酶工程酶分子修飾

關于酶工程酶分子修飾第一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾什么是酶分子修飾酶分子修飾（enzymemolecularmodification）通過各種方法使酶分子的結構發(fā)生某些改變，從而改變酶的催化特性的技術過程酶分子工程（enzymemolecularengineering）指按照酶的各種特性的需要，依據(jù)結構－性能間的關系，在分子水平上實現(xiàn)酶的結構設計和操作分子生物學水平：用基因工程方法對DNA或RNA進行分子改造，以獲得化學結構更合理的酶蛋白一級結構水平：對天然的酶分子進行改造，包括酶一級結構中氨基酸置換、肽鏈切割、氨基酸側鏈修飾等?第二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾對酶進行分子修飾的原因和依據(jù)在非生理條件下，酶的某些性質不滿足工程應用生理最適溫度、pH值≠體外最適溫度、pH值酶分子對熱、酸、堿、有機溶劑的耐受性較差酶在非生理條件下活力下降，抗原性顯著理論依據(jù)和方法酶的結構特點與酶催化特性的關系：構效關系理性設計（rationaldesign）：找出關鍵結構，在掌握酶的構效關系的基礎上，有目的地對其進行改造半理性設計（semi-rationaldesign）：以基因的隨機重組為手段，參考酶的構效關系進行關鍵位點的改造第三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾酶分子修飾的意義：我們究竟要做什么？應用角度——酶工程提高酶的催化效率，改變底物專一性增強酶的穩(wěn)定性，降低/消除酶的抗原性研究角度——酶學研究酶分子中一級結構的改變對酶空間構象的影響，進一步探索酶的結構與催化特性之間的關系探測酶活性必需氨基酸的性質和數(shù)目探索酶分子的拓撲學及寡聚酶的亞基結合狀態(tài)探測酶蛋白部分區(qū)域的構象狀態(tài)，以及結構變化與運動探索酶的作用機理和催化反應歷程催化特性環(huán)境適應性第四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾酶分子修飾的條件修飾反應盡可能在酶穩(wěn)定條件下進行，并盡量不破壞維持酶活性功能的必需基團pH值與離子強度決定了酶蛋白分子中反應基團的解離狀態(tài)修飾反應的溫度與時間嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應反應體系中酶與修飾劑的比例控制二者的比例，防止酶的過度修飾而導致的活性完全喪失第五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾第六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾化學修飾的方法學揭示了蛋白質必需基團的化學修飾和活性喪失的定量關系鄒氏作圖法袁勤生,《現(xiàn)代酶學》p139第七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾化學修飾的方法學第八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾酶分子修飾的種類金屬離子置換修飾（重點）大分子結合修飾（重點）側鏈基團修飾（重點）親和修飾肽鏈有限水解修飾（重點）核苷酸鏈有限水解修飾氨基酸置換修飾核苷酸置換修飾酶分子的物理修飾酶的定向進化修飾第九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾金屬離子置換修飾Metalionsubstitutemodification把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的催化特性發(fā)生改變的修飾方法通過修飾了解各種金屬離子在酶催化過程中的作用，闡明催化機制適用對象：金屬酶（metalloenzyme）一種結合金屬的酶，以一個或幾個金屬離子作為輔因子金屬離子或是直接參與催化作用，或是對保持酶的活性和構象起穩(wěn)定作用金屬酶純化時仍保留著定量的功能金屬離子第十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾金屬離子置換修飾常見的金屬酶及其離子種類-淀粉酶——Ca2+、Mg2+、Zn2+谷氨酸脫氫酶——Zn2+過氧化氫酶——Fe2+?；被崦浮猌n2+超氧化物歧化酶——Cu2+、Zn2+細胞色素P450單加氧酶——Fe2+固氮酶——Fe(II)、Mo(IV)谷胱甘肽過氧化物酶——Se(IV)主要的金屬離子Ca、Mg、Cu、Zn、Co、Fe、Mn等CytP450第十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾金屬離子置換修飾金屬離子置換修飾的方法酶的提純除去原有金屬離子加入金屬螯合劑，如EDTA等，讓酶分子中的金屬離子與EDTA形成螯合物透析、超濾或層析除去螯合物加入置換的離子加入含另一種金屬離子的溶液，酶蛋白與其結合用透析或層析等方法除去未結合的離子第十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾金屬離子置換修飾金屬離子置換修飾的作用闡明金屬離子對酶催化作用的影響一般在活性中心的金屬離子能與底物或輔酶/輔基可逆結合，從而起到催化作用提高酶的催化效率將Zn型-淀粉酶置換成Ca型，活力可提高20%～30%增強酶的穩(wěn)定性Fe-SOD置換成Mn-SOD后穩(wěn)定性增強，對NaN3

