w細胞生物學研究方法

第三章細胞生物學研究方法一、細胞形態(tài)結構觀察（一）光學顯微鏡：1、普通光鏡的性能指標：放大率（放大倍數(shù)）分辨力、清晰度、焦點深度、鏡象亮度。分辨力（分辨率、分辨本領）：能分辨兩個物點之間最短距離的能力，通常是以分辨距離來表示的，即分辨距離越小則分辨力越高。

當前1頁，總共79頁。圖2-1尼康E-600顯微鏡當前2頁，總共79頁。人肉眼分辨力測試是規(guī)定在明視距離25cm所分辨的最短間距來表示，正常人肉眼分辨力的極限值是0.1mm(毫米)，顯微鏡的分辨力可按下列公式來計算R=0.61λ/N.A（R是分辨距離，0.61是常數(shù)，λ是照明光波波長，N·A是顯微鏡物鏡的鏡口率——光學性能指標，每個物鏡上都標有其鏡口率的數(shù)值）。

當前3頁，總共79頁?！叻直婢嚯xR與鏡口率N·A成反比，∴若把最大鏡口率1.25（即油鏡鏡口率）代入公式，可以最小分辨距離≌/2由于可見光中最短波長（紫光）為0.4um（即400nm）?！嗥胀ü忡R最大分辨力的理論極限為0.2um,請記住0.2um，這個數(shù)值就是顯微鏡水平與亞（超）微水平的分界線。當前4頁，總共79頁?！唢@微鏡的分辨力是有一定的極限，∴其放大率受分辨力制約而不可能無限提高，普通光鏡放大率的經驗界值：有效放大倍數(shù)極限=物鏡鏡口率×1000。例普通顯微鏡的油鏡鏡口率為1.25,故此臺顯微鏡的最大有效放大倍數(shù)為1250倍。高級研究顯微鏡油鏡鏡口率為1.4，則此鏡的最大有效放大倍數(shù)為1400倍。

當前5頁，總共79頁。如果放大倍數(shù)超過限度，則視野中物象變模糊，細微結構反倒分辨不清，成為了無效放大，由于物鏡鏡口率受入射鏡口角和介質折射率的限制，不可能更大提高，所以科學家們從兩個途徑來改進顯微鏡：ⅰ、換用短波長的照明光源提高分辨力，如紫外光顯微鏡，電子顯微鏡；ⅱ應用特殊光學效應增強反差，提高分辨能力。當前6頁，總共79頁。圖2-1尼康E-600顯微鏡當前7頁，總共79頁。2、相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）用于沒有染色的活細胞原理：光波的三個光學特性（1）光波有波長，對于光波波長變化，肉眼覺察為顏色變化（2）光波有振幅，對于光波振幅變化（即振幅差）肉眼覺察為明暗變化（3）光波有相位（相位是指某一時刻光在其前進路線上的位置）對于光相位的變化（即相位差），肉眼不能覺察。當前8頁，總共79頁。圖2-8相差顯微鏡照明原理當前9頁，總共79頁。當光線穿過無色透明且非勻質的被檢物體（例如活細胞）其波長和振幅都無明顯變化，僅光相位出現(xiàn)了一定程度變化，此時觀察感覺反差小，物體內部結構難分辨，這就是普通光鏡不適宜用于觀察活細胞的原因，相差顯微鏡卻是運用一些特殊裝置，使通過被檢物體的光線分離成兩組光波，并人為地使這兩組光波之間微弱的相位差加大，再經過光波干涉作用，使看不見的相位差轉變成可見的振幅差，從而反差增強，使能夠清晰看到被檢物體及其內部細微結構，所以相差顯微鏡下的樣品不需染色，可清晰觀察活細胞及其內部結構的變化。特點：相差顯微鏡有正反差和負反差兩種類型，正反差（暗反差）觀察效果是被檢物質比周圍背景略暗，物體外圍顯現(xiàn)一圈亮的光暈，而負反差（明反差）的效果則是相反。當前10頁，總共79頁。圖2-9一種介殼蟲的染色體（PCM照片）當前11頁，總共79頁。3、熒光顯微鏡（fluorescencemicroscope）

