分子生物學(xué)第九章遺傳重組

分子生物學(xué)第九章遺傳重組第1頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四概述第一節(jié)同源重組第二節(jié)位點專一性重組第三節(jié)細(xì)菌中的轉(zhuǎn)座成分第四節(jié)真核生物中的轉(zhuǎn)座成分第2頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四概述：?

只要有DNA，就會發(fā)生重組減數(shù)分裂溫和噬菌體轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座?生存→變異→進化?廣義遺傳重組：任何造成基因型變化的基因交流過程第3頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四?

重組可分為四類（DNA序列、蛋白質(zhì)因子）?狹義遺傳重組：涉及到DNA分子內(nèi)斷裂-復(fù)合的基因交流?遺傳重組與重組DNA技術(shù)類型需同源序列需RecA蛋白需序列特異性酶位點特異性+-+同源++-轉(zhuǎn)座--+異常--?第4頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)同源重組第5頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四1、

同源重組（homologousrecombination）:

發(fā)生在同源DNA序列之間一、特征2、

特征：?涉及同源序列間的聯(lián)會配對，且交換的片段較大?涉及DNA分子在特定的交換位點發(fā)生斷裂和連接的生化過程

?存在重組熱點?需要重組酶?單鏈DNA分子或單鏈DNA末端是交換發(fā)生的重要信號第6頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)線期合線期粗線期雙線期終變期?e.g.Euk.減數(shù)分裂時的染色單體之間的交換細(xì)菌的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)，接合，噬菌體重組第7頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四雙倍體染色體交換第8頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四二、同源重組的機制1、

斷裂復(fù)合及Holliday中間體的形成?

Holliday結(jié)構(gòu)同源重組中連接兩個DNA雙鏈的交換中間物含有4股DNA鏈，在連接處為了轉(zhuǎn)換配對所形成交叉鏈的連接點為…?Holliday結(jié)構(gòu)形成的分子機制（斷裂復(fù)合起始機制）

有雙鏈侵入模型、單鏈侵入模型、雙鏈斷裂修復(fù)模型等多種?同源重組都涉及到DNA分子內(nèi)的－－斷裂—復(fù)合第9頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四3‘5‘5‘3‘Meselson-Radding模型單鏈入侵模型（鏈轉(zhuǎn)移模型）置換侵入Loop切除同化異構(gòu)化分支遷移5’切割第10頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四5‘5‘（1）（2）其中－－所有模型和假說都包括切斷、鏈置換、連接等過程雙鏈侵入模型

第11頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四雙鏈斷裂修復(fù)模型第12頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四2、分枝遷移和Holliday結(jié)構(gòu)的拆分?分枝遷移（branchmigaration）－－雙螺旋形成的交叉連接以拉鏈?zhǔn)叫?yīng)擴散第13頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四Holliday的異構(gòu)化產(chǎn)生重組體的拆分Holliday結(jié)構(gòu)一經(jīng)生成即可不斷地處于異構(gòu)化－－異源雙鏈

heteroduplexDNA重組結(jié)果取決于拆分時配對鏈上的切口位置第14頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四（1）（2）（1）（2）?Holliday結(jié)構(gòu)的拆分產(chǎn)生含異源雙鏈的親本DNA分子產(chǎn)生重組體第15頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四“親本鏈”“重組體”第16頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四三、原核同源重組（E.coli）?發(fā)生在雙方DNA的同源區(qū)域

部分復(fù)制的染色體DNA之間或染色體DNA與外源DNA之間細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)

1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和Chi位點?具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、

序列特異性的單鏈內(nèi)切酶活性?單鏈內(nèi)切酶活性和解旋酶活性使DNA產(chǎn)生具有游離末端的單鏈－－－RecA的作用位點?RecBCD有固定切割位點第17頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四3‘?RecBCD的識別和切割位點a、RecBCD結(jié)合在DNA的平頭末端（產(chǎn)生機制不清楚）b、外切、解鏈、移動（ATP）c、兔耳狀loop結(jié)構(gòu)產(chǎn)生（再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD在loop單鏈區(qū)的

chi位點3‘方4～6NT處切斷單鏈（單鏈內(nèi)切酶）?

chi位點：GCTGGTGG

目前發(fā)現(xiàn)的重組熱點

E.coli

含1000個.第18頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四e、RecBCD切割產(chǎn)生3’單鏈末端第19頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四

