免疫學診斷技術

免疫學診斷技術目錄醫(yī)療器械根底知識體外診斷試劑分類膠體金技術簡介酶聯(lián)免疫檢測技術簡介2020/11/32一醫(yī)療器械根底知識1、醫(yī)療器械監(jiān)視管理條例于1999年12月28日國務院第24次常務會議通過，2000年4月1日起施行。2、醫(yī)療器械：醫(yī)療器械是指單獨或者組適宜用于人體的儀器、設備、器具、材料或者其他物品，包括所需要的軟件；其用于人體體表及體內(nèi)的作用不是用藥理學、免疫學或者新陳代謝的搜段獲得，但是可能有這些手段參與并起一定的輔助作用；其使用旨在到達以下預期目的：〔1〕對疾病的預防、診斷、治療、監(jiān)護、緩解；〔2〕對損傷或者殘疾的診斷、治療、監(jiān)護、緩解、補償；〔3〕對解剖或者生理過程的研究、替代、調(diào)節(jié)；〔4〕妊娠控制。2020/11/331.1醫(yī)療器械分類醫(yī)療器械按照其醫(yī)療器械分類斷定的根據(jù)〔一〕醫(yī)療器械根據(jù)其構(gòu)造特征分為：有源器械和無源器械。〔二〕根據(jù)不同的預期目的，可將醫(yī)療器械歸入一定的使用形式。無源器械的使用形式有：醫(yī)用敷料；外科器械；重復使用外科器械；一次性無菌器械；植入器械；護理器械、體外診斷試劑、其他無源接觸或無源輔助器械等。有源器械的使用形式有：診斷監(jiān)護器械；輸送體液器械；實驗室儀器設備、醫(yī)療消毒設備；其他有源器械或有源輔助器械等。2020/11/34

〔三〕根據(jù)使用中對人體產(chǎn)生損傷的可能性、對醫(yī)療效果的影響，醫(yī)療器械使用狀況可分為接觸或進入人體器械和非接觸人體器械。2020/11/35

根據(jù)醫(yī)療器械的危險性：第一類是指，通過常規(guī)管理足以保證其平安性、有效性的醫(yī)療器械；第二類是指，對其平安性、有效性應當加以控制的醫(yī)療器械；第三類是指，用于支持、維持生命；對人體具有潛在危險，對其平安性、有效性必須嚴格控制的醫(yī)療器械。2020/11/361.2醫(yī)療器械消費企業(yè)應當符合以下條件：

具有與其消費的醫(yī)療器械相適應的專業(yè)技術人員；具有與其消費的醫(yī)療器械相適應的消費場地及環(huán)境；具有與其消費的醫(yī)療器械相適應的消費設備；具有對其消費的醫(yī)療器械產(chǎn)品進展質(zhì)量檢驗的機構(gòu)或者人員及檢驗設備。2020/11/371.3醫(yī)療器械經(jīng)營企業(yè)應當符合以下條件具有與其經(jīng)營的醫(yī)療器械相適應的經(jīng)營場地及環(huán)境；具有與其經(jīng)營的醫(yī)療器械相適應的質(zhì)量檢驗人員；具有與其經(jīng)營的醫(yī)療器械產(chǎn)品相適應的技術培訓、維修等售后效勞才能。2020/11/38

二體外診斷試劑

2.1定義體外診斷〔IVD，InVitroDiagnosis〕試劑，包括可單獨使用或與儀器、器具、設備或系統(tǒng)組合使用，在疾病的預防、診斷、治療監(jiān)測、預后觀察、安康狀態(tài)評價以及遺傳性疾病的預測過程中，在人體之外通過對人體的樣本〔如血液、體液、組織等〕進展檢測而獲取臨床診斷信息的產(chǎn)品和效勞，包括儀器、試劑、校準品、質(zhì)控品等。原理是通過試劑和體內(nèi)物質(zhì)在體外的反響強度或速度來判斷體內(nèi)物質(zhì)的性質(zhì)和數(shù)量，通過和標準品的比較來判斷人體的生理狀態(tài)。2020/11/391.臨床生化試劑：用化學方法使樣本產(chǎn)生變化，通過測吸光度，波長及顏色反響等進展疾病的診斷、治療和監(jiān)控；2.免疫診斷試劑：免疫生物學開展很快，利用抗原和抗體的特異性反響的原理進展疾病的診斷；2.2體外診斷試劑的分類2020/11/3103.分子診斷試劑：應用分子生物學方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的構(gòu)造或表達程度的變化而做出診斷的技術，稱為分子診斷。4.功能檢測試劑：如血凝試劑，看凝血狀態(tài)是否正常。5.其他：細胞染色切片，鏡像等2020/11/3112.3免疫學診斷試劑的類型1.按方法分為間接免疫學試劑和直接免疫學試劑〔如雙抗體夾心法，雙抗原夾心法，間接法，競爭法等〕；2.按示蹤劑分為放射免疫法，酶聯(lián)免疫法，熒光法，化學發(fā)光法，膠體金法，乳膠法等；2020/11/312