敏感性降低改變酶的動力學特性酰化氨基酸水解酶活性部位的Zn被Co置換后，酶的底物專一性（Km

值）和最適pH都顯著改變第十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾Macromoleculescombinemodification采用水溶性大分子與酶的側鏈基團共價結合，使酶分子的空間構象發(fā)生某些精細的改變，從而改變酶催化特性的方法常用的大分子糖、糖的衍生物聚乙二醇（PEG）含C=C雙鍵單體聚合得到的聚合物多肽鏈，甚至蛋白質第十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾大分子結合修飾的方法選擇修飾劑選擇溶解性好、生物相容性好、抗原性弱、無毒的大分子聚乙二醇（PEG）、寡聚糖、多糖及其衍生物等修飾劑的活化將修飾劑分子中的基團（—OH）轉化為高反應性的基團修飾反應將活化過的修飾劑與純化的酶液按照一定比例混合反應，控制溫度、pH等條件分離層析分離，除去多余的修飾劑第十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾修飾劑——聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）PEG既可溶于水，又可溶于多種有機溶劑微毒或無毒免疫原性低生物相容性好，已通過FDA認證分子量范圍很寬，從幾百到數(shù)十萬，選擇余地大末端有兩個能被活化的—OH基團為了獲得單功能的PEG，將其中一個羥基轉化為烷氧基，即單甲氧基聚乙二醇（MPEG）第十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾修飾劑——MPEG三氯均三嗪活化法（重點掌握）第十七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾修飾劑——MPEG疊氮法：將—OH轉化為—N3

