小吞噬實驗的學習課件

小吞噬實驗的學習課件第1頁/共16頁二、目的與要求1.了解中性粒細胞生物學特性及其意義。2.熟悉“細菌計數(shù)法測定中性粒細胞吞噬功能”試驗的原理、方法及用途。

第2頁/共16頁[實驗原理]中性粒細胞——來源于骨髓造血干細胞；占白細胞總數(shù)的60%~70%；生命周期短，不能分裂，靠“造血”補充；胞核呈多葉狀；胞質(zhì)內(nèi)有多種顆粒；內(nèi)含髓過氧化物酶、防御素、溶菌酶、組織蛋白酶、乳鐵蛋白、堿性磷酸酶等。中性粒細胞特有，巨噬細胞沒有這種酶，為中性粒細胞在細胞化學上的標志。第3頁/共16頁中性粒細胞通過趨化、調(diào)理、吞入和殺菌等步驟，吞噬和消化衰老、死亡細胞及病原微生物等異物；中性粒細胞產(chǎn)生偽足包圍異物——吞噬體或吞噬泡；吞噬——呼吸爆發(fā)——產(chǎn)生大量過氧化物及超氧化物等毒性效應分子——殺死吞噬的細菌等異物；第4頁/共16頁中性粒細胞：A.在抗化膿性細菌感染中起重要防御作用；B.引起感染部位急性炎癥反應；C.參與超敏反應（如III型超敏反應），引起機體免疫病理損傷。第5頁/共16頁將新鮮血液和細菌混合，經(jīng)合適時間后涂片染色，即能觀察到被吞噬到中性粒細胞內(nèi)但還未被消化掉的細菌。檢測中性粒細胞吞噬細菌的能力，可作為輔助判斷機體非特異性免疫力的指標之一。細菌計數(shù)法測定中性粒細胞吞噬功能——小吞噬實驗第6頁/共16頁檢測指標：1.吞噬百分率＝100個細胞中吞噬有細菌的細胞數(shù)人吞噬百分率正常參考值：62%~76%100×100%2.吞噬指數(shù)＝100個中性粒細胞吞噬的細菌總數(shù)人吞噬指數(shù)正常參考值：1.32~1.72100第7頁/共16頁(1)顯微鏡、香柏油、小試管、EP管、載玻片、酒精棉球、吸管、水浴箱等。(2)肝素抗凝試管、瑞氏染液、雙蒸水。(3)菌液制備：白色葡萄球菌18～24小時內(nèi)湯培養(yǎng)物，經(jīng)McFarland比濁法調(diào)整濃度至6～9×109/mL，加熱100℃15分鐘殺死細菌，置4℃保存?zhèn)溆谩嶒灢牧系?頁/共16頁(1)仔細消毒后，每個班取5ml靜脈血于肝素抗凝管內(nèi)（輕輕搖勻）。實驗方法(3)取出EP管，用吸管吹打混勻后，取1滴“全血-白色葡萄球菌混合液”置于潔凈載玻片上，用另一載玻片推片，制成血涂片。(2)每個組(2~3人)取4滴抗凝血于EP管內(nèi)，再加入2滴備好的白色葡萄球菌菌液，充分混勻后，置37℃水浴20min，中途混勻1次。(4)待血涂片自然涼干后，用瑞氏染液染色。第9頁/共16頁瑞氏染色瑞氏染液數(shù)滴覆蓋血涂片上染色1min再加等量的PH6.8PBS與染液混合，染色10~15min用蒸餾水沖洗（平持玻片，在一端加水，使染料“漂走”）自然干燥第10頁/共16頁顯微鏡油鏡原理顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率

1.放大倍數(shù)接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)2.

顯微鏡的分辨率表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點之間距離的能力，可用公式表示為：D=λ/2n·sin(α/2)D：物鏡分辨出物體兩點間的最短距離。：可見光的波長（平均0.55m)n:物鏡和被檢標本間介質(zhì)的折射率。：鏡口角（即入射角）。第11頁/共16頁油鏡使用的原理

1.香柏油的折射率與玻璃接近，提高了視野的照明度。

2.提高了顯微鏡的分辨率第12頁/共16頁顯微鏡油鏡的使用方法

1.用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。

2.調(diào)節(jié)光亮度

3.低倍鏡觀察：粗調(diào)、細調(diào)

4.依次再進行中倍、高倍觀察5.油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細調(diào)至看清物象為止。6.換片：另換新片，必須從第三條開始操作。

7.用后復原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復原。

第13頁/共16頁油鏡觀察首先尋找中性粒細胞——觀察胞質(zhì)中有無吞噬的細菌。如染色正確，可見細胞核及被吞噬的細菌染成紫色，而中性粒細胞胞漿染成淡紅色。計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)第14頁/共16頁(1)人類白細胞的吞噬活性在37℃時最好，溫度過高過低均會使其吞噬能力減低。注意事項(2)個體差異、年齡、健康狀況的不同，其吞噬能力亦不同。(4)取“細菌－全血”涂片時，要混勻后再??；制作血涂片要求推出尾部，過厚或過薄