原理：以紫外光為光源，使被檢材料中的熒光物質激發(fā)出熒光，從而對細胞內某些物質進行定性和定位分析，熒光現(xiàn)象有兩種：（1）自發(fā)熒光——細胞內某些天然熒光物質被紫外光照射所激發(fā)的熒光，例如葉綠素——血紅色自發(fā)熒光。（2）誘發(fā)熒光——在細胞中加入某種不會使細胞化學組分變性的熒光染料（熒光素），與細胞內某種特定成分結合在一起，經紫外光照射激發(fā)出熒光。例：熒光染料吖啶橙，可使RNA發(fā)出紅色熒光，而使DNA發(fā)出綠色熒光。當前12頁，總共79頁。圖2-2尼康E800熒光DIC顯微鏡當前13頁，總共79頁。圖2-3落射式照明原理當前14頁，總共79頁。圖2-4熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、

微絲紅色、核藍色）當前15頁，總共79頁。特點：與普通光鏡在結構上不同之處是：（1）采用紫外光發(fā)生裝置，高壓燈+激發(fā)裝置+濾光裝置。（2）透鏡由石英玻璃制成，以便減少道路上的紫外光損耗。（3）目鏡中裝壓紫濾片（保護眼睛）。

當前16頁，總共79頁。熒光顯微鏡目前在分子細胞生物學研究中應用十分廣泛，以熒光素標記各種探針進行基因定位分析和對某些特異蛋白質進行定性定位檢測分析，靈敏清晰，在熒光顯微鏡下對樣品可同時采用兩種以上（有的多達6~12種）熒光探針檢測，依據(jù)其不同顏色的熒光信號，我們能一次判斷識別多個基因位點，因此這是非常實用的研究技術，此外，由于在熒光標記檢測實驗中，易發(fā)生一些非檢測目標出現(xiàn)假象的“背景噪音”問題，因而現(xiàn)可在熒光顯微鏡設備上安裝一套“數(shù)字成像處理系統(tǒng)CCD”，即把圖像信息通過攝像機和電腦的圖象數(shù)字化處理，使信號反差可以放大增強，對假象削弱or削除從而明顯提高檢測的精確率和靈敏度。當前17頁，總共79頁。4.倒置顯微鏡：是將相差顯微鏡的構件顛倒裝配，本末倒置而成的，并裝有恒溫設備，閉路電視和縮時攝像機，是完善的細胞培養(yǎng)和觀察監(jiān)視系統(tǒng)（光源在上，目鏡在下）、（培養(yǎng)皿，瓶中活細胞生長生活情況）。當前18頁，總共79頁。圖2-11萊卡倒置顯微鏡當前19頁，總共79頁。5.微分干涉顯微鏡:是另一種不需染色而直接觀察活細胞中精細結構及動態(tài)變化的技術設備，其分辨力比普通光鏡提高一個數(shù)量級。當前20頁，總共79頁。圖2-10DIC顯微鏡下的硅藻（偽彩色）當前21頁，總共79頁。6.激光共焦點顯微鏡:激光共焦點顯微鏡的物鏡和聚光鏡是聚集同一焦點能排除平面以外熒光干擾，所以其分辨率比普通熒光顯微鏡提高1.4~1.7倍，還可以“光學切片”方式觀察較厚樣品的內部結構。當前22頁，總共79頁。圖2-5激光共聚焦掃描顯微鏡當前23頁，總共79頁。圖2-6LCSM照片，藍色為細胞核，綠色為微管當前24頁，總共79頁。（二）電子顯微鏡1、透射電鏡（transmissionelectronmicroscope,TEM）