基團第十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾修飾劑——MPEG琥珀酸酐法（溴代或碘代琥珀酸酐）第十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾修飾劑——MPEG重氮法：將—OH轉化為—N=N基團第二十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾修飾劑——右旋糖酐（dextran）右旋糖酐是由葡萄糖通過-1,6-糖苷鍵形成的高分子多糖水溶性較好生物相容性好糖鏈上的2,3-雙羥基經(jīng)活化后可與酶分子中的氨基結合第二十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾修飾劑——右旋糖酐溴化氰（CNBr）法：糖酐活化第二十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾修飾劑——右旋糖酐溴化氰（CNBr）法：與酶偶聯(lián)第二十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾修飾劑——右旋糖酐高碘酸（HIO4）氧化法第二十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾修飾劑——右旋糖酐高碘酸（HIO4）氧化法：增加連接臂第二十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾修飾劑——肝素（heparin）由D--葡萄糖醛酸（或L--艾杜糖醛酸）和N-乙酰氨基葡萄糖形成重復二糖單位組成的多糖在體內(nèi)外都有抗凝血作用臨床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手術、心臟導管檢查、體外循環(huán)、血液透析等第二十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾修飾劑——肝素碳二亞胺法（—COOH反應）第二十七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾修飾劑——肝素三氯均三嗪法第二十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾大分子修飾的作用——提高酶的催化效率根本原因：改變了酶的空間構象，有可能促使酶活性中心與底物更容易結合酶的催化功能是由其空間結構決定的例1：1分子核糖核酸酶與6.5分子右旋糖酐共價結合，活力提高到原有的2.25倍例2：1分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐共價結合，酶的催化效率提高到原酶的5.1倍位阻效應第二十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾大分子修飾的作用——增強酶的穩(wěn)定性水溶性大分子與酶結合，在酶分子外層形成保護層，可以保護酶的空間構象不溶性大分子與酶結合，形成固定化酶，也提高酶的穩(wěn)定性穩(wěn)定性的表征——半衰期酶的半衰期：酶活力降低到原來活力一半時所經(jīng)過的時間大分子修飾酶半衰期相對穩(wěn)定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)-SOD14h140Ficoll(高分子量)-SOD24h240PEG-SOD35h350第三十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾大分子結合修飾大分子修飾的作用——降低或消除抗原性酶非經(jīng)口（如注射）進入人體后，會成為一種抗原，刺激體內(nèi)產(chǎn)生抗體；當這種酶再次注射進體內(nèi)時，抗體就會與作為抗原的酶特異地結合，使酶失去催化功能經(jīng)過大分子修飾，酶蛋白的空間結構發(fā)生改變，致使酶蛋白與抗體之間不再發(fā)生特異性識別，從而降低了酶蛋白與體內(nèi)抗體的結合幾率例如：L-天冬酰胺酶[EC3.5.1.1]經(jīng)PEG修飾后抗原性顯著降低，已經(jīng)在1994年被FDA批準用于治療急性淋巴性白血病第三十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾Sideresiduesmodification采用一定的（化學）方法，使酶蛋白側鏈基團發(fā)生改變，從而改變酶催化特性的修飾方法用于研究各種基團在酶分子中的作用及其對酶的結構、特性和功能的影響熒光試劑修飾側鏈，了解酶在水溶液中的構象各基團對酶結構和活性的影響，研究必需基團的組成對非催化基團修飾可改變酶的動力學性質，改變酶對特殊底物的束縛能力利用側鏈修飾測定某種基團在酶分子中的數(shù)量改變酶的結構和催化性能第三十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾兩類酶的修飾蛋白類酶側鏈基團可組成各種次級鍵對蛋白質空間結構的形成和穩(wěn)定起重要作用，而當這些功能基團發(fā)生改變，引起次級鍵改變，使空間結構發(fā)生某些變化，從而引起酶特性和功能的改變親核性側鏈基團：—OH、—COOH、—NH2、—SH、咪唑環(huán) 親核性取代的氨基酸殘基:Ser、Cys、Asp、Thr、Lys、His等親電性側鏈基團：芳香環(huán)、吲哚環(huán) 親電性取代的氨基酸殘基:Tyr、Trp核酸類酶磷酸基，核糖糖環(huán)上的—OH、堿基雜環(huán)及其—NH2、—OH等第三十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾幾種重要的修飾反應?；狾H（Ser、Thr、Tyr）、—SH（Cys）、—NH2（Lys）烷基化多種基團均可發(fā)生，包括芳環(huán)和雜環(huán)氧化和還原酚基、—SH、雜環(huán)等芳香環(huán)取代涉及Phe、Tyr、Trp等幾種芳香族氨基酸其他反應，如CNBr裂解反應第三十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾各類側鏈基團的修飾氨基修飾（Lys）羧基修飾（Asp、Glu）巰基修飾（Cys）胍基修飾（Arg）羥基修飾（Ser、Thr、Tyr）咪唑基修飾（His）吲哚基修飾（Trp）甲硫基修飾（Met）分子內(nèi)交聯(lián)第三十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾1.氨基（—NH2）修飾的主要特點氨基在酶蛋白中主要是Lys的-NH2