2、RecA蛋白

（1）

活性a、RecA有單、雙鏈DNA

結(jié)合活性b、RecA有NTPase活性（底物差異活性）與單鏈DNA結(jié)合時活性最大---依賴于DNAc、RecA有啟動一個分子的單鏈侵入到另一雙螺旋分子的能力，即聯(lián)會同源DNA

（但其靶DNA必須有缺口－－結(jié)合DNA）第20頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四第21頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四RecA入侵單鏈被置換連RecA引發(fā)鏈侵入模型第22頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四RecApromotestheassimilationofinvadingsinglestrandsintoduplexDNAsolongasoneofthereactingstrandshasafreeend.

RecA啟動的單鏈入侵第23頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四RecA引起的鏈交換和Holliday結(jié)構(gòu)的生成

第24頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四

（2）RecA蛋白催化雙鏈和單鏈DNA

的反應(yīng)階段a、聯(lián)會前階段（緩慢）

RecA與單鏈結(jié)合b、單鏈與雙螺旋的互補鏈迅速配對，形成雙鏈連接分子

Holliday（5‘侵入）c、從雙螺旋結(jié)構(gòu)中緩慢置換一條鏈產(chǎn)生一段長的異源雙鏈DNA

反應(yīng)結(jié)束時，RecA結(jié)合到雙鏈上?其中—單鏈同化有固定的方向入侵單鏈為5’－3‘雙鏈DNA的互補鏈?zhǔn)?’－5‘第25頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四第26頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四?RecBCD和

RecA的共同作用第27頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四

3、原核同源重組的其它蛋白

需要E.coli中三個基因ruvA,ruvB和ruvC的產(chǎn)物a、RuvA識別Holliday結(jié)構(gòu)的連接點b、RuvB為分枝遷移提供動力（ATPase10～20bp/s）c、RuvC核酸內(nèi)切酶---專一性識別Holliday結(jié)構(gòu)的連接點體外切段連接點以拆分重組體第28頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四?E.coli重組的各階段（損傷修復(fù)）損傷DNA復(fù)制產(chǎn)生缺口RecA鏈交換第二次鏈交換DNApol通過DNA合成填滿缺口RuvA,B分枝遷移RuvC切割Holliday連接點第29頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)位點專一性重組第30頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四一、位點專一性重組（

site-specificrecombination）1、概念：發(fā)生在專一序列而順序極少相同的DNA分子間的重組2、特征：?在特定的結(jié)合序列部位，有專一的酶催化斷裂重接

----產(chǎn)生精確的DNA重排?都具有整合作用的兩個基本特征a、典型的保守性重組---交換是相互的和保存原先的DNAb、發(fā)生在噬菌體和細(xì)菌DNA短同源序列的專一性核苷酸上Euk.中專一性抗體基因的構(gòu)建第31頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四二、λphage的整合與切除1、實現(xiàn)機制：均是通過---細(xì)菌DNA和λDNA上特定位點之間的重組2、特定位點-----附著位點（attachmentsiteatt）?E.coliattB

含BOB’三序列23bp?λphage

attP

含POP’三序列

240bp?核心序列“O”完全一致

（同源部分）

---位點特異性重組發(fā)生的地方?B,B’,P,P’---臂第32頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四3、整合過程?整合后的附著位點為

attL（BOP’）

attR（POB’）?整合位點---attB、attP

切除位點---attL、attR?整合過程需要λ整合酶

（integraseInt）（λ編碼）和寄主的整合宿主因子IHF

（integrationhostfactor）共同作用第33頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四溶源性細(xì)菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌體第34頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四第35頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四4、整合分子機制?核心序列O全長15bp，富含A-T?發(fā)生在O內(nèi)的重組交換位點相距

7bp?整合酶的結(jié)合位點：attP240bp、attB23bp(兩者的作用不同)?attP位點的負(fù)超螺旋為重組所必須---加強了Int和IHF的親和力

-----高劑量的蛋白維持單鏈重組所必需的結(jié)構(gòu)?Int結(jié)合

----核心序列的反向位點（切割位置）

----結(jié)合在att臂上（臂與核心區(qū)靠近）第36頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四?整合體及其作用整合體（intasome）---Int和IHF結(jié)合到attP時的復(fù)合物?整合體捕獲attB

