霍亂弧菌檢測課件

寧波市疾控中心微生物檢驗所楊元斌May6th,2014霍亂弧菌的檢測霍亂弧菌檢測(2)學(xué)習(xí)要點：霍亂弧菌概述與分類霍亂弧菌的標(biāo)本采集霍亂弧菌的分離培養(yǎng)霍亂弧菌的鑒定霍亂弧菌檢測(2)霍亂弧菌（V.cholera）是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次（7次）大流行。典型臨床表現(xiàn)：劇烈的嘔吐、腹瀉（無痛性）

、米泔水樣便、脫水，死亡率甚高。屬于國際檢疫的烈性傳染病。一、概述霍亂弧菌檢測(2)大便≈小便霍亂弧菌檢測(2)病原學(xué)形態(tài)：霍亂弧菌屬于弧菌科弧菌屬，革蘭染色陰性菌體短小，稍彎曲，兩端鈍圓，長1.5～2.0μm,寬0.3～0.4μm。菌體尾端有單鞭毛，運動極為活潑，在暗視野顯微鏡下呈流星樣運動，培養(yǎng)溫度以37℃為最適宜，在堿性（PH8.8～9.0）肉湯（或蛋白胨）培養(yǎng)基上易于生長（耐堿怕酸）

霍亂弧菌檢測(2)革蘭染色鞭毛染色霍亂弧菌涂片、染色霍亂弧菌檢測(2)根據(jù)O抗原的特異性，可將霍亂弧菌分成200個血清群。根據(jù)是否與O1抗血清凝集分兩大群，

O1群霍亂弧菌：凡能與O1群抗血清發(fā)生凝集非O1群霍亂弧菌：凡不被O1群抗血清凝集的。分群與分型霍亂弧菌檢測(2)霍亂弧菌檢測(2)1、古典生物型（前6次大流行）2、E1Tor生物型（第7次1961年來）。兩個生物型具有相同的血清型。我國流行以ElTor霍亂弧菌為主。O1群霍亂弧菌的生物型霍亂弧菌檢測(2)古典生物型與El-Tor生物型區(qū)別特征古典生物型El-Tor生物型羊紅細(xì)胞溶血-D雞紅細(xì)胞凝集-+V-P試驗-+多粘菌素B敏感試驗+-IV組噬菌體裂解+-V組噬菌體裂解-+霍亂弧菌檢測(2)

O1群霍亂弧菌的血清分型及抗原成份型別別名O抗原成份原型稻葉型（Inaba）A、C異型小川型（Ogawa）A、B（少量C）中間型彥島型（Hikojima）A、B、C霍亂弧菌檢測(2)O139群霍亂弧菌1992年，在印度印度馬德拉斯、泰米爾納德發(fā)生的霍亂疫情，分離到的菌株不與O1群霍亂血清凝集，但是引起O1群霍亂的典型癥狀。引起WHO重視，定為O139群霍亂弧菌，被認(rèn)為下一次霍亂大流行主角。非O1群霍亂弧菌（O139霍亂）霍亂弧菌檢測(2)生化特征與O1菌基本相同。含有與O1群霍亂弧菌相同毒力基因除O抗原不同外，其它性狀均與EL-Tor生物型相似。毒力蛋白及其調(diào)控因子與El-Tor霍亂具有高度同源的編碼。O139霍亂弧菌菌可以產(chǎn)生莢膜與O1群霍亂無交叉免疫力環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)耐藥性強(qiáng)O139群霍亂弧菌的生物學(xué)特征霍亂弧菌檢測(2)二、標(biāo)本的采集與送檢概述：標(biāo)本采集：