和肽鏈末端氨基非質子化的-NH2

親核反應活性很高，易被選擇性修飾一般情況下-NH2

的pKa=10，其解離程度取決于微環(huán)境氨基的修飾反應主要有酯化、N-烷基化等第三十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾修飾反應——氨基?；磻谌唔?，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾修飾反應——氨基TNBS反應和Sanger反應第三十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾修飾反應——氨基N-烷基化第三十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾2.羧基（—COOH）修飾的主要特點羧基在酶蛋白中主要是Asp和Glu的側鏈—COOH，以及肽鏈的末端羧基在水溶液中，—COOH通常解離成負離子，親核性降低，對其修飾的方法有限，主要反應為成酯、成酰胺反應第四十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾修飾反應——羧基碳二亞胺反應（羧基修飾的標準方法）第四十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾修飾反應——羧基酯化反應第四十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾3.巰基（—SH）修飾的主要特點巰基在酶蛋白中的來源是Cys的-SH巰基的親核性強，往往是酶分子中反應活性最高的基團巰基容易被氧化成—S—S—，在維持蛋白亞基之間的相互作用和酶催化過程中起重要作用巰基用烷基化試劑修飾后一般能得到穩(wěn)定的修飾產(chǎn)物第四十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾修飾反應——巰基二硫鍵置換反應第四十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾修飾反應——巰基與含汞有機物的反應（—SH對Hg的親和力很強）第四十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾修飾反應——巰基S-烷基化反應第四十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾4.胍基（—N=C(NH2)2）修飾的主要特點胍基存在于酶蛋白的Arg殘基側鏈上在結合帶有陰離子底物的酶的活性部位中起重要作用胍基堿性強，難以和大多數(shù)試劑反應，一般采用具有兩個鄰位羰基的化合物，在中性或弱堿性條件下反應，一般是可逆反應第四十七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾修飾反應——胍基（與鄰二酮的反應）第四十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾5.酚基和羥基（—OH）修飾的主要特點酶蛋白中含羥基的氨基酸殘基有：Ser、Thr、Tyr羥基的專一性修飾較困難，通常修飾劑能同時修飾羥基、氨基和巰基Tyr的酚羥基相比于Ser和Thr的羥基要活潑一些，更容易發(fā)生修飾；酚基具有芳香性，能發(fā)生親電取代反應第四十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾修飾反應——酚基和酚羥基酚基親電取代反應第五十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾修飾反應——（酚）羥基O-?；磻谖迨豁?，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾6.咪唑基修飾的主要特點咪唑基存在于酶蛋白的His殘基側鏈上His是多種酶的活性中心，是電荷中繼網(wǎng)中的重要成員對His咪唑基的修飾，一般是通過N-烷基化或C-親核取代來進行對咪唑進行修飾后，酶活性一般會受到顯著影響第五十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾修飾反應——咪唑基N-取代反應焦碳酸二乙酯第五十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾修飾反應——咪唑基雜環(huán)上的親電取代反應第五十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾7.吲哚基修飾的主要特點吲哚基存在于酶蛋白的Trp殘基側鏈上Trp殘基疏水性較強，一般位于酶分子的內(nèi)部，反應活性比氨基和巰基差，因此對其修飾較困難，很多能與吲哚基反應的試劑，一般優(yōu)先與巰基或氨基反應有時候Tyr會對吲哚基的修飾產(chǎn)生干擾第五十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾修飾反應——吲哚基與Koshland試劑的反應第五十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾8.甲硫基修飾的主要特點酶蛋白中Met殘基中的硫以硫醚的形式存在硫醚中的硫原子雖然具有親核性，但反應活性較差，在溫和的條件下一般不發(fā)生反應硫醚的主要反應主要是氧化反應，產(chǎn)物為砜和亞砜；另外，采用某些試劑也可以進行S-烷基化反應第五十七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾修飾反應——甲硫基第五十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾9.分子內(nèi)交聯(lián)（掌握概念）采用雙功能基團化合物（雙功能試劑），在酶分子中對空間距離較近的兩個氨基酸殘基側鏈基團之間進行共價交聯(lián)第五十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾側鏈基團修飾分子內(nèi)交聯(lián)試劑同型、異型可裂解、不可裂解第六十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾親和修飾Affinitymodification，酶的專一性修飾試劑作用于特定部位的某一基團，而不與這一部位之外的同類基團反應用于酶化學修飾的試劑，即使對某一基團反應是專一的，也仍然有多個同類殘基與之反應，因此對某個特定殘基的選擇性修飾比較困難，為了解決此問題，開發(fā)了親和標記試劑這類修飾劑也稱為位點專一性抑制劑，一般具有與底物相似的結構，對酶活性部位具有高度的親和性，可專一性標記于酶的活性中心上，使酶不可逆失活，因此也稱專一性不可逆抑制劑第六十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾親和修飾第六十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾親和修飾親和標記試劑的特點在使酶不可逆失活以前，要與酶形成可逆復合物親和試劑的修飾程度是有限的競爭性類似物的存在會降低修飾反應速率親和試劑體積不能太大，否則造成較大的空間位阻修飾產(chǎn)物應當穩(wěn)定，應便于表征和定量第六十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾親和修飾KS