說明-----

a、attB和attP的最初識別靠Int

識別兩序列的能力

b、兩序列的同源性在鏈交換時為重要因素第37頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四?Int蛋白能切斷DNA，并使它重新連接，近而使holliday結(jié)構(gòu)拆分?重組時attP和attB部位交叉斷裂，互補單鏈末端進行交叉雜交第38頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四5、整合與切除的控制（1）整合?CⅡ---促使阻遏蛋白CⅠ的產(chǎn)生

---與intgene

的PI結(jié)合，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生Int蛋白

---且PI位于xis基因內(nèi)，CⅡ與PI結(jié)合導(dǎo)致xisgene失活（2）切除?寄主SOS反應(yīng)時---RecA大量產(chǎn)生，促使阻遏蛋白CⅠ的水解

---把OL和OR從阻遏狀態(tài)釋放出來

---從PL轉(zhuǎn)錄使int和xis表達第39頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四四、依賴于同源重組的位點特異性的序列代換

-----酵母MAT序列的轉(zhuǎn)換1、酵母結(jié)合型的轉(zhuǎn)變---DNA序列的代換，而不是互換

---依賴于序列的同源性（被代換的序列命運是被降解調(diào)---突變試驗）第40頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四2、同源序列

匣子WXYZ1Z2totalHML723704747

239882501MAT723704747

239882501MATa723704642239882369HMRa704642239881585第41頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四3、轉(zhuǎn)換過程?內(nèi)切酶(HO)識別、切割--Y/Z1交界處---起始MAT序列的轉(zhuǎn)換

(雙鏈斷裂)

［HM匣子受Sir阻遏蛋白的保護］①第42頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四?Y區(qū)域被降解，直到Y(jié)α和Ya相同的部分或一直到X區(qū)域①②第43頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四?四個斷頭侵入供體匣子的同源部分并與其中互補鏈配對?以供體DNA為模板復(fù)制Y區(qū)域，holliday結(jié)構(gòu)形成③④第44頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四?Holliday結(jié)構(gòu)的拆分，產(chǎn)生新的MAT匣子和這次轉(zhuǎn)換中的供體匣子第45頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四4、特征---同源重組和位點特異性重組特征都具有?需要大范圍的同源序列?需要重組酶系（rad52基因產(chǎn)物、位點特異性的HO內(nèi)切酶）第46頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)細(xì)菌中的轉(zhuǎn)座成分第47頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四一、轉(zhuǎn)座成分概述1、轉(zhuǎn)座子(元)或轉(zhuǎn)座元件(transposonortransposableelement):

基因組上不必借助于同源序列就可以移動的DNA片段，它們可以直接從基因組的一個位點移到另一個位點（供體和受體）轉(zhuǎn)座（transposition）：轉(zhuǎn)座元的轉(zhuǎn)移過程（不十分確切）2、發(fā)現(xiàn)和發(fā)展?1914A.Emerson1936Marcus.M.Rhoabes

玉米果皮、糊粉層花斑突變

玉米籽粒糊粉層色素不穩(wěn)定遺傳機理

跳躍基因（jumpinggene）?1947冷泉港實驗室（美）BarbaraMcClintock第48頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四?基因轉(zhuǎn)座現(xiàn)象的再次發(fā)現(xiàn)與證實

在一個操縱子中，與操縱基因毗連的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生終止突變后，它除了影響該基因本身產(chǎn)物的翻譯外，還影響其后結(jié)構(gòu)基因多肽的翻譯，并且具有極性梯度的特征。

插入型極性突變的發(fā)現(xiàn)與機理Operon&PolarityMutation

極性突變的基本概念第49頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四A酶活性

OgeneZ基因終止突變位

點離O基因的距離

IpoZYA第50頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四a)不依賴供體序列與靶位點間序列的同源性b)轉(zhuǎn)座不是簡單的轉(zhuǎn)移，涉及轉(zhuǎn)座子的復(fù)制Hotspots(熱點)Regionalpreference(在3kb區(qū)域內(nèi)的隨機插入)d)某些轉(zhuǎn)座因子（Tn3）對同類轉(zhuǎn)座因子的插入具有排他性

