大腸桿菌基因組DNA的提取及熒光定量PCR試驗設(shè)計

與蛋白酶K得溶液中消化分解蛋白質(zhì),再用酚與氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì),得到得DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。價鍵受到破壞,失去二級結(jié)構(gòu),從而變形失活,蛋白酶K或鏈霉蛋白酶E均為光譜蛋白酶,其重要特性就是能在SDS與EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)存在得情況下氨基酸,使DNA分子完整地分離出來、用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白質(zhì),最后用無水乙醇沉淀DNA。為獲得高純度DNA,操作過程中常加入RNaseA除去RN形成復合物,在高鹽溶液中(0。7mol／LNaCl)就是可溶得,當降低溶液鹽濃度molLNaCl過離心就可將CTAB-核蛋白,多糖物質(zhì)分開。最后通過乙醇或異丙醇沉淀DNA,而CTAB1)實驗材料:大腸桿菌1)LB液體培養(yǎng)基:細菌培養(yǎng)用膠化蛋白胨10g/L,細菌培養(yǎng)用酵母提取物5(攪拌溶解后,用5mol/LNaOH調(diào)pH至7、0.用去離子水定容100ml,用20/2)TE緩沖液:1Mtris-HClpH8、0溶液(取1MTris溶液160ml用分析純鹽酸調(diào)至Ph=8.0(需濃鹽酸約8。5ml),加ddH2O定容至200ml,高壓滅菌備用)TE緩沖液(10mMTris-HCl1MmEDTApH=8。0,1MTris—HClB0、5MEDTAPH=8。01ml向燒杯中加入約400mlddH2O均勻混合;將溶液定容到500ml后,高溫高壓滅菌,室溫保存)3)蛋白酶K:(20mg蛋白酶K溶于1ml無菌雙蒸水,－20℃?zhèn)溆?4)CTAB/NaCl溶液:(5％w/v,5gCTAB溶于100ml0、5MNaCl溶液中,需加行二級培養(yǎng),培養(yǎng)至對數(shù)期(4—6h)。2、取菌液1。5ml置于離心管中,以5000rpm冷凍離心1min,棄上清液4、加入1ul蛋白酶K(20mg／ml),混勻,37℃保溫1小時、5、加30ul5mol/LNaCl,混勻。6、加30ulCTAB/NaCl溶液,混勻,65℃保溫20min8、取上清液,加入300ul氯仿/異戊醇(24:1)抽提,5000rmp離心10minDNA,5000rmp離心10min10、加500ul70％乙醇洗沉淀,5000rmp離心10min二、試劑盒法提取大腸桿菌基因組DNA。細菌基因組DNA提取試劑盒:1、TGuide細菌基因組DNA提取試劑盒DP302-0250次420元2、TaKaRa細菌基因組DNA小量純化試劑盒TaKaRaDV810A50650元3、Biomiga細菌基因組DNA提取試劑盒GD2411－01BacterialgDNAkit50次423元GD2411—02BacterialgDNAkit250次1798元4、Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒BSC12M1100次750元5、OMEGA細菌基因組DNA提取試劑盒DEZNA。TMBacterialDNAkit2003350元定量實驗就是一種實時實驗,用于在聚合酶鏈反應(PCR)得每個擴增循環(huán)期間測定靶核苷酸序列(靶)數(shù)量、其中靶可以就是DNA、cDNA或RNA。【實驗原理】在實時定量實驗中,反應就是在PCR產(chǎn)物得擴增達到固定熒光水平時得循環(huán)期間時間點來描述得,而不就是在固定循環(huán)次數(shù)后累積得PCR產(chǎn)物最終數(shù)量來描述。擴增曲線以圖形形式顯示在執(zhí)行得循環(huán)次數(shù)中檢測到得熒光。?在PCR得最初幾次循環(huán)中,熒光信號沒有明顯變化。該預定義得PCR循環(huán)范圍稱度(與基線循環(huán)相對應得Rn值)得數(shù)學趨勢,生成一個基線簡化擴增曲線。然后,算法將搜索擴增曲線上基線校準后歸一化報告熒光信號強度(deltaRn[?Rn]值)與閾值交叉得點。?Rn值與閾值交叉得分數(shù)循環(huán)定義為CT。1、定義實驗屬性后選擇要設(shè)計得實驗類型。1)ExperimentName(實驗名稱)、2)Barcode(條碼),然后輸入您得PCR反應板上得條碼。(可不填)3)UserName(用戶名)。選擇Quantitation(定量)實驗類型2、定義方法與材料在Methods＆Materials(方法與材料)屏幕上,選擇用于實驗得將StandardCurve(標準曲線)選為定量方法。標準曲線實驗確定樣板對照(NTC)”。陰性對照應不會擴增。