聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用

聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用第一頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展1PCR的原理與反應(yīng)條件PCR技術(shù)的反應(yīng)條件PCR技術(shù)的基本原理PCR反應(yīng)的質(zhì)量指標(biāo)第二頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）又稱為PCR擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效、快速、特異性的體外DNA聚合程序。

1985年，美國PE-cetus公司人類遺傳研究室的Karymullis發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的PCR技術(shù)；

1988年，美國PE-cetus公司推出世界上第一臺PCR熱循環(huán)儀，從而使PCR反應(yīng)自動化；

1993年，Karymullis因發(fā)明PCR技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎；

1995年，定量PCR儀誕生，使定量研究DNA靶序列成為現(xiàn)實(shí)。第三頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR技術(shù)的基本原理5‘5‘待擴(kuò)增DNA區(qū)域5‘變性加熱5‘5‘引物退火5‘5‘底物聚合5‘5‘5‘5‘加熱變性5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘退火引物底物聚合加熱變性引物退火底物聚合1235‘5‘5‘第四頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR技術(shù)的反應(yīng)條件DNA或RNA模板5‘5‘待擴(kuò)增DNA區(qū)域5‘94℃5min5‘5‘55℃退火5‘5‘聚合5‘5‘5‘5‘5‘循環(huán)25-30次目標(biāo)DNA片段達(dá)106-107變性70℃DNA引物DNA聚合酶dNTPsMg2+（緩沖液）第五頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR反應(yīng)的質(zhì)量指標(biāo)PCR反應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有：特異性（序列選擇）有效性（序列產(chǎn)量）上述三大標(biāo)準(zhǔn)并非由單一因素所決定，因此在PCR反應(yīng)中必須準(zhǔn)確性（序列對錯）對多種參數(shù)進(jìn)行聯(lián)合控制和改進(jìn)，但由于PCR反應(yīng)中的各參數(shù)往往是相互影響的，因此任何參數(shù)的改進(jìn)不可能同時(shí)滿足特異性、有效性、準(zhǔn)確性。第六頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR擴(kuò)增反應(yīng)的精確性2PCR的DNA聚合酶與擴(kuò)增的精確性用于PCR的DNA聚合酶簡介DNA聚合酶對PCR精確性的重要影響DNA聚合酶的使用第七頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR擴(kuò)增反應(yīng)的精確性利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA靶序列的一個(gè)重要問題是這種DNA體外聚合反應(yīng)的序列忠實(shí)程度，即DNA擴(kuò)增產(chǎn)物序列的準(zhǔn)確率。PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合反應(yīng)，除了缺少完善的DNA聚合校正系統(tǒng)外，影響PCR反應(yīng)準(zhǔn)確率的因素還包括：DNA聚合酶的保真性能（主要因素）DNA鏈的物理損傷PCR反應(yīng)體系的潔凈度第八頁，共六十頁，2022年，8月28日DNA聚合酶對PCR精確性的重要影響

DNA聚合酶的保真性主要取決于其3’→5’的核酸外切酶活性，它負(fù)責(zé)對錯誤摻入的堿基進(jìn)行校正。相關(guān)研究結(jié)果表明，DNA聚合酶的出錯率在每輪延伸每核苷酸1.6X10–6-2.1X10–4范圍內(nèi)。DNA聚合酶的堿基摻入錯誤可能發(fā)生在其延伸階段的五種活性：與dNTP的結(jié)合特異性磷酸二酯鍵的形成速率焦磷酸的釋放速率堿基錯誤摻入之后的持續(xù)延伸性3’→5’的核酸外切活性的強(qiáng)弱第九頁，共六十頁，2022年，8月28日用于PCR的DNA聚合酶簡介TaqDNA酶的聚合出錯率較高（2.1X10-4），因?yàn)樗鼪]有3’→5’的的核酸外切酶活性和校正功能。然而通過優(yōu)化反應(yīng)條件，可使Taq酶的聚合出錯率降低到原來的1/3。TaqDNA聚合酶催化的聚合反應(yīng)的普遍則TaqDNA酶還常常導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的缺失突變。TaqDNA聚合酶（Thermusaquaticus）錯誤類型是由AT轉(zhuǎn)換為GC；如果模板DNA具有形成二級結(jié)構(gòu)的可能性避免稀釋保存TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶在室溫下也具有延伸引物的活性TaqDNA酶在使用時(shí)應(yīng)注意：第十頁，共六十頁，2022年，8月28日用于PCR的DNA聚合酶簡介KlenTaqDNA聚合酶是一種N端缺失了的TaqDNA聚合酶，因而沒有5’的核酸外切酶活性；KlenTaqDNA聚合酶的Mg2+最佳濃度范圍很寬，因此很容易優(yōu)化KlenTaqDNA聚合酶（Thermusaquaticus）在最佳反應(yīng)條件下，KlenTaqDNA聚合酶出錯率為5.1X10–5，性能略優(yōu)于TaqDNA聚合酶。反應(yīng)條件；第十一頁，共六十頁，2022年，8月28日用于PCR的DNA聚合酶簡介TthDNA聚合酶在Mn2+的存在下，能有效地反轉(zhuǎn)錄長度在1000堿基以下的RNA；TthDNA聚合酶在Mg2+的存在下，能由DNA模板合成DNA；