（免疫性）e)靶序列在轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)會形成正向重復(fù)f)轉(zhuǎn)座因子的切除與轉(zhuǎn)座將產(chǎn)生復(fù)雜的遺傳學(xué)效應(yīng)3、轉(zhuǎn)座重組的特點c)轉(zhuǎn)座插入的靶位點并非完全隨機（插入專一型）第51頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四二、Prok.轉(zhuǎn)座子種類?兩種類型：簡單轉(zhuǎn)座子（simpletransposon）（插入序列insertionsequenceIS）復(fù)合轉(zhuǎn)座子（compositetransposon）?共同特征：a）兩端有20～40bp的IRb）具有編碼轉(zhuǎn)座酶（transposase）的基因1、插入序列?最簡單，是細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和某些噬菌體的正常組分?命名：IS＋編號（鑒定類型）長度700～2000bp第52頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四?特點：a）兩端IR為轉(zhuǎn)座酶的識別位點（突變）

b）插入靶位點后會出現(xiàn)靶位點的正向重復(fù)（3～9bp）第53頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四?IS可以正反方向插入到DNA（宿主、質(zhì)?；蚰承┦删w），常對插入位點后面的基因表達功能產(chǎn)生極性效應(yīng)第54頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四a)Tn/TnAfamily

l具有IR、轉(zhuǎn)座酶基因、調(diào)節(jié)基因（解離酶）、抗抗生素基因

l

Tn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpRStrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrRTmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)

2.5kb20kb

Tn3IRTnpAResTnpRAmpRIR38bp38bp轉(zhuǎn)座酶

regulatorβ-內(nèi)酰胺酶

2、復(fù)合轉(zhuǎn)座子?兩種類型第55頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四b）兩端重復(fù)序列為IS的復(fù)合轉(zhuǎn)座子

e.g.

IS插入到功能基因兩端，可能形成復(fù)合轉(zhuǎn)座因子ISISISISLISR臂中心區(qū)臂transposition第56頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四?當(dāng)兩個IS組件相同時，其中任一個都可行使轉(zhuǎn)座功能?不同時，主要依靠一個?兩側(cè)的IS既可以是IR，又可以是DR狀態(tài)（IR多）第57頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四3轉(zhuǎn)座噬菌體Muphage

（巨型轉(zhuǎn)座子）

C

repressorforA,BB33kd與轉(zhuǎn)座有關(guān)A70kd轉(zhuǎn)座酶U,S

毒性蛋白attL,attR

與寄主同源，反向重復(fù)，轉(zhuǎn)座必需GinG區(qū)倒位酶attLCABSUattR150bp1.5kb

G倒位區(qū)38kbPgin?以E.coli為寄主的溫和型噬菌體（溶源、裂解）第58頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四?Mu的插入途徑a）侵入的Mu在溶源化過程中任意插入寄主DNA

（兩側(cè)各5bp的靶位點序列重復(fù)）b）進入裂解生長后，復(fù)制產(chǎn)生后代MuDNA幾乎全部插入寄主

DNA中，并可繼續(xù)轉(zhuǎn)座（形成寄主DNA和Mu的共合體），噬菌體成熟時，切段共合體包裝第59頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四三、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)作機制及模式?三種類型：復(fù)制型、非復(fù)制型和保守型1、復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式?實質(zhì)：轉(zhuǎn)座子元件被復(fù)制并被移動到受體位點，最終轉(zhuǎn)座過程擴增了轉(zhuǎn)座子的拷貝（供、受點）?需兩種酶：轉(zhuǎn)作酶（作用于原拷貝兩末端）解離酶（作用于復(fù)制后的拷貝）?模式：第60頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四?兩大步a)共合體形成切口－連接－復(fù)制第61頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四b)拆分

靶位點的DR形成第62頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四第63頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四2、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式?供體上最終產(chǎn)生雙鏈斷裂?供體位點如不能被修復(fù)則有致死效應(yīng)第64頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四3、保守型轉(zhuǎn)座模式?另一種非復(fù)制型?與λ整合機制相似其轉(zhuǎn)座酶與λ整合酶家族有關(guān)第65頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四4、TnA轉(zhuǎn)座模式?復(fù)制型轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座酶(tnpA)、解離酶(tnpR)?解離酶需要特異的內(nèi)部位點雙重功能：解離功能

tnpA及自身的阻遏物