透射電鏡的放大原理與光鏡基本類似，只不過是以電子槍所發(fā)射的高速電子流代替了照明光源，又以三組電磁線圈所構成的磁透鏡代替了玻璃制成的聚光鏡、物鏡和目鏡。第一組磁透鏡能將電子流聚焦到樣品上（故稱為會聚鏡）；第二組磁透鏡能使穿透過樣品的電子射線折射形成初級放大像（稱為物鏡）；而第三組磁透鏡則是通過第一第二中間鏡和投影鏡進行連續(xù)三次的再放大，最終投射到熒光屏上，使電子圖象轉變成了可見的光學圖象。當前25頁，總共79頁。圖2-18光學顯微鏡、TEM、SEM成像原理比較當前26頁，總共79頁。圖2-12JEM-1011透射電子顯微鏡當前27頁，總共79頁。圖2-13萊卡超薄切片機當前28頁，總共79頁。圖2-14內質網(wǎng)透射電鏡圖（偽彩色）當前29頁，總共79頁。特點：（1）照明光源不同；（2）放大倍數(shù)的調節(jié)方式不同，是依靠改變磁透鏡的微磁電流強度來調節(jié)放大倍數(shù)的，也就是說，電流強度的變化引起了磁場強度的改變，而磁場強度的變化又使電子射線的折射程度發(fā)生改變，因而放大倍數(shù)即隨之出現(xiàn)變化；（3）有高壓穩(wěn)壓系統(tǒng)，電子流的發(fā)射速度及波長皆取決于電壓的高低。通常透射電鏡的電壓達幾萬——十幾萬伏的高壓；當前30頁，總共79頁。（4）有高度真空的工作系統(tǒng)。因為高速運動的電子流如果與空氣中的微粒和分子碰撞就會改變它的發(fā)射方向，導致成像模糊，故要求電鏡內的工作系統(tǒng)（包括樣品室）都必須保持高度真空狀態(tài)，并且樣品都必須脫水（真空中水易蒸發(fā)or升華，電子流與水分子相碰，改變其方向，使成像模糊）因此說透鏡電鏡不能用來觀察活的樣品；（5）樣品厚度必須<900（即90nm,0.09um）這是因為電子穿透能力有限，樣品過厚則成像不清晰，并且高速穿透的電子會產生熱量，將原樣品燒出白斑，所以透鏡電鏡觀察的樣品須超薄切片（400~500）不能用普通電鏡下的組織切片（2~7um）；當前31頁，總共79頁。（6）標本染色技術不同，電鏡標本染色并不像光鏡標本染色上各種顏色，而是使觀察的結構與背景之間，黑白對比分明，反差強。所以電鏡標本染色劑大多是重金屬鹽類。染色方法有正染、負染兩類，正染常采用醋酸鈾或檸檬酸鉛染色，使得被觀察的結構較暗，背景較亮；負染則是使用磷鎢酸染色，使得背景較暗，而觀察的結構顯得明亮突出；（7）特殊的投影技術（真空噴鍍法）是對電鏡標本的表面處理技術，即以真空噴鍍儀在真空條件下，將金、鉑等金屬微粒傾斜地噴向標本，使其朝向發(fā)射原的表面沉積的金屬微粒多于背面，因而電鏡觀察時感覺反差極強，具立體感。當前32頁，總共79頁。圖2-15肌動蛋白纖維的負染電鏡照片當前33頁，總共79頁。（8）冰凍蝕刻（或冰凍斷裂）技術freezeetchingorfreeze-fracture是研究細胞各種膜相結構的處理方法，先將樣品放入-190℃低溫下迅速冰凍，再在真空中用冷卻刀切割斷裂，隨后上升溫度，讓冰在真空中升華成水汽跑掉，斷裂面的細微結構暴露出來，再用真空噴鍍儀在斷面上噴一層碳膜或鉑——碳膜（稱為“表面復型膜”）然后拿出真空之外，用有機溶劑將樣品溶解掉，置“表面復型膜”于銅網(wǎng)上，即可上電鏡觀察了，因此，電鏡下看到的實際上已不是樣品本身，而是樣品某一斷裂面的“人工復制品”，這是因為人為的這種表面變型膜能比生物樣品本身有更強的電子反差性能，能夠以富有立體感的浮雕形式精細地反映出某一斷裂的細微結構。對于“冰凍蝕刻處理的生物膜各個面，國際上統(tǒng)一（規(guī)定命名稱為PS”代表面向細胞質基質的表面）。當前34頁，總共79頁。圖2-16冰凍蝕刻電鏡照片當前35頁，總共79頁。2、掃描電鏡（scanningelectronmicroscopeSEM）：

