蕩器。材料：含有重組質(zhì)粒的培養(yǎng)細(xì)菌三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑第一百二十二頁，共167頁。

堿法提取質(zhì)粒需要的試劑：溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ配制后高壓滅菌15分鐘,儲(chǔ)存于4℃冰箱。溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1％SDS(臨用前用10mol/LNaOH和10％SDS現(xiàn)配)。溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml,并高壓滅菌。試劑第一百二十三頁，共167頁。（一）、堿法1.

接種少許通過PCR鑒定含有重組質(zhì)粒DH5α菌液到液體LB培養(yǎng)基(含100μg/mlAmp)中,37℃振蕩培養(yǎng)約12小時(shí)至對數(shù)生長后期；。2、取菌液于1.5mlEP,4℃，12,000rpm,1min;3、棄上清,將管倒置于吸水紙上數(shù)分鐘,使液體流盡；4、每管菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(吸打混勻，務(wù)必充分)；5、每管加入新配制的溶液Ⅱ200μl,輕柔上下顛倒EP管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(不要振蕩),冰浴5分鐘。6、每管加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ,輕柔上下顛倒EP管數(shù)次，可見白色絮狀沉淀出現(xiàn)，冰浴中5分鐘,4℃，12,000rpm,10min;四、實(shí)驗(yàn)步驟第一百二十四頁，共167頁。7.上清液（每管400μl）移入干凈EP管中,加0.8倍體積5MLiCl（每管320μl）,混勻,-20℃,20min;8.4℃,12,000rpm，5min9.將水相（約700μl）移入干凈EP管中,加入0.6倍體積的異丙醇（420μl）,振蕩混勻后，室溫放置5分鐘，然后4℃,12,000rpm，5min；10.棄上清,將管口敞開倒置于吸水紙上使所有液體流出,加入70％乙醇洗沉淀一次,4℃,12,000rpm，5min；11.吸除上清液,將管倒置于吸水紙上使液體流盡,室溫干燥。12.將沉淀溶于20μlddH2O中,加入1-2μlRNaseA,37℃水浴中溫育2-3h.第一百二十五頁，共167頁。思考題質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)中，溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ各起什么作用？第一百二十六頁，共167頁。實(shí)驗(yàn)九重組質(zhì)粒酶切分析第一百二十七頁，共167頁。一、實(shí)驗(yàn)原理

限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。限制性內(nèi)切酶可分為三類:

Ⅰ類和III酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識別位點(diǎn)并隨機(jī)的距離切割識別位點(diǎn)一定距離的DNA；III類酶在特定的非識別位點(diǎn)上切割DNA分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成:一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列;另一種為獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。第一百二十八頁，共167頁。

分子克隆中廣泛應(yīng)用的是：Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個(gè)核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個(gè)核苷酸序列:5‘-G↓AATTC-3’),有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。

Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’);有的切割位點(diǎn)在對稱軸一側(cè),產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端,如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端（5’-G↓AATTC-3’）。第一百二十九頁，共167頁。BamHI第一百三十頁，共167頁。pET28

多克隆位點(diǎn)上

有EcoRⅠ

和SalⅠ位點(diǎn)第一百三十一頁，共167頁?？寺』蛞镆布尤肓薊coRI,SalI位點(diǎn)Primer5’:GCGGAATTCATGGGTTATTGGAAGTCGAAPrimer3’:GCGGTCGACTCAAGCCTTTTGTGTGGCGCA第一百三十二頁，共167頁。影響酶切反應(yīng)的因素

1.DNA純度

2.緩沖液

3.溫度條件

4.甘油含量第一百三十三頁，共167頁。Takara公司提供的不同緩沖液第一百三十四頁，共167頁。溫度：37OC甘油：控制在10％以下第一百三十五頁，共167頁。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1掌握限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)原理和方法；2將上一實(shí)驗(yàn)獲得的重組質(zhì)粒及表達(dá)載體pET進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化（注：不需要酶切pET質(zhì)粒，老師已經(jīng)為大家切好了）

第一百三十六頁，共167頁。儀器及耗材：臺式離心機(jī)、微量移液器及吸頭、EP管、恒溫水浴鍋。材料：重組質(zhì)粒和載體質(zhì)粒三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑第一百三十七頁，共167頁。

內(nèi)切酶：EcoRI,SalI

內(nèi)切酶緩沖液:10*BufferHddH2O

試劑第一百三十八頁，共167頁。限制性內(nèi)切酶在各種緩沖液中的相對活性四、實(shí)驗(yàn)步驟第一百三十九頁，共167頁。1.重組質(zhì)粒雙酶切酶切反應(yīng)體系如下(20μl

)：10*BufferH2μl質(zhì)粒DNA10μlEcoRI0.5μlSalI0.5μl補(bǔ)充ddH2O到總體積20μl2.將上述反應(yīng)體系混勻后，短暫離心，于37OC反應(yīng)2-3小時(shí)第一百四十頁，共167頁。思考題限制性核酸內(nèi)切酶有什么特點(diǎn)？

限制性核酸內(nèi)切酶是可以識別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶，簡稱限制酶。

根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）。Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性內(nèi)切酶同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用。

用于DNA基因組物理圖譜的組建；基因的定位和基因分離；DNA分子堿基序列分析；比較相關(guān)的DNA分子和遺傳工程。

限制性核酸內(nèi)切酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的，其生理意義是提高自身的防御能力.