TthDNA聚合酶（Thermusthermophilus）好地克服RNA鏈中普遍存在二級結(jié)構(gòu)的難題。TthDNA聚合酶在較高的溫度下仍具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，因此能很

第十二頁，共六十頁，2022年，8月28日用于PCR的DNA聚合酶簡介Pfu是一種高保真的DNA聚合酶，出錯率極低；PfuDNA聚合酶擴(kuò)增出的產(chǎn)物帶有平頭末端；PfuDNA聚合酶擴(kuò)增速度極快，達(dá)1.5-2min/kb；PfuDNA聚合酶（Pyrococcusfuriosus）PfuDNA聚合酶的熱穩(wěn)定性很高。 7.0X10–7-1.6X10–6第十三頁，共六十頁，2022年，8月28日用于PCR的DNA聚合酶簡介

VentDNA聚合酶具有3’→5’的核酸外切酶活性和校正功能，因此與其它DNA聚合酶（如Taq酶）相比，具有相對較好的高保真性，其出錯率為2.4X10–5-5.7X10–5；

VentDNA聚合酶（Thermococcuslitoralis）度小于2kb時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的長度與Mg2+的濃度并無關(guān)聯(lián)；

如果擴(kuò)增長度大于2kb，則需要高于2mM的Mg2+，而在擴(kuò)增長如果模板鏈中存在次黃嘌呤核苷或脫氧尿嘧啶核苷，Vent

DNA聚合酶不能延伸引物。

第十四頁，共六十頁，2022年，8月28日用于PCR的DNA聚合酶簡介

DeepVentDNA聚合酶是一種在低溫和高溫條件下均極其穩(wěn)定的聚合酶，且能使用廣范圍的輔助溶劑如甲酰胺和DMSO等；DeepVentDNA聚合酶能產(chǎn)生長達(dá)14kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，其外切酶DeepVentDNA聚合酶（PyrococcusspeciesGB-D）活性比VentDNA聚合酶高4倍，聚合活性比TaqDNA酶高5-15倍，度小于2kb時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的長度與Mg2+的濃度并無關(guān)聯(lián)；

如果擴(kuò)增長度大于2kb，則需要高于2mM的Mg2+，而在擴(kuò)增長如果模板鏈中存在次黃嘌呤核苷或脫氧尿嘧啶核苷，Vent

DNA聚合酶不能延伸引物。

出錯率比VentDNA聚合酶低2

倍；第十五頁，共六十頁，2022年，8月28日用于PCR的DNA聚合酶簡介

UlTma是一種高保真的DNA聚合酶，可以較高的產(chǎn)量擴(kuò)增小于3kb的DNA靶序列，產(chǎn)物呈平頭末端。UITmaDNA聚合酶（Thermotogamaritima）第十六頁，共六十頁，2022年，8月28日DNA聚合酶的使用DNA聚合酶的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍：1-5Units/mL特異性的改進(jìn)：在建議使用的范圍內(nèi)盡可能地降低酶濃度。聚合酶的濃度是決定PCR反應(yīng)成本的的重要參數(shù)，濃度過高不僅能降特異性，同時(shí)也導(dǎo)致不必要的消耗。準(zhǔn)確性的改進(jìn)：建議使用高保真的DNA聚合酶第十七頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR模板制備與純化3PCR的模板與制備PCR模板的使用粗樣品中的PCR抑制劑第十八頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR模板制備與純化DNA和RNA均可作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板，但一般情況下，mRNA先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR模板的來源主要有兩大類：純凈物如重組質(zhì)粒、制備的染色體DNA、回收的DNA片段粗樣品如糞便、腦脊髓液、血液、食物、動物貝殼、土壤、尿液、唾液、福爾馬林固定劑、組織切片、膿汁、噴嚏液、痰液等