型（競爭性標記試劑）根據(jù)底物的結構設計的，具有與底物結構相似的結合基團，同時還具有能與酶活性部位氨基酸側鏈反應的活性基團特點底物、競爭性抑制劑及其他結構類似物對修飾具有保護作用修飾反應是定量定點進行的Kcat

型（自殺性標記試劑）根據(jù)酶催化過程設計，專一性很高具有酶的底物性質，還有一個潛在的反應基團在酶催化下活化，與酶活性部位氨基酸側鏈發(fā)生反應，不可逆地結合第六十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾肽鏈有限水解修飾Peptidechainlimithydrolysismodification在肽鏈的限定位點進行水解，使酶的空間結構發(fā)生精細改變，從而改變酶催化特性的修飾方法肽鏈是蛋白類酶的主鏈，是酶分子結構的基礎活性中心的肽段是酶催化作用必不可少的活性中心之外的肽段維持酶的空間構象肽鏈被水解后可能出現(xiàn)的情況酶活性中心破壞，酶失去催化功能——探測酶活性中心位置酶活性中心構象完整，酶活力保持不變或損失不多，但抗原性發(fā)生變化——提高酶的藥用價值活性中心形成，與底物結合能力提高并形成準確的催化部位——酶催化功能增強或酶活力提高第六十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾肽鏈有限水解修飾酶蛋白主鏈修飾——酶切/酶原激活法胃蛋白酶原（pepsinogen）的自激活意義：保護作用，避免了過量的胃蛋白酶對胃壁自身進行消化第六十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾肽鏈有限水解修飾酶蛋白主鏈修飾——酶切/酶原激活法胰蛋白酶原（trypsinogen）的水解激活

利用胰蛋白酶或腸激酶從trypsinogen的N-端切除一段六肽序列：N-Val—(Asp)4—Lys第六十七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾肽鏈有限水解修飾酶蛋白主鏈修飾——酶切/酶原激活法胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活第六十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾肽鏈有限水解修飾酶蛋白主鏈修飾——酶切/酶原激活法Klenow片段：基因工程的工具酶E.coliDNA聚合酶I經(jīng)胰蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶部分水解生成的C-末端605個氨基酸殘基片段。保留了DNA聚合酶I的5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性，但缺少完整酶的5’3’外切酶活性。第六十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾核苷酸鏈剪切修飾Nucleotidechaincleavagemodification僅見于R酶的分子修飾，指在核苷酸鏈的限定位點進行剪切，使R酶的結構發(fā)生改變，從而改變其催化特性的方法L-19IVS的形成四膜蟲（Tetrahymena）26SrRNA前體自我剪接形成成熟的26SrRNA，同時生成414nt的線性間隔序列LIVSLIVS經(jīng)一系列剪接、環(huán)化、開環(huán)過程最終得到多功能R酶L-19IVS第七十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾氨基酸置換修飾Amino-acidsubstitutemodification將酶分子肽鏈上的某一個氨基酸置換成另一個氨基酸，從而改變酶催化特性的修飾方法肽鏈上某個氨基酸的改變會引起酶化學結構和空間構象的改變氨基酸置換修飾的作用提高酶的催化效率（例：酪氨酸-RNA合成酶Thr51