工作原則不同于透射電鏡，是以電子束在樣品表面掃描，用閃爍器收集樣品表面散射回來的二次電子信號，再經放大，最后在熒光屏上顯示圖像。特點：不需要經過復雜處理，即可觀察標本的原始外表面。當前36頁，總共79頁。圖2-17JEOL掃描電子顯微鏡當前37頁，總共79頁。優(yōu)點：（1）可觀察較大，較厚的樣品（2）景深大（景深——聚焦后能清晰看到物象的前后距離范圍），所以圖像是十分逼真的三維立體形象（3）其放大倍數(shù)是從20~20萬倍的連續(xù)變倍，，不須重復多次對焦，故對觀察研究很方便（4）樣品可在樣品室內做多方位的水平移動和轉動，便于從各個角度來觀察樣品的全貌。缺點：（1）分辨力不太高，僅3~10nm（2）不能觀察樣品內部。當前38頁，總共79頁。圖2-18光學顯微鏡、TEM、SEM成像原理比較當前39頁，總共79頁。圖2-19人類血細胞SEM照片當前40頁，總共79頁。（三）掃描隧道顯微鏡（scanningtunnellingmicroscopeSTM）

特殊顯微鏡，不是電鏡，是新型探測樣品外表的納米級微觀形貌的高級儀器，具有三維立體掃描物體表面的原子尺度高分辨能力，并能在常規(guī)大氣or液體條件下觀測樣品，無須強求真空環(huán)境，也不采用高能電子流攻擊樣品，故有利于觀察樣品的真實自然形態(tài)，這是目前開展納米結構生物學研究的重要技術，已用于直接觀察DNA分子，蛋白質分子及生物微精細結構。當前41頁，總共79頁。掃描隧道顯微鏡原理當前42頁，總共79頁。二、細胞生化分析（一）組織化學和細胞化學染色法（histochemicalandcytochemicalstainingmethods）

利用某種顯色劑能與某種細胞成分特異性結合，顯示特定顏色的原理對組織和細胞內某些成分進行定位和定性分析的研究方法，可對無機鹽蛋白質，醛基、碳水化合物、脂類、核酸和酶類等多種成分檢測鑒定。當前43頁，總共79頁。例：孚爾根反應（Feulgen）:

特定顯示DNA的細胞化學技術，其原理是經稀鹽酸水解打開DNA上嘌呤堿與脫氧核糖之間的連接鏈，暴露出羥基，由于羥基還原作用與無色品紅（希夫試劑）結合形成紫紅色的化合物，據(jù)此可對細胞內的DNA進行定性和定位檢測，此外，由于染色的深度與DNA濃度是成正比關系，所以當孚爾根法染色后，再用顯微分光光度計測量，即可對細胞內的DNA含量進行定量測定。再例：comori法顯示酸性磷（pi）酸酶（溶酶體標志酶）當前44頁，總共79頁。（二）免疫細胞化學:

（immunocytochemistry）依據(jù)抗體能與對應的抗原自行相互識別結合的免疫學原理來檢測特定蛋白質在細胞內的分布狀況，首先將某種抗體聯(lián)結上標記物（光鏡觀察用的標記物是熒光素or酶，而電鏡觀察用的標記物是膠體金），再與組織or細胞樣品混合反應，隨后在光鏡or電鏡下檢查標記物沉積的部位，即對抗原進行定位測定，如果標記物是熒光素時，則是在熒光顯微鏡下檢查熒光信號部位，以顯示抗原存在位置。當前45頁，總共79頁。