上述粗樣品含有大量的PCR反應(yīng)抑制物質(zhì)，因此如何去除這些種類繁多的抑制劑或者添加必要的PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑顯得十分重要。

第十九頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR模板制備與純化從各種粗樣品中去除PCR反應(yīng)抑制劑的程序不盡相同，但常用的手段包括：樣品稀釋溶劑萃?。确漏s異戊基乙醇49﹕1）乙醇沉淀高速離心超濾第二十頁，共六十頁，2022年，8月28日粗樣品中的PCR抑制劑糞便 膽鹽、膽紅素（抑制濃度50mg/mL）血液

亞鐵血紅素、聚乙醇磺酸鈉、heparin（抗凝劑）土壤腐殖物質(zhì)、含鐵化合物植物

硫酸右旋糖苷食品未鑒定的抑制劑痰液未鑒定的抑制劑第二十一頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR模板的使用PCR模板的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍：102-105

拷貝特異性的改進(jìn)：增加模板DNA的量、降低引物與模板的分子比有效性的改進(jìn)：增加引物與模板的分子比模板濃度的變化很大程度上取決于待擴(kuò)增的堿基序列，但一般而言，模板DNA長度小，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量就大，因此對于大分子量的模板DNA（尤其是真核生物基因組DNA），在擴(kuò)增之前最好先用超聲波處理或限制性酶消化。第二十二頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR引物的設(shè)計(jì)原則4PCR的引物設(shè)計(jì)及合成PCR引物的使用引物的在線設(shè)計(jì)工具及免費(fèi)軟件簡介第二十三頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR引物的設(shè)計(jì)原則選擇合適的引物是PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的重要步驟，合適引物最基本的引物的長度標(biāo)準(zhǔn)就是與靶序列的高特異性雜交。為達(dá)到此目的，引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意下列幾點(diǎn)：理想的引物長度應(yīng)該在18-30個(gè)堿基之間，常見的是20-27個(gè)堿基第二十四頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR引物的設(shè)計(jì)原則引物的GC含量引物序列中的GC含量應(yīng)在35%-65%之間，最好在45%-55%范圍內(nèi)。如果因靶序列的原因，引物不得不含有過高的GC堿基，那么就在其5’端設(shè)計(jì)一串A或T；同樣，如果引物中的AT含量過高，就在其5’

端設(shè)計(jì)一串G或C，以便將整條引物的GC含量控制在合適的范圍內(nèi)。第二十五頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR引物的設(shè)計(jì)原則退火溫度（Ta）引物的退火溫度一般要比估計(jì)的相應(yīng)熔點(diǎn)溫度低5℃左右，在很多情況下，兩條引物的退火溫度不盡相同，只要兩者相差不到4-6℃，尚不至于影響RCR擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)量，但它們的退火溫度應(yīng)在55-75℃范圍引物堿基≤20，Ta

=4X（G+C）+2X（A+T）-5（℃）

內(nèi)。如果兩條引物的退火溫度差別過大，可以適當(dāng)延長較低Ta值的引物的3’端（這樣可以保持?jǐn)U增產(chǎn)物的長度不變）或5’端。引物的Ta值估算有多種公式，最好根據(jù)RCR試劑盒建議的計(jì)算方法，例如AlkamiQuickGuide?試劑盒建議的計(jì)算方法如下：引物堿基≥20，Ta