Pro51，對ATP親和力提高近100倍，催化效率提高25倍）增強酶的穩(wěn)定性（例：T4溶菌酶Ile3

Cys3，與Cys97

形成二硫鍵，熱穩(wěn)定性提高）改變酶的專一性（例：農(nóng)桿菌-葡萄糖苷酶Glu358Ala358，失去水解活性，卻能催化糖苷合成）第七十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾氨基酸置換修飾置換修飾方法——化學修飾對某些側鏈結構相近的氨基酸殘基進行基團修飾，從而變成另一種氨基酸殘基難度較大，很難精確操作第七十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾氨基酸置換修飾置換修飾方法——定點突變在DNA序列中的某一特定位點上進行堿基的改變蛋白質工程常用的技術手段1983年，美國生物學家Ulmer首先提出了“蛋白質工程”的概念蛋白質工程通過改造蛋白質相對應基因中的堿基排列次序，或設計合成新的基因，將它克隆到宿主細胞中，通過基因表達而獲得具有新特性的蛋白質的技術過程蛋白質工程是在基因工程的基礎上發(fā)展起來的，在技術方面有諸多同基因工程技術相似的地方，因此蛋白質工程也被稱為第二代基因工程第七十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾氨基酸置換修飾定點突變主要步驟1)新的分子結構設計根據(jù)已知蛋白酶的化學結構、空間結構及其特性，確定新蛋白質或酶的氨基酸排列順序

，乃至欲置換的核苷酸及其位置2)突變基因的核苷酸序列確定逆推法第七十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾氨基酸置換修飾定點突變主要步驟3)突變基因的獲得用DNA合成儀合成有數(shù)個核苷酸被置換了的寡核苷酸鏈，再以此寡核苷酸鏈為引物，通過PCR擴增獲得所需的大量突變基因，即寡核苷酸誘導的定位突變4)新酶的獲得——重組表達將定位突變獲得的突變基因進行體外重組，插入適當?shù)幕蜉d體中，通過基因操作技術轉入特定的宿主細胞中，培養(yǎng)并表達所需的修飾酶第七十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾氨基酸置換修飾實驗操作大致步驟1)先測定酶的一級結構2)用NMR、X射線衍射法等方法分析測定其三維結構3)根據(jù)結構信息選擇突變部位，即選定哪一個氨基酸殘基要被取代4)選擇4～6個氨基酸殘基的寡肽序列，其間含待取代的氨基酸殘基5)用化學法合成由12～18個堿基組成并為所選寡肽的氨基酸序列編碼的核苷酸序列，作為定位誘變的引物6)構建單股質粒，含有為所需蛋白質編碼的基因，作為定點突變的模板第七十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾氨基酸置換修飾實驗操作大致步驟7)將引物與單鏈模板DNA配對，用PCR法將引物延長，形成互補鏈，得到共價閉合的雙鏈DNA，也叫異質雙鏈質粒8)將異質雙鏈質粒引入宿主細胞（如E.coli），轉化為兩個同質雙鏈質粒，一個含天然蛋白質編碼的基因，另一個含編碼突變體的基因9)將這兩個基因分離并克隆，最后產(chǎn)物是細胞轉化突變型，能合成突變體蛋白質，與母體蛋白質僅有1個氨基酸的差別，這個氨基酸就是事先選定的突變部位第七十七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾核苷酸置換修飾Nucleotidesubstitutemodification將R酶分子核苷酸鏈上的某個（或數(shù)個）核苷酸置換成其他的核苷酸，一般采用定點突變技術自我剪切酶的保守序列和剪切位點序列與酶的催化作用關系密切對自我剪切酶的結構與功能研究可了解酶催化中心必需基團，據(jù)此進行分子改造，從催化分子內(nèi)反應的R酶設計出催化分子間反應的R酶第七十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾核苷酸置換修飾核苷酸置換對催化特性的影響例：L-19IVS活性中心堿基變化L-19IVS22～27位核苷酸序列底物催化產(chǎn)物III5’―GGAGGG―3’GGCCUCUAAAAA(1)GGGCCUCU+GAAAAAGGCCUGUAAAAA(2)G/GGCCGCUAAAAA(3)G/5’―GCAGGG―3’(1)G/(2)GGGCCUGU+GAAAAA(3)G/5’―GGCGGG―3’(1)G/(2)G/(3)GGGCCGCU+GAAAAA第七十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾核苷酸置換修飾Nucleotidesubstitutemodification例：錘頭型核酶（hammerheadribozyme）1989年，Koizumi證明只要保留11個核苷酸保守序列即可催化自我剪切反應。第八十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾核苷酸置換修飾錘頭型核酶的置換修飾除了11個保守核苷酸以外的其他核苷酸都可以置換修飾第八十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾核苷酸置換修飾發(fā)夾型核酶（hairpinribozyme）的置換修飾1989年，Hamp提出煙草環(huán)斑病毒（sTRSV）負鏈RNA自我剪切反應是基于發(fā)夾結構（一種回文結構），只要形成此結構就會在底物識別序列處自動催化剪切反應第八十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾酶分子的物理修飾Physicalmodification通過各種物理方法，使酶分子的空間構象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法研究極端條件下酶結構和活性的變化“極端微生物”物理修飾的特點——非共價不改變酶的組成單位及其基團酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變——酶的一級結構不變副鍵發(fā)生某些改變和重排——酶的高級結構發(fā)生變化第八十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾酶分子的物理修飾物理修飾的效果改變底物特異性例：羧肽酶