2)為試劑選擇TaqMan?Reagents(TaqMan試劑)(包括兩個引物一–如果使用TaqMan試劑以檢測擴增并定量樣本中靶得數(shù)量,則選擇在擴增靶時產(chǎn)生熒光信號。切記！AppliedBiosystems不建議將TAMRATM染料隨–如果使用SYBRGreen試劑以檢測擴增并定量樣本中靶得數(shù)量,則選SYBRGreenReagentsSYBRGreenSYBRGreen試劑包括兩可在結(jié)合到雙鏈DNA時產(chǎn)生熒光信號。SYBRGreen染料通常就是添加到反應得e將Standard(標準)選為升降溫速度。AppliedBiosystems不提供SYBRGreen試劑得Fast母液。3)為升降溫速度選擇Standard(~2hourstopletearun)–如果為PCR反應使用Fast試劑,則選擇Fast(~40Minutesto?CompleteaRun)(快速(約40分鐘完成運行))、試劑),則選擇Standard(~2HourstopleteaRun)(標準(約2小時4)為模板類型選擇gDNA(genomicDNA)(gDNA(基因組DNA))。5)Next>(下一步)。在Targets(靶)屏幕上,輸入您想在PCR反應板中定量得靶數(shù)量,然后1)單擊Howmanytargetsdoyouwanttoquantifyinther將以您輸入得數(shù)字更新。s建議反應板中得每個靶檢測設(shè)置一條標準曲線、注意:SetUpStandards(設(shè)置標準品)復選框默認情況下已選取。–如果要將FAMTM染料加在您用于檢測靶得TaqMan探針得5′端,則–如果要將JOETM染料加在您用于檢測靶得TaqMan探針得5′端,–如果要將VIC?染料加在您用于檢測靶得TaqMan探針得5′端,則選擇VIC、–如果您正使用SYBR?Green染料以檢測雙鏈DNA,則選擇SYBR。c.從Quencher(淬火基團)下拉菜單中,選擇NFQ-MGB(默認)。探針得3′端,則選擇NFQ－MGB。–如果您正使用SYBRGreen染料,則選擇None(無)。在Standards(標準品)屏幕上,為所有標準曲線輸入反應板中得點數(shù)與1)單擊Howmanypointsdoyouneedforeachstandard建議每條標準曲線應至少有五個稀釋點。Howmanyreplicatesdoyouneedforeachpoint？(每a。單擊EnterStartingQuantity(輸入起始量)字段,然后輸入應仔細為您得檢測考慮標準品數(shù)量得適當范圍:個對數(shù)級之間。如果您為標準品指定大范圍得數(shù)量,您需使用PCR產(chǎn)物或高度濃縮得模板,如cDNA克隆。–如果您得cDNA模板數(shù)量有限且/或靶就是低拷貝數(shù)轉(zhuǎn)錄物,或已知在給定范圍之內(nèi),則可能需要小范圍得標準品數(shù)量。5)Next＞(下一步)。設(shè)置。rgetassay?(每個靶檢測您需要多少陰性對照?),然后輸入3、opb、保留Color(顏色)字段中得默認設(shè)置。mepopns–選擇AllSample/TargetReactions(所有樣本/靶反應)以檢測所–選擇SpecifySample/TargetReactions(指定樣本/靶反應)以指7)在WellCount(反應孔數(shù))窗格中,確認存在:8)在ViewPlateLayout(查瞧檢測板布局)選項卡上:a。從ArrangePlateby(反應板布局方式)下拉菜單中,選擇Rowsb。從PlaceNegativeControls(放置陰性對照)下拉菜單中,選擇UpperLef(t左上角)(默認)、9)Next〉(下一步)、在RunMethod(運行方法)屏幕上,查瞧默認運行方法得反應體積與溫d2)單擊ReactionVolumePerWell(每個反應孔得反應體積)字段,然后輸入25μL。。如果實驗需要一個不同得溫度變化過程設(shè)置,調(diào)整溫度變化過程設(shè)置或用?RunMethod(運行方法)庫中得某個溫度變化過程設(shè)置進行替換。RunMethod(運行方法)庫包括在StepOne軟件中。在ReactionSetup(反應設(shè)置)屏幕上,選擇檢測類型(如果使用TaqMan試劑),然后查瞧為準備PCR反應、標準稀釋序列與樣本稀釋而計。完成ReactionMixCalculations(反應預混液計算)選項卡1)選擇ReactionMixCalculations(反應預混液計算)選項卡(默認)。2)從SelectTarget(選擇靶)窗格中,選擇RNaseP。3)從AssayType(檢測類型)下拉菜單中,選擇Inventoried/MadetoOrder(庫存/定制)。ppliedBiosystemsTaqManGeneExpressionA如果正使用PrimerExpress?軟件設(shè)計檢測,則選擇Custom0μL之間得反應體積。