=62.5+0.41X（GC%）-500/長度

-5（℃）

第二十六頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR引物的設(shè)計(jì)原則杜絕互補(bǔ)區(qū)域的存在引物序列和靶序列各自內(nèi)部應(yīng)杜絕互補(bǔ)區(qū)域的存在。為擴(kuò)增后操作提供便利條件在不影響擴(kuò)增反應(yīng)特異性的前提下，可在引物的5’端引入諸如限限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)、啟動子序列等有用的非模板序列，以便于擴(kuò)增后操作。第二十七頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR引物的設(shè)計(jì)原則引物與模板的互補(bǔ)程度在一般情況下，并不要求引物與模板的序列達(dá)到100%互補(bǔ)，但檢查靶序列上其它可能存在的引物同源區(qū)域?yàn)榱藴p少PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染本底，在設(shè)計(jì)引物序列時(shí)應(yīng)檢查模板DNA上是否存在潛在的引物同源區(qū)域。

盡可能高的互補(bǔ)程度是必要的。第二十八頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR引物的設(shè)計(jì)原則選擇內(nèi)含子序列作為引物序列在真核生物中，即便是在重復(fù)基因的不同家族成員之間，其內(nèi)含引物的末端序列在引物的兩端設(shè)置1-2個(gè)嘌呤堿基，最好在引物的3’端避免G或C

這樣可以在聚合反應(yīng)開始時(shí)增加引物后面堿基摻入的機(jī)會。引物3’端子序列也是隨機(jī)多樣性的。至少應(yīng)有1-2個(gè)堿基必須是特異性的。

第二十九頁，共六十頁，2022年，8月28日引物的在線設(shè)計(jì)工具及免費(fèi)軟件簡介ThePrimerGenerator（TPG）

TPG是一種基于CGI數(shù)據(jù)庫便利的用于定點(diǎn)突變的引物設(shè)計(jì)工具。只要在網(wǎng)頁上相應(yīng)的位置中鍵入不超過15個(gè)堿基的短核苷酸序列、所期望的氨基酸序列、以及允許替換的最大堿基數(shù)，設(shè)計(jì)工具便會提供滿足初始要求的所有可能的引物序列，還能顯示酶切位點(diǎn)的消失或增加。但TPG的一個(gè)明顯缺陷是不能計(jì)算引物的Tm值并判斷其穩(wěn)定性。第三十頁，共六十頁，2022年，8月28日引物的在線設(shè)計(jì)工具及免費(fèi)軟件簡介Primers!

Primers!是一種基于Java的引物設(shè)計(jì)程序，可以選擇所期望的引物長度、最大Tm值、最小Tm值、誤配堿基對數(shù)等四種參數(shù)輸入引物序列其特殊的優(yōu)點(diǎn)是能限定所輸入的序列中適合引物設(shè)計(jì)的區(qū)域，這對檢索若干kb長的DNA片段中各種可能的引物是很有利的。而且能根據(jù)三種計(jì)算方法顯示正反向引物的Tm值，可以隨意更換堿基以提高或降低Tm值同時(shí)還能提供引物穩(wěn)定性的參數(shù)，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物二聚體、引物相似性等。缺點(diǎn)是不能計(jì)算發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物二聚體的響應(yīng)Tm值。第三十一頁，共六十頁，2022年，8月28日引物的在線設(shè)計(jì)工具及免費(fèi)軟件簡介其它的在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站

WWWGeneFisher

WebPrimers

ProjectDOPE2

NetPrimer

Oligos-U-LikePrimers3

第三十二頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR引物的使用PCR引物的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍：0.1-1.0mM，最好0.2-0.5mM

特異性的改進(jìn)：降低引物和dNTP的濃度可以在很大程度上改有效性的改進(jìn)：增加引物與模板的分子比；如果引物中有不配善PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，高濃度的引物往往會導(dǎo)致非特異性的退火及副產(chǎn)物形成，同時(shí)也會促進(jìn)引物二聚體的產(chǎn)生。在模板量一定的情況下，降低引物濃度實(shí)際上也是降低引物與模板的分子之比。對的堿基，則適當(dāng)降低引物的濃度。