經(jīng)高壓處理，其水解能力降低，而有利于催化肽的合成反應（逆反應）改變酶催化的最適溫度例：纖維素酶經(jīng)高壓處理，最適溫度下降，但在30～40oC條件下，活力提高了10%提高酶的穩(wěn)定性例：用鹽酸胍破壞胰蛋白酶的空間構象，伸展肽鏈，再透析除去鹽酸胍，在不同溫度下重新構建/恢復酶的構象，50oC下重新構建的酶穩(wěn)定性比天然酶提高5倍第八十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾酶的定向進化修飾Enzymedirectedevolution模擬自然進化（隨機突變和自然選擇）的過程，在體外進行酶基因的人工隨機突變，建立突變基因文庫，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體定向進化的三個過程隨機突變：產(chǎn)生基因多態(tài)性構建突變基因文庫：將突變基因與適當?shù)妮d體重組定向選擇：高通量篩選方法隨機突變的方法易錯PCR（error-pronePCR）DNA改組（DNAshuffling）第八十五頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾酶的定向進化修飾易錯PCR（error-pronePCR）通常PCR使用的TaqDNA聚合酶失去了3’5’方向的校正活性，因此核苷酸錯誤摻入的幾率約為5×10-5如果配合適當?shù)臈l件，調(diào)整正常PCR體系中dNTPs的濃度和比例，提高Mg2+