包括額外反應體積以彌補移液過程中得損失。建議至少準備10％得額a、確認MasterMixConcentration(母液濃度)字段中顯示2、0X。b、確認AssayMixConcentration(檢測預混液濃度)字段中顯1)選擇SampleDilutionCalculations(樣本稀釋計算)選項卡、2)單擊DilutedSampleConcentration(10XforReactionMix)4)查瞧為樣本稀釋計算得劑量。msStore(AppliedBiosystems產(chǎn)品倉庫)、neNameRNaseP單擊FindAssay(查找檢測套件)、aDisplayAllItems,然后配合以下TaqMan?母液使用:TaqMan?FastUniversalPCRMasterMix(2?),NoAmpErase?TaqMan?2?UniversalPCRMasterMix,200次反應,編號TaqMan?2?UniversalPCRMasterMix,NoAmpErase?TaqMan?2?UniversalPCRMasterMix,NoAmpErase?UNG,2000次反應,編號10包裝TaqMan?2?UniversalPCRMasterMix,NoAm4)靶DNA或cDNA有幾種TaqMan與SYBRGreen試劑可用于定量實驗、TaqMan?2?UniversalPCRMasterMix,200次反應,編號10包裝TaqMan?2?UniversalPCRMasterMix,編號TaqMan?2?UniversalPCRMasterMix,No,AmpErase?UNG,200次反應,編號seUNG編號TaqMan?PCRCoreReagentsKit,200次反應,編號N808-0228b。SYBR?Green試劑PowerSYBR?GreenPCRMasterMix(1mL),40次反應,編號PowerSYBR?GreenPCRMasterMix(5－mL),200次反應,編號PowerSYBR?GreenPCRMasterMix(10×5-mL),2000次反應,PowerSYBR?GreenPCRMasterMix(50mL),2000次反應,編號LSYBR?GreenPCRMasterMix(5—mL),200次反應,編號SYBR?GreenPCRMasterMix(50—mL),2000次反應,編號SYBR?GreenPCRCoreReagents,200次反應,編號9、完成設(shè)計向?qū)б瓿蒁esignWizard(設(shè)計向?qū)?工作流程,查瞧反應板布局,然后1)在ReviewPlateforExperiment(查瞧實驗得反應板)窗口中,查2)單擊SaveExperiment(保存實驗)。Save(保存)以接受默Home頁)屏幕。在將樣本添加到最終反應預混液之前執(zhí)行樣本稀釋。采用StepOneTM軟件計算得劑量稀釋樣本。(樣本稀釋計算)根據(jù)儲液中得樣品濃度？ng/μL,Stepone軟件計算出稀釋劑量、因為在L計算”表稀釋樣本。微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、試管振蕩器、離心機lation2等算)根據(jù)儲液中得標準品濃度？copies／μL,Stepone軟件計算出劑量。用于稀釋標準品得稀釋液(TE緩沖液或水)、標準品儲液微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、試管振蕩器、離心機9)將標準品置于冰上,直到準備好反應板。若實驗包括一個以上得靶檢測,則為每個靶檢測單獨準備反應預混液頭、離心機2)為反應預混液標記一個適當大小得反應管:ReactionMix、3)將所需劑量得每種組分添加到反應管中:母液(2、0X)12.5μL、檢測母注意:將檢測母液置于冰柜中避光儲存,直到準備使用。過多暴露在光線下量。建議至少準備10％得超額量。反應管蓋。5)短暫地離心反應管以除去氣泡。注意:使用之前,請執(zhí)行以下操作:,MicroAmpTMFastOptical48－WellReactionPlateMicroAmpTMOptical48-WellAdhesiveFilm(μL)x1水量(μL)3)對于每個重復組,準備標準品反應預混液:反應反應標準品反應預混液反應預混液標準品標準品劑管反應預劑量(μL)量(μL)1Std1Reactionm74、6Std18、3tdx3Std3Reactionmix74、6Std38、34Std4Reactionmi74、6Std48、3xPoPop28、34)對于每個重復組,準備未知樣本得反應預混液:劑量(μL)管Reactionmix(μL)反應74、6b。5)用孔板高透光度蓋膜密封反應板。線實驗時:?；颞C使用AdvancedSetup(高級設(shè)置)工作流程更改軟件中得反應板布局、llReactionPlate裝載到StepOneTM擴增儀以準備運行、a、打開擴增儀抽屜b。