第三十三頁，共六十頁，2022年，8月28日5PCR反應(yīng)的其它控制參數(shù)脫氧三磷酸核苷酸（dNTPs）

預(yù)熱變性溫度和時(shí)間Mg+2離子退火雜交溫度和時(shí)間延伸聚合溫度和時(shí)間循環(huán)次數(shù)反應(yīng)體積第三十四頁，共六十頁，2022年，8月28日脫氧三磷酸核苷酸（dNTPs）dNTPs的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍：20-200mM特異性的改進(jìn)：降低dNTPs的濃度，但要注意Mg+2的摩爾濃度有效性的改進(jìn)：對于較大分子量的模板，應(yīng)適當(dāng)提高dNTPs的量如果一種dNTP的濃度過高，它就會優(yōu)先摻入到延長鏈中，造成擴(kuò)增產(chǎn)物的不準(zhǔn)確，因此要保持四種dNTPs的一致。此外，保持四種dNTPs的濃度略高于DNA聚合酶對各種dNTPs的Km值也很重要（10-15mM）。也應(yīng)同步降低。準(zhǔn)確性的改進(jìn)：降低dNTPs的濃度，但要注意Mg+2的摩爾濃度也應(yīng)同步降低。第三十五頁，共六十頁，2022年，8月28日Mg+2離子Mg+2的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍：0.5-10mM特異性的改進(jìn)：降低Mg+2濃度，但要注意過低的Mg+2濃度又會影有效性的改進(jìn)：提高M(jìn)g+2濃度，但過量Mg+2將導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增游離的Mg+2離子濃度應(yīng)高于dNTPs總濃度。由于Mg+2

能與dNTPs形成可溶性的復(fù)合物，過低濃度的Mg+2離子將會影響dNTPs的有效濃度。Mg+2的濃度影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、引物退火、引物二聚體的形成、熔點(diǎn)溫度、酶的活性和準(zhǔn)確性。因此，PCR反應(yīng)系統(tǒng)的主要優(yōu)化參數(shù)是Mg+2的濃度，尤其當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物大大于1kb時(shí)，這個(gè)因素顯得更為重要。響擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量。

第三十六頁，共六十頁，2022年，8月28日預(yù)熱變性溫度和時(shí)間預(yù)熱溫度和時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍：92-96℃30secs-10mins在酶不存在時(shí)，預(yù)熱能滅活樣品中有害的蛋白酶和核酸酶，同時(shí)又能保證模板的完全變性，尤其是基因組DNA直接作為模板使用時(shí)，更顯得重要。變性溫度和時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍：92-96℃30-120secs第三十七頁，共六十頁，2022年，8月28日

退火雜交溫度和時(shí)間退火溫度和時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍：37-65℃10-120secs退火時(shí)，引物迅速雜交。不同DNA聚合酶所擁有的Tm值的差異會改變有效的引物退火溫度。特異性的改進(jìn)：提高退火溫度（比建議退火溫度提高2-5℃）；減少退火時(shí)間。過長的退火時(shí)間在正常情況下并不能提高產(chǎn)量，只會增加非特異性引物雜交的可能性。第三十八頁，共六十頁，2022年，8月28日延伸聚合溫度和時(shí)間延伸聚合溫度和時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍：72℃60-120secs

PCR擴(kuò)增反應(yīng)中普遍使用的DNA聚合酶的聚合速度每秒至少50個(gè)堿基，所以如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度小于400bp，聚合時(shí)間可以少于15秒，特別是當(dāng)退火溫度選得較高的時(shí)候，在退火階段就有一些單體摻入。較長PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增需要相應(yīng)延長反應(yīng)時(shí)間，但最好要比理論計(jì)算時(shí)間更長些，以彌補(bǔ)由于反應(yīng)系統(tǒng)粘度增大所產(chǎn)生的反應(yīng)滯后作用。第三十九頁，共六十頁，2022年，8月28日循環(huán)次數(shù)在一定的循環(huán)次數(shù)下，PCR反應(yīng)的最終產(chǎn)量可由下式估算：由上式可以看出，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)擴(kuò)增，但當(dāng)然產(chǎn)物拷貝數(shù)達(dá)到1012（閾值）時(shí)產(chǎn)物的擴(kuò)增速度一般急劇下降。達(dá)到這個(gè)階段所需要的循環(huán)次數(shù)可由下式計(jì)算：影響上述擴(kuò)增閾值的主要因素包括： 擴(kuò)增底物（引物和dNTPs）有效濃度的下降 Nf=N0X2N其中N為循環(huán)次數(shù)，N0為起始拷貝數(shù)，N0為最終拷貝數(shù) Nf=N0（1+Y）N