限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。

第一百四十一頁，共167頁。實(shí)驗(yàn)十電泳分析酶切反應(yīng)

第一百四十二頁，共167頁。一、實(shí)驗(yàn)原理1.瓊脂糖凝膠電泳原理同實(shí)驗(yàn)二第一百四十三頁，共167頁。1.DNAMarker2.重組質(zhì)粒pMD18-Gene酶切之前對照3.重組質(zhì)粒pMD18-Gene酶切之后產(chǎn)生較大的質(zhì)粒帶和較小的目的基因帶2.重組質(zhì)粒pMD-Gene酶切分析第一百四十四頁，共167頁。3.表達(dá)載體pET32a酶切分析pET系統(tǒng)是有史以來在E.coli中克隆表達(dá)重組蛋白的功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)。pET載體使目的蛋白的克隆、檢測以及純化更加容易。第一百四十五頁，共167頁。載體大致可分為兩大類：轉(zhuǎn)錄載體和翻譯載體。轉(zhuǎn)錄載體用以表達(dá)本身帶有原核核糖體結(jié)合位點(diǎn)和AUG起始密碼子的目的基因。只有3種轉(zhuǎn)錄載體：pET-21(+)、pET-24(+)和pET-23(+)。翻譯載體包括來自T7噬菌體主要衣殼蛋白的高效核糖體結(jié)合位點(diǎn)，用于表達(dá)那些不帶有核糖體結(jié)合位點(diǎn)的目的基因。第一百四十六頁，共167頁。翻譯載體在命名上與轉(zhuǎn)錄載體不同，多一個(gè)字母后綴，例如pET-21a(+)，表示相對于BamHI克隆位點(diǎn)識別序列GGATCC的閱讀框。所有帶后綴a的載體從GGA三聯(lián)密碼子開始表達(dá)，帶b的從GAT開始，帶c的從BamHI識別序列ATC三聯(lián)密碼子開始。帶d后綴的載體閱讀框和帶c的一樣，不同的是它們有一個(gè)上游NcoI克隆位點(diǎn)而非NdeI位點(diǎn)以便直接將目的基因克隆到AUG起始密碼子。第一百四十七頁，共167頁。第一百四十八頁，共167頁。第一百四十九頁，共167頁。1.DNAMarker2.表達(dá)載體pET32a酶切之前對照(可能是一條、兩條或是三條帶)3.表達(dá)載體pET32a酶切之后呈線性化，只有一條帶，而在瓊脂糖凝膠上，線性化的DNA遷移率最慢。第一百五十頁，共167頁。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1瓊脂糖凝膠電泳分析限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)；2將目的基因片段從凝膠上切下來，為目的基因片段凝膠回收作準(zhǔn)備。第一百五十一頁，共167頁。儀器及耗材：天平、電泳設(shè)備、臺式離心機(jī)、稱量紙、藥勺、微量移液器及吸頭、EP管、三角瓶、微波爐、凝膠成像系統(tǒng)。材料：1.重組質(zhì)粒pMD-Gene酶切產(chǎn)物

2.表達(dá)載體pET-32a酶切試劑：瓊脂糖，1×TAE電泳緩沖液、溴化乙錠（EB）、6×Loadingbuffer、無菌去離子水、DNAMarker；三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑第一百五十二頁，共167頁。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.1g瓊脂糖加入100ml0.5×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。2.將制膠板放好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固3.充分凝固后將膠板取出，小心垂直向上拔出梳子，置入電泳槽中，加0.5×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm。4.向酶切產(chǎn)物EP管中分別加入3μl的6×loadingbuffer，混勻,全部上樣到凝膠點(diǎn)樣孔；第一百五十三頁，共167頁。5.打開電源開關(guān)，一般紅色為正極黑色為負(fù)極，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，電泳約30min-60min。6.在瓷盤中加入適量的水，再加入5－10μlEB，將凝膠放入盤中2－3分鐘7.將凝膠置于凝膠成像儀內(nèi)，在紫外燈下檢測酶切產(chǎn)物的DNA條帶8.在紫外燈下將pMD-Gene酶切產(chǎn)生的目的基因帶從凝膠上切下來，切下的凝膠塊要盡量??；第一百五十四頁，共167頁。思考題限制性內(nèi)切酶EcoRv有什么特點(diǎn)？第一百五十五頁，共167頁。實(shí)驗(yàn)十一DNA凝膠回收

第一百五十六頁，共167頁。一、實(shí)驗(yàn)原理

通過一定的方法將瓊脂糖凝膠上需要的目的DNA帶回收下來，用于下游實(shí)驗(yàn)。第一百五十七頁，共167頁。瓊脂糖凝膠電泳片斷回收的常用方法

1.柱回收試劑盒

是目前最簡單快速的回收方法，只需要將電泳凝膠中的產(chǎn)物條帶切下，用溶解Buffer徹底溶解，上包埋有純化填料的純化柱，離心，再洗滌一次，離心后用洗脫緩沖液洗脫。全程不過10多分鐘，得到的產(chǎn)物溶液可以直接用于后繼實(shí)驗(yàn)。這個(gè)方法幾乎不需要什么技