抗體與抗原結合的方式分直接法和間接法兩種:(1)直接法是先將抗體與熒光素結合，然后將樣品用熒光素標記的抗血清浸染，使熒光抗體與抗原結合反應后，再在熒光顯微鏡下鑒別抗原的存在部位。(2)而間接法的不同之處是在抗原——抗體初級的基礎上，再增加一種能同初級抗體發(fā)生結合反應的次級抗體（即“抗抗體”），從而使初級反應得到“放大”，以增強分析觀察的靈敏性和準確性。當前46頁，總共79頁。如果與抗體聯(lián)結的標記物是酶，則可采用與酶的底物反應，產生呈某種顏色的沉積物，再依據(jù)這種特定顏色沉積物的出現(xiàn)位置，來對待測物質的定性定位分析，這被稱為酶標抗體法（酶聯(lián)反應），例如辣根過氧化物酶是常被用作標記物的酶，該酶可催化過氧化氫H2O2同二氨基聯(lián)苯胺發(fā)生氧化反應，形成棕色的沉積物，從而可在光鏡或電鏡下進行觀察分析。當不存在抗原時，但隨機出現(xiàn)了沉積（無論是否抗體與抗原結合，熒光素都會沉積，酶也與底物反應）故采用洗脫來避免此現(xiàn)象。當前47頁，總共79頁。圖2-21人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片當前48頁，總共79頁。（三）顯微分光光度測定技術microspectrophotometry

細胞內各種化學成分對光的吸收均有專一的波段，例如核酸是吸收紫外光260nm光波，氨基酸則吸收280nm光波，此外，有些細胞成分經過細胞化學染色技術處理后，也可對可見光波有特定的吸收光譜，依據(jù)這種特性，運用顯微分光光度計可對某些細胞成分進行定位和定量分析。目前，最先進的顯微光譜分析儀器是流式細胞光度計。它是采用激光作為光譜測量光源，還采用了細胞流動系統(tǒng)和電腦數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，所以一秒鐘可測定5000個細胞的多種參數(shù)，如DNA含量,蛋白質含量，細胞體積和直徑等等。當前49頁，總共79頁。圖2-24用流式細胞計分選細胞當前50頁，總共79頁。（四）顯微放射自顯影microradiography

依據(jù)照相原理利用放射性同位素所發(fā)射出來的射線（主要是β粒子）使感光材料（照相乳膠）上產生潛影（此過程稱為“曝光，”即讓照相乳膠上的AgBr還原成Ag），再經過顯影和定影，即可觀察到用同位素標記的某種物質在標本中的位置和數(shù)量。常用的放射性同位素有3H、14C、32P和35S、等，用3H標記的胸腺嘧啶核苷（3H-T），可測定DNA的合成代謝，用3H標記的尿嘧啶核苷可研究RNA的合成代謝，用14-Cor35S標記可研究蛋白質的合成，由于此技術靈敏度很高，是對生物大分子進行精細定位的有效方法。當前51頁，總共79頁。其操作過程：（1）同位素標記實驗樣品（2）樣品標本制備（包括固定、包理、切片or超薄切片or滴片）（3）涂布乳膠（在暗室）（4）曝光（自顯影，在暗盒內）（5）顯影、定影、清洗（6）染色當前52頁，總共79頁。（7）光鏡下或電鏡下觀察由于放射性同位素標記有對人不安全，且操作步驟復雜，費時費工的缺點：因此目前在基因定性研究方面大多改用非放射性標記方式——例如應用生物素標記或地高辛標記來替代同位素，在生物素或地高辛上聯(lián)結熒光素或酶，再以熒光顯微鏡或酶聯(lián)反應來檢測，效果亦很好。（放射性同位素對操作者不安全，廢渣、廢水處理對環(huán)境污染，只有在對實驗要求靈敏度很高的實驗中使用）。當前53頁，總共79頁。（五）超速離心技術ultracentrifugation