病例：糞便、肛拭子、嘔吐物未使用抗生素之前“健康”人：糞便、肛拭子其他傳播環(huán)節(jié)的標(biāo)本：食物、水、環(huán)境類樣品……

監(jiān)測：水樣，水產(chǎn)品等標(biāo)本運送：一般要求在6小時內(nèi)室溫（20-25℃）條件下送達(dá)實驗室檢測，

C-B運輸培養(yǎng)基（pH8.4）;（或文臘二氏保存液）

堿性蛋白胨水（pH8.4-9.2）

：培養(yǎng)基質(zhì)量的保證：堿性胨水要澄清透明（表明未長細(xì)菌）、8-10ml量要足。不符合規(guī)定，立即通知相關(guān)實驗室或CDC更換。便量合適：不要太少，不能太多（改變培養(yǎng)基的pH）。送檢及時：6h內(nèi)送檢。霍亂弧菌檢測(2)1、糞便標(biāo)本（1）采樣逢疑必采應(yīng)在發(fā)病早期，服用抗菌藥物之前完成，并盡快送到檢驗室。糞便標(biāo)本采集方法如下：用棉拭子采取自然排出的新鮮大便，也可用直腸棉拭或采便管由肛門插入直腸內(nèi)3cm-5cm處采取，水樣便采取1ml-3ml，成型便采取指甲蓋大小的糞便量。病人的嘔吐物，沾染糞便的衣服和用具，也可作為檢材?；魜y弧菌檢測(2)注意！因腹瀉病因復(fù)雜，霍亂輕型病例的癥狀與體征很不明顯，不易與其他病因引起的腹瀉相區(qū)別。因此，霍亂流行季節(jié)，逢瀉必采是必須遵守的原則霍亂弧菌檢測(2)（2）送檢劇烈腹瀉病人的水樣便含有大量病菌，直接分離培養(yǎng)不難檢出陽性。條件允許的醫(yī)院，通知實驗室人員直接水樣便接種四號平板培養(yǎng)。縮短檢測時間。不能立即檢查的，要接種于培養(yǎng)基內(nèi)，盡快送往檢驗室。送檢標(biāo)本可放入（PH8.6-9.0）堿性蛋白胨水（不是最佳的，尤其6小時內(nèi)還不能進(jìn)行培養(yǎng)時，盡量采用C-B運輸培養(yǎng)基。），也可放入文—臘二氏保存液或插入Cary-Blair二氏半固體保存培養(yǎng)基中?；魜y弧菌檢測(2)水體的采樣一般要求用滅菌的500ml水樣瓶采集相對靜止的表層水（水面30cm以內(nèi)）450ml，加蓋密封后快速送檢。取水點的選擇應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查等資料確定，同時，采樣時應(yīng)選擇在水流平穩(wěn)或靜止處吸取。非疫情狀態(tài)下的監(jiān)測采樣時間一般在清晨時，此時水體未受人群活動等因素影響。2、水樣標(biāo)本霍亂弧菌檢測(2)水生動物的采樣通常選取活的或新鮮的水生動物為采集對象，有時也應(yīng)考慮冰凍的水生動物，以無菌操作采集合適的部位，如鰓部和/或腸內(nèi)容物等，置采樣瓶（管）或食品采樣袋密封，在常溫下送檢。有條件的采樣點可將水生動物整體采回實驗室再進(jìn)行相關(guān)處置。同時，要求以無菌棉簽涂抹五只（條）以上的某類水生動物體表、鰓及/或肛門，置堿性蛋白胨水送檢，每管堿性蛋白胨水作一份樣品看待。3、生物標(biāo)本霍亂弧菌檢測(2)增菌：堿性蛋白胨水（pH8.6）作為增菌液；分離：強(qiáng)選擇性分離培養(yǎng)基（慶大霉素培養(yǎng)基或TCBS培養(yǎng)基或4號培養(yǎng)基）分離；弱選擇性培養(yǎng)基使用堿性瓊脂或堿性膽鹽瓊脂。應(yīng)注意不同廠商以及不同批號培養(yǎng)基的質(zhì)量，每批培養(yǎng)基在使用前必須進(jìn)行質(zhì)量檢測。三、霍亂弧菌的培養(yǎng)分離霍亂弧菌檢測(2)

挑取糞便，直接接種于堿性蛋白胨水（第一管）中，同時劃線分離選擇性平板（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板，第一板）。

第一管堿性蛋白胨水在３７℃增菌６－８小時，沾取菌膜下表層液體，劃線分離選擇性平板（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板，第二板），同時吸取0.1～0.2ml表層培養(yǎng)物，接種堿性蛋白胨水（第二管）。