濃度，引入Mn2+

，可以高頻率隨機引入錯配的突變位點，構建突變文庫，再篩選突變體連續(xù)多次反復地隨機誘變，通過每一步的積累產(chǎn)生有益突變第八十六頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾酶的定向進化修飾DNA改組（DNAshuffling）從正突變的基因庫（可以通過易錯PCR構建）中分離出DNA片段，用脫氧核糖核酸酶DNaseI隨機切割，得到的隨機片段經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，隨機片段之間互為模板和引物進行擴增，直至獲得全長的基因將親本基因群中的優(yōu)勢突變盡可能地組合在一起，最終使酶分子的某一性質得到進一步進化第八十七頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾酶的定向進化修飾突變文庫的定向篩選根據(jù)進化的目標設定選擇環(huán)境條件例：為提高酶的熱穩(wěn)定性，可以在較高的溫度下培養(yǎng)重組細胞，并在每一次“突變－篩選”的循環(huán)中逐步提高培養(yǎng)溫度高通量篩選96孔板（384孔板）篩選標記篩選（熒光標記、放射性標記）噬菌體表面展示技術酵母細胞表面展示技術……第八十八頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾酶的定向進化修飾例：對硝基芐酯酶的定向進化修飾第八十九頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾酶的定向進化修飾例：酯酶的定向進化修飾將10g用PCR擴增過的親本DNA片段用DNaseI切割，在PwoDNA聚合酶催化下進行第一次PCR擴增，35輪循環(huán)后補加PwoDNA聚合酶，再進行35輪循環(huán)，得到的擴增產(chǎn)物進行第二次PCR常規(guī)擴增將擴增產(chǎn)物和pNB106R質粒用BamHI和XbaI酶切，體外連接后轉化到E.coli.TG1宿主細胞中，獲得重組子在一定濃度DMF溶液中對底物LCN-pNB的催化活力進行篩選，得到一株高活性進化酶；在DMF水溶液中催化水解含p-硝基芐酯結構的化合物活力可提高30倍第九十頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾修飾酶的特性總結修飾酶的酶學性質變化最適pH值熱穩(wěn)定性體內(nèi)抗原性半衰期酶動力學性質對組織的分布能力變化第九十一頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾修飾酶的特性總結熱穩(wěn)定性修飾劑與酶形成多點交聯(lián)，一般能增強酶的熱穩(wěn)定性，可能的原因是多點交聯(lián)產(chǎn)生固定酶分子構象的效應PEG修飾酶在熱穩(wěn)定性上沒有明顯提高，可能由于PEG和酶是單點交聯(lián)酶分子內(nèi)基團間相互作用在受熱情況下發(fā)生了變化，向熱力學上熵增加的方向變化，即從緊密有序趨于隨機松散通過修飾后，使酶天然構象產(chǎn)生“剛性”，不易伸展打開，減小熱振動，從而增強酶的熱穩(wěn)定性第九十二頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾修飾酶的特性總結最適pH值一般情況下，修飾酶的最適pH范圍擴大豬肝尿酸酶的最適pH為10.5，在pH7.4的生理環(huán)境中酶活僅剩5~10%，用白蛋白修飾后，最適pH范圍擴大，在pH7.4時仍保留60%酶活吲哚-3-鏈烷羥化酶修飾后，最適pH從3.5增加到5.5，在pH7左右時，修飾酶活力比天然酶增加3倍，在生理環(huán)境下抗腫瘤效果比天然酶大得多可能的原因修飾酶的微環(huán)境更穩(wěn)定修飾酶被“固定”在一個更活潑的狀態(tài)第九十三頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾修飾酶的特性總結半衰期酶經(jīng)修飾增強了抗蛋白水解、抗抑制劑和抗失活因子的能力及對熱穩(wěn)定性提高，半衰期一般都比天然酶延長體內(nèi)抗原性有些修飾劑在消除酶抗原性上并無作用，如PVP（聚乙烯吡咯烷酮）修飾酶；糖類物質也不容易消除酶的抗原性現(xiàn)在比較公認的是PEG和人血清蛋白在消除酶抗原性上效果明顯，原因可能是修飾劑破壞（共價結合）或“遮蓋”了抗原決定簇，使之抗原性減弱或消除第九十四頁，共一百零三頁，編輯于2023年，星期四酶分子修飾修飾酶的特性總結酶動力學性質絕大多數(shù)酶經(jīng)修飾后最大反應速度Vmax

沒有變化有些酶在修飾后，米氏常數(shù)Km

通常會增大，這可能是交聯(lián)于酶上的分子或基團產(chǎn)生了空間障礙，影響了底物對酶的接近和結合修飾酶抵抗各種失活因子的能力增強和體內(nèi)半衰期的延長，能夠彌補Km

增大的缺陷第九十五