是細胞生化分析研究的基礎實驗方法，是分離純化細胞亞微結構和生物大分子的重要技術手段，超離心可達幾萬——幾十萬轉/分（g）的高轉速，各種細胞亞微顆粒在離心場中的沉降速率不一樣，衡量各種物質顆粒在單位強度離心場中沉降速率的量度，稱為沉降系數(shù)。沉降系數(shù)的單位叫斯維伯格單位Svedbergunit簡稱“S”，各種細胞亞微結構和蛋白質顆粒都具有各自固定的S值。當前54頁，總共79頁。1、差速離心differentialcentrifugation是利用不同離心速度所產生的離心力差別，可將大小不同的亞微結構顆粒分離開，此法適用于分離沉降速率差別較大的亞微結構顆粒，而對于差別較小的則應采用密度梯度離心法。2、密度梯度離心densitygradientcentrifugation首先將離心溶液制備成連續(xù)or不連續(xù)增高的密度梯度，其密度變化的范圍與待分離顆粒的密度大致相當，然后通過一段時間離心操作后，不同密度的顆粒就會分別集中在相應的密度梯度區(qū)帶之中，得以分離。當前55頁，總共79頁。圖2-22差速離心

速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀

細胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體

與過氧化物酶體當前56頁，總共79頁。常用的密度梯度離心方法有兩種：（1）蔗糖密度梯度離心，即事先配制一系列不同濃度的蔗糖濃度，分先后順序緩緩注入，離心管制成自下而上速減的濃度梯度（5~20%或10~60%）再將待分離的顆?；旌蠎乙杭釉谧钌厦?，然后在離心過程中，這些顆粒在蔗糖濃度梯度中沉降，當沉降達到平衡狀態(tài)時，不同類型的顆粒便會分別集中在不同濃度區(qū)帶，最后掌握在顆粒區(qū)帶到達管底前停止離心按區(qū)帶分別收集樣品（在管底開口）（2）氯化銫密度梯度離心，氯化銫的密度梯度不需事先制備，而是在離心場中自行形成穩(wěn)定的連續(xù)梯度，在離心前，將待分離的生物大分子懸液加入氯化銫溶液中，離心時氯化銫形成穩(wěn)定梯度后各種生物大分子便會向梯度中相當?shù)母×γ芏鹊奈恢靡苿?，最終每種類型的大分子在等密點形成一條狹窄的帶，因此這種方法又被稱為等密度梯度離心。當前57頁，總共79頁。圖2-23.密度梯度離心

A.等速度沉降(分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器)，

B.等密度沉降(分離密度不等的顆粒)

當前58頁，總共79頁。三、細胞生理測試（一）細胞膜電位測定:細胞膜內外兩側的陽離子濃度不同，通常是外高內低（外正內負），造成細胞膜內外具有一定的電位差，被稱為膜電位，例如一般動物細胞的膜電位是60~90mv，膜電位的變化能反映細胞生理變化，譬如當神經興奮信號傳導時，或肌肉收縮運動時，膜電位都發(fā)生顯著變化。測量膜電位采用微電極，微電極是由毛細玻璃管構成，管內注滿KCL溶液，插入一根銀絲，Ag絲用導線與電位計or示波器連接。測量時使用一對微電極，一個插入細胞內，一個插在細胞外的介質中即可以電位計or示波器來顯示和記錄細胞內外的電位變化。當前59頁，總共79頁。（二）細胞電泳cellelectropboresis

細胞表面的分子具有電荷基團，因此在外加電場作用下，懸液中的細胞都會朝正極泳動這稱為細胞電泳，不同類型的細胞or處于不同生理狀態(tài)下的同種細胞，由于其細胞表面的電荷是有所不同，所以在同電場中的電泳對研究細胞癌變有重要作用，此外，細胞電泳裝置還能用來分離不同種類的活細胞。當前60頁，總共79頁。流式細胞術是對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。在分析或分選過程中，包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經探測器檢測，轉換為電信號，送入計算機處理，統(tǒng)計結果，并可根據(jù)這些性質分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%（圖2-24）。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞儀（flowcytometer）。當前61頁，總共79頁。圖2-24用流式細胞計分選細胞當前62頁，總共79頁。四、其它實驗技術（一）細胞培養(yǎng)cellculture