非特異性產(chǎn)物或引物二聚體對反應(yīng)試劑的競爭作用

反應(yīng)試劑的穩(wěn)定性 擴(kuò)增產(chǎn)物抑制作用 高濃度產(chǎn)物的退活作用以及不完全變性

特異性的改進(jìn)：降低循環(huán)次數(shù)，減小擴(kuò)增片段長度。有效性的改進(jìn)：對于1kb以上片段的擴(kuò)增，增加循環(huán)中各步驟的滯留時(shí)間。

第四十頁，共六十頁，2022年，8月28日反應(yīng)體積反應(yīng)體積的標(biāo)準(zhǔn)范圍：20-100ml（0.5ml的小離心管）有效性的改進(jìn)：增加反應(yīng)體積以及保溫時(shí)間，以充分保證熱平衡；5ml的反應(yīng)體積也有成功的例子。反應(yīng)體積過大會影響加熱和冷卻，而過小的反應(yīng)體積又容易導(dǎo)致溫度變化不穩(wěn)定，進(jìn)而降低產(chǎn)量，甚至反應(yīng)管的幾何尺寸、管壁厚薄、擴(kuò)增儀的加熱冷卻裝置也能影響各循環(huán)步驟所需的時(shí)間。對于100ml以下的反應(yīng)體積還應(yīng)該用油封頂，以減少反應(yīng)體系的蒸發(fā)濃縮效應(yīng)。第四十一頁，共六十頁，2022年，8月28日6PCR技術(shù)的衍生與發(fā)展LAPCR（LongandAccuratePCR）

RTPCR（ReverseTranscriptase）

原位PCR（InSituPCR）

定量PCR（QuantitativePCR）錨定PCR（AnchoredPCR）多重PCR（MultiPCR）反向PCR（InvertedPCR）

不對稱PCR（AsymmetricPCR）

第四十二頁，共六十頁，2022年，8月28日LAPCR（LongandAccuratePCR）

LAPCR是一種專門用于精確擴(kuò)增較長DNA片段的特種PCR程序，其關(guān)鍵的技術(shù)是結(jié)合使用兩種熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，可以擴(kuò)增出5-40kb的DNA大片段。兩種酶的配比如下：其中，Pfu和DeepVent起著二次校對的作用。KlenTaq∶Pfu=16∶1KlenTaq∶DeepVent=50∶1第四十三頁，共六十頁，2022年，8月28日RTPCR（ReverseTranscriptase）

RT-PCR是一種以mRNA為模板，經(jīng)cDNA擴(kuò)增出DNA的技術(shù)，能極其靈敏地檢測到任何基因的轉(zhuǎn)錄物，而與mRNA的相對量無關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR程序包括：

mRNA的分離

cDNA反應(yīng)的引物退火

mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA

cDNA的PCR擴(kuò)增引物選擇有三種戰(zhàn)略：

基因特異性引物化（GSP），最精確最靈敏

寡聚dT引物化

隨機(jī)六聚體引物化第四十四頁，共六十頁，2022年，8月28日反向PCR（InvertedPCR）通常，PCR反應(yīng)是對兩條引物之間的序列進(jìn)行擴(kuò)增，但如果將模板DNA稍酶切環(huán)化酶切擴(kuò)增做處理，即可實(shí)現(xiàn)對已知序列兩側(cè)的片段進(jìn)行擴(kuò)增，這種戰(zhàn)略稱為反向PCR技術(shù)。第四十五頁，共六十頁，2022年，8月28日不對稱PCR（AsymmetricPCR）在PCR擴(kuò)增循環(huán)中引入不同的引物濃度，使得由兩條引物介導(dǎo)擴(kuò)增反應(yīng)呈不對稱狀態(tài)，這種戰(zhàn)略稱為不對稱PCR技術(shù)。不對稱PCR中的兩條引物濃度一般采用50-100∶1的配比，在最初的10-15個(gè)循環(huán)中，主要產(chǎn)物還是雙鏈DNA，但當(dāng)?shù)蜐舛鹊囊锖谋M后，高濃度引物引導(dǎo)的PCR反應(yīng)便會產(chǎn)生大量的單鏈第四十六頁，共六十頁，2022年，8月28日原位PCR（InSituPCR）原位PCR是PCR技術(shù)與原位雜交技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物。原位雜交技術(shù)可以檢測到10個(gè)拷貝的DNA或細(xì)胞，而原位PCR技術(shù)能使雜交的靈敏度提高10倍，也就是說人們可以在1mg的細(xì)胞DNA樣品中檢測到1個(gè)拷貝的特定DNA序列。