將反應載體放置在樣本加熱塊中、反應板得方向取決于您所用耗材得類.若使用一個反應板,讓A1反應孔位于樣本加熱塊得左后角、2、啟動運行)2)單擊STARTRUN(啟動運行)。運行期間,定期查瞧StepOne軟件提供得所有三條曲線就是否存在潛a。停止運行在StepOne軟件中,單擊STOPRUN(停止運行)。對話框中包括:–StopImmediately(立即停止)以立即停止運行。–StopafterCurrentCycle/Hold(當前循環(huán)/保持階段后停止)以在–Cancel(取消)以繼續(xù)運行。t板布局)選項卡中所選反應孔得數(shù)據(jù)。擴增曲線將對照歸一化染料熒光(?Rn)AmplificationPlot(擴增曲線)屏幕對識別與檢查異常擴增十分有用。異常擴增可能包括以下情況:強。?預期循環(huán)中不存在可檢測熒光(在相同情況下使用相同試劑從先前類似運行期間,TemperaturePlot(溫度曲線)屏幕上實時顯示樣本加熱塊、受熱護蓋門與樣本(已計算)得溫度。t兩條曲線存在顯著偏差可能表示存在問題、?HeatedCover(受熱護蓋門)曲線應保持方法中指定得常溫。偏離一d、在RunMethod(運行方法)屏幕上查瞧運行進度StepOneRunMethod(運行方法)屏幕上顯得溫度變化過程報告運行進度。更改運行方法(添加循環(huán)、保持或解鏈曲線)?在導航窗格中,單擊RunMethod(運行方法)。?在RunMethod(運行方法)屏幕上,執(zhí)行以下任意操作–若您想要將解鏈曲線階段添加到運行得末尾,則選擇?AddMeltCurveStagetoEnd(將解鏈曲線階段添加到末尾)、?單擊SendtoInstrument(發(fā)送到擴增儀)One當StepOne擴增儀顯示RunHistory(運行歷史)屏幕時,從St1)當StepOne擴增儀觸摸屏上顯示RunReport(運行報告)屏幕時StepOneTM軟件使用標準曲線定量方法分析實驗數(shù)據(jù)。1、實驗數(shù)據(jù)nts文件夾找到創(chuàng)建得試驗設(shè)計打開實驗數(shù)據(jù)文件單擊Analyze(分析)a.ExperimentMenu(實驗菜單)窗格－提供到以下軟件屏幕得鏈接:?Setup(設(shè)置)屏幕–AmplificationPlot(擴增曲線)–StandardCurve(標準曲線)–RawDataPlot(原始數(shù)據(jù)曲線)QCSummary(QC摘要)MultiplePlotsView(多曲線視圖)cView局或反應孔表要在分析屏幕上顯示特定反應孔,在ViewPlateLayout(查瞧反應,操作如下:a、要選擇某特定類型得反應孔,使用SelectWellsWith(選擇反應孔類型)下拉菜單:選擇Sample(樣本)、Target(靶)或Task(任c、要選擇多個反應孔,按住CTRL鍵并單擊、或按住Shift鍵并單擊反應板布局中得某反應孔并拖移鼠標覆蓋所需得反應孔。d。要選擇所有48個反應孔,單擊反應板布局得左上角。3)如何顯示多條曲線MultiplePlotsView(多曲線視圖)。b、要顯示四條曲線,單擊∷Showplotsina2×2matrix(以示曲線)。c.要在兩行中顯示兩條曲線,單擊∶Showplotsintworows(以2、查瞧標準曲線StandardCurve(標準曲線)屏幕顯示指定為標準品得樣本得標準曲線、StepOne軟件根據(jù)標準曲線計算未知靶得數(shù)量。在StandardCurve(標準曲線)屏幕上檢查以下回歸系數(shù)值:斜率/擴增效率值-擴增效率通過使用標準曲線中回歸線得斜率來計算。R–標準品數(shù)量范圍,為了獲得更準確及更精確得效率測量值,使用大范圍得–標準品重復數(shù),為了獲得更準確得效率測量值,包括重復數(shù)以降低移液R2值表示標準曲線回歸線與標準反應得單個C數(shù)據(jù)點之間得擬合程T?CT值應中靶得數(shù)?量太少;對于C值〉35得情況,期望更高得標準偏差。T1)從ExperimentMenu(實驗菜單)窗格中,選擇Analysis(分析)?StandardCurve(標準曲線)。注意:如果StandardCurve(標準曲線)屏幕中未顯示數(shù)據(jù),單擊Analyze(分析)。2)在ViewPlateLayout(查瞧反應板布局)選項卡上單擊反應板布StandardCurve上顯示全部48個反應孔、3)從Target(靶)下拉菜單中,選擇All(全部)。otlegend可接受范圍之內(nèi):示例實驗中,所有樣本(藍點)均在選擇:Rn循環(huán)變化－?Rn就是PCR運行生成得歸一化熒光信號得T?Rn隨循環(huán)變化－Rn就是歸一化報告熒光染料。此曲線將Rn作為數(shù)。此曲線將閾值循環(huán)(CT)作為反應孔位置得函數(shù)顯示。您可使用此曲線查②可在Ampli