胚胎培養(yǎng)——離體組織culture——細胞culture.細胞culture是細胞生物學的基礎研究技術，同時在醫(yī)學、農業(yè)等領域都有廣闊的應用價值。原理：將生物體的某一類群細胞，甚至單個細胞分離出來，放入具有適合細胞生活條件的培養(yǎng)器皿中，維持并促進其正常生長和繁殖。當前63頁，總共79頁。技術環(huán)節(jié)：

細胞分離，culture條件和培養(yǎng)基，細胞分離方式——機械分解，酶解處理，動物組織細胞通常以胰蛋白酶消化細胞內的聯(lián)結，植物組織細胞則多以纖維素酶和果膠酶消化細胞壁等聯(lián)結物質，細胞培養(yǎng)條件要盡可能與生物體內生理狀況一致。主要是培養(yǎng)溫度，PH值和滲透壓等，此外，細胞culture還必須保持嚴格無菌，因為離體細胞已脫離了生物體免疫系統(tǒng)保護，是極易受bacteria.真菌等微生物的污染侵害，培養(yǎng)基的選擇是決定culture成敗的技術關鍵，培養(yǎng)基主要成分包括：各種氨基酸，維生素，碳水化合物，無機鹽以及能促進細胞生長，分裂的生長素，細胞激動素等，動物細胞culture基中還需要增添胎牛血清。當前64頁，總共79頁。細胞培養(yǎng)方式：液體懸浮培養(yǎng)，平板培養(yǎng)，回轉玻璃管培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)的名詞概念：（1）傳代：當培養(yǎng)細胞長滿一層后，分瓶接種再培養(yǎng)，每傳一次稱為一代（同時分裂生長接觸一致）（2）原代細胞：指從組織中分離出來，連續(xù)培養(yǎng)五代之內的細胞（3）傳代細胞：連續(xù)培養(yǎng)五代以后的細胞（4）細胞株(cellstrain):從原代培養(yǎng)物中接種出來的一群不均一的細胞群（染色體數(shù)目不變，不能無限長期傳代、繁衍）。當前65頁，總共79頁。

（5）細胞系：cellline是具有固定特性和標志的一個類型培養(yǎng)細胞。

細胞系一般都是轉化細胞，可以無限傳代長期繁衍下去，每種細胞系都具有特殊的遺傳標志特征，例如具有某種生化藥劑的抗性突變基因，而且這些遺傳標志在繼續(xù)培養(yǎng)中可保持穩(wěn)定不變這樣才能被學術界公認為是一個新的細胞系，（接觸不一致，染色數(shù)目突變）。

當前66頁，總共79頁。細胞系是供細胞遺傳學，細胞生理學、免疫病理學研究工作用的好試驗材料，

例如：Hela細胞系是1953年取自一位美國黑人婦女子宮頸癌上皮細胞，現(xiàn)在全世界都采用該細胞系做人類細胞生化等研究研究的典型材料；再如世界著名的動物的細胞試驗材料之一：CHO細胞line(Chinesehamsterootheea)取自中國倉鼠卵巢組織的細胞系。當前67頁，總共79頁。（6）克隆clone：

即無性繁殖系。目前有植物clone,動物clone,微生物clone,胚胎clone,細胞clone和分子clone之分，細胞clone即指由單個細胞培養(yǎng)繁殖而成的一群遺傳性狀完全相同的細胞群體，如果一個細胞系是通過clone形成法產生的，那么這個細胞系就可稱為一個clone。當前68頁，總共79頁。圖2-25群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）當前69頁，總共79頁。圖2-26植物細胞培養(yǎng)當前70頁，總共79頁。單克隆抗體技術是細胞雜交技術的成功應用，正常淋巴細胞（如小鼠脾細胞）具有分泌抗體的能力，但不能在體外長期培養(yǎng)，瘤細胞（如骨髓瘤）可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。于是英國人Kohler和Milstein1975將兩種細胞雜交，產生了能無限繁殖并能分泌抗體的雜交細胞而創(chuàng)立了單克隆抗體技術，獲1984年諾貝爾獎。當前71頁，總共79頁。圖2-27單克隆抗體技術脾細胞骨髓瘤當前72頁，總共79頁。（二）細胞顯微操作技術micromanipulation

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