一個(gè)典型的原位PCR程序包括下列四個(gè)步驟： 待檢測的組織或細(xì)胞用甲醛溶液固定 用蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行通透性處理，確保PCR試劑能進(jìn)入細(xì)胞 對DNA或RNA靶序列進(jìn)行胞內(nèi)原位擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通常用地高辛系統(tǒng)標(biāo)記，色譜檢測儀檢測第四十七頁，共六十頁，2022年，8月28日定量PCR（QuantitativePCR）

理論上講，PCR產(chǎn)物以指數(shù)規(guī)律增殖，但在所有的擴(kuò)增循環(huán)（尤其是后十輪）中，眾多引物-模板分子上的反應(yīng)由于抑制劑的作用并非100%的有效，因此精確定量PCR產(chǎn)物必須使用內(nèi)標(biāo)（擴(kuò)增對照）。貝的特定DNA序列。

內(nèi)標(biāo)使用相同的引物，與待測樣品具有相似的長度、堿基組成以及對抑制劑的敏感性，但又必須與待測樣品有所區(qū)別，以便在擴(kuò)增產(chǎn)物檢測分析時(shí)能夠辨認(rèn)（如引物的檢測方式不同）。C0/X0=Cn/Xn X0=C0（Cn/Xn）其中，C0和X0分別為內(nèi)標(biāo)和待測樣品的初始拷貝數(shù)，在1∶10到10∶1的范圍內(nèi)最佳；Cn/Xn分別為內(nèi)標(biāo)和待測樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物分子比第四十八頁，共六十頁，2022年，8月28日多重PCR（MultiPCR）加入多對引物，對同一P1P2P3P4P1‘P2’P3‘P4’正常人擴(kuò)增物病人擴(kuò)增物模板的若干區(qū)域進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增。適用于繪制真核生物龐大基因或基因組中的缺失圖譜，如分子病的臨床輔助診斷。第四十九頁，共六十頁，2022年，8月28日錨定PCR（AnchoredPCR）反轉(zhuǎn)錄AAAAA

3’5’3‘

GGGGGGGGTdT錨定引物錨定PCR又稱為cDNA末端快速擴(kuò)增PCR，主要用于5‘端序列未知的cDNA的擴(kuò)增和克隆。5’5’5’dGTP5’5‘

CCCCCCCCPCR3‘

GGGGGGGG5’5‘

CCCCCCCC3’PCR5‘

CCCCCCCC5’特異性引物第五十頁，共六十頁，2022年，8月28日7PCR技術(shù)在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用特定DNA序列的克隆與重組子的鑒定

PCR-SSCP檢測基因序列DNA洗牌術(shù)（Shuffling）染色體DNA的引物原位雜交DNA的體外定點(diǎn)突變與分析同源重組子的檢測第五十一頁，共六十頁，2022年，8月28日特定DNA序列的克隆與重組子的鑒定GAATTCGGATCCGAATTCCTTAAGGGATCCCCTAGGPCR擴(kuò)增PCR產(chǎn)物克隆EcoRIBamHIPCR鑒定第五十二頁，共六十頁，2022年，8月28日DNA的體外定點(diǎn)突變與分析PCR擴(kuò)增突變位點(diǎn)變性復(fù)性除去引物延伸加外側(cè)引物第五十三頁，共六十頁，2022年，8月28日同源重組子的檢測同源整合目的基因同源交換目的基因整合位點(diǎn)PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增第五十四頁，共六十頁，2022年，8月28日PCR-SSCP檢測基因序列將PCR技術(shù)與單鏈構(gòu)型多態(tài)性（SSCP）分析技術(shù)聯(lián)合使用，可以有效地檢測和分析基因序列的突變性質(zhì)。在非變性的聚丙烯酰凝膠電泳條件下，單鏈