第二管堿性蛋白胨水增菌１８小時后劃線分離選擇性平板（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板，第三板）。分離培養(yǎng)要點（兩管三板法）：霍亂弧菌檢測(2)霍亂弧菌檢測(2)經(jīng)典的鑒定步驟要求每個平板應(yīng)挑取5個以上可疑菌落,轉(zhuǎn)種于克氏雙糖斜面或者普通瓊脂斜面待分純培養(yǎng)后,再進(jìn)行O1、O139群血清玻片凝集試驗，鑒于對霍亂疫情應(yīng)急處理的考慮,現(xiàn)大多數(shù)監(jiān)測實驗室一般采用將血清玻片凝集試驗前置的做法,作為快速篩查的手段,直接對平板上生長的單個可疑菌落進(jìn)行玻片凝集試驗,出現(xiàn)明顯凝集時可做初步報告,對平板上出現(xiàn)可疑凝集的菌株必須馬上轉(zhuǎn)種于克氏雙糖斜面或者普通瓊脂斜面,待純培養(yǎng)物生長良好后再次進(jìn)行玻片凝集試驗加以確證。

慶大霉素平板和4號瓊脂：多呈半透明狀，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并隨培養(yǎng)時間的延長而加深（由于這類培養(yǎng)基均含有亞碲酸鹽成份）。

TCBS（硫代硫酸鹽枸櫞酸鹽膽鹽瓊脂）：菌落生長呈黃色發(fā)亮、表面光滑、潤濕、稍凸起、邊緣整齊。（TCBS平板生長的菌落不能直挑取進(jìn)行玻片凝集試驗，需按經(jīng)典方法進(jìn)行純培養(yǎng)后再進(jìn)行玻片凝集試驗）

可疑菌落的挑取霍亂弧菌檢測(2)4號平板霍亂弧菌檢測(2)TCBS平板培養(yǎng)菌落形態(tài)（呈黃色）霍亂弧菌檢測(2)染色鏡檢革蘭染色陰性的短桿菌血清凝集試驗：

分別使用O1群，O139群霍亂血清進(jìn)行凝集試驗，同時使用生理鹽水進(jìn)行對照凝集，以排除與生理鹽水發(fā)生凝集的自凝菌。

生理鹽水不凝集，O1群血清明顯凝集的菌落，進(jìn)一步使用稻葉型和小川型血清進(jìn)行凝集試驗，判定型別：稻葉型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落為稻葉型，小川型血清凝集而稻葉型血清不凝集的菌落為小川型，如稻葉型血清和小川型血清均出現(xiàn)凝集的時候，要注意鑒別是否為彥島型，需進(jìn)行試管凝集試驗且兩者的凝集效價均超過一半以上才能判定為彥島型，因為某些小川型菌落自身會帶有少量的C抗原而出現(xiàn)與稻葉型血清發(fā)生弱凝集，因此如小川型血清凝集較稻葉型血清凝集有明顯優(yōu)勢時應(yīng)維持小川型的判定。

生理鹽水不凝集，O139群血清明顯凝集的菌落，一般為O139群，但其與O22群及O155群甚至一些非霍亂弧菌會出現(xiàn)交叉凝集，由上級實驗室進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。結(jié)合菌落特征和菌體形態(tài)，作出初步報告。必須注意同一樣品中O1、O139群霍亂弧菌可能同時存在，有必要對所有選出的菌株都進(jìn)行凝集試驗，以免遺漏。四、霍亂弧菌鑒定-玻片凝集霍亂弧菌檢測(2)霍亂弧菌的血清學(xué)鑒定要點9cm平板，1劃1，嚴(yán)禁1劃2。純培養(yǎng)做血清學(xué)鑒定。凝集，肉眼可見大顆粒。不要誤判。血清學(xué)凝集同時做鹽水凝集對照，自凝菌排除。血清學(xué)凝集覆蓋O1與O139?；魜y弧菌鑒定，以血清學(xué)為主，血清學(xué)凝集陽性即可初步報告。區(qū)別于腸桿菌科細(xì)菌（生化報告）?；魜y弧菌檢測(2)進(jìn)一步實驗氧化酶試驗1％鹽酸對氨基二甲基苯胺或鹽酸二甲基對苯二胺水溶液

粘絲試驗0.5％去氧膽酸鈉水溶液

霍亂弧菌檢測(2)進(jìn)一步實驗生化鑒定

生化鑒定管：發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣能分解色氨酸賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶（+）精氨酸雙水解酶（-）

霍亂弧菌生化鑒定管（11種生化,套裝，環(huán)凱）；

生化鑒定條：梅里埃API20E鑒定條等全自動生化檢測儀檢測：梅里埃VITEK2COMP全自動生化鑒定卡等進(jìn)一步分型鑒定(省CDC進(jìn)行)

噬菌體分型

PFGE脈沖場分型霍亂弧菌檢測(2)快速檢測試劑盒1熒光PCR

O1群、O1