免疫層析膠體金技術是出現(xiàn)于20世紀80年代初期的一種獨特的免疫分析方式,該方法的核心技術是以條狀纖維層析材料為固相,通過毛細管作用使樣品溶液在層析材料上泳動,并同時使樣品中經(jīng)標記物標記的待測物與包被在層析材料上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生高特異、高親和性的免疫。三膠體金技術簡介2020/11/3131膠體金標記技術的相關定義1.1定義免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種免疫標記技術。膠體金標記膠體金標記，本質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒外表的包被過程。吸附機理一般認為是膠體金顆粒外表負電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附而形成結(jié)實結(jié)合。2020/11/314膠體金顆粒對蛋白質(zhì)有很強的吸附功能，而不被壞其生物活性，可以與蛋白質(zhì)等〔葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白〕等非共價結(jié)合，形成膠體金標記物。2020/11/315

1.2透射電鏡下觀察金顆粒的形狀劣質(zhì)金外形不均一，且非球形，有凝集現(xiàn)象，顆粒間變異系數(shù)較大2020/11/3162膠體金的制備量取200ml超純水，加熱至沸騰，并保持微沸。參加15ml1%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)煮沸5分鐘。參加1%的氯金酸5ml,繼續(xù)煮沸，待顏色有變化后計時，煮沸10min。停頓攪拌，冷卻至室溫。2020/11/3172.1膠體金粒徑的大小與復原劑的量有關系粒子大小不同，光吸收性不同，顏色亦不同。1％檸檬酸三鈉ml0.300.450.701.001.502.00

金溶膠顏色藍灰紫灰紫紅紅橙紅橙

吸收峰(nm)220240535525522518

徑粒(nm)14797.571.54024.5152020/11/318

3.制備高質(zhì)量膠體金的本卷須知

〔1〕玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預期大小的金顆粒。〔2〕試劑配制必須保持嚴格的純潔，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜〔0.45μm〕過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)?！?〕配制膠體金溶液的pH以中性〔pH7.2〕較好。〔4〕氯金酸的質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。2020/11/319

4膠體金技術的種類及特點4.1快速免疫金滲濾法主要由兩部分組成：膜滲濾裝置和標記結(jié)合物。前者為一塑料小盒，其中填滿吸水性物質(zhì)，面上緊貼放置一片吸附有抗體(以雙抗體夾心法測抗原為例)的硝酸纖維膜，標記結(jié)合物為免疫金。用微孔濾膜作載體，先將抗原或抗體點于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標記的抗體檢測相應的抗原或抗體。2020/11/320斑點金免疫滲濾2020/11/321

4.2免疫層析法

以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細血管作用，滴加在膜條一端的液體漸漸向另一端滲移，通過抗原抗體結(jié)合，并利用膠體金呈現(xiàn)顏色〔紅色〕反響，檢測抗原/抗體。2020/11/322襯板樣品墊金標墊吸收墊膜膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)成2020/11/323

雙抗體夾心法標本Goldtestcontrol2020/11/324競爭法標本標準抗原Goldtestcontrol2020/11/325

其檢測原理與上述的其它方法有所不同：膠體金顆粒標記單克隆抗體，而檢測線包被小分子抗原，質(zhì)控線包被抗鼠IgG。檢測時，樣本中的待檢抗原首先與金標抗體結(jié)合，上行到達檢測帶時，如待檢抗原把一定量的抗體完全飽和，則金標抗體將不能與檢測帶的抗原結(jié)合，不會出現(xiàn)肉眼可見的紅色條帶，為陽性結(jié)果。如標本中無待檢抗原，則金標抗體與檢測帶的抗原結(jié)合，形成紅色條帶，為陰性結(jié)果。選用該方法應特別注意膠體金顆粒的抗體吸附量及包被抗原量。2020/11/326間接法2020/11/327測定時將試紙條下端浸入液體標本中，下端吸水材料即汲取液體向上端挪動，流經(jīng)C處時使干片上的免疫金復合物復溶，并帶動其向膜條滲移。雙抗體夾心法為例2020/11/328假設標本中有待測特異抗原，即可與免疫金復合物中的抗體結(jié)合，此抗原抗體復合物流至測試區(qū)即被固相抗體捕獲，在膜上顯出紅色反響線條〔T〕。

2020/11/329過剩的免疫金復合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相抗小鼠IgG結(jié)合〔免疫金復合物中的單克隆抗體為小鼠IgG〕，而顯出紅色質(zhì)控線條〔R〕。

2020/11/330陰性標本則無反響線條，而僅顯示質(zhì)控線條。

2020/11/3314.2.1結(jié)果斷定圖示——卡型2020/11/3324.2.2結(jié)果斷定圖示——條型2020/11/3334.2.3結(jié)果斷定說明陽性結(jié)果：出現(xiàn)質(zhì)控線和反響線兩條紫紅色線，實驗結(jié)果為陽性。陰性結(jié)果：僅出現(xiàn)一條紫紅色質(zhì)控線，實驗結(jié)果為陰性。無效：不出現(xiàn)質(zhì)控線紅線或僅出現(xiàn)一條反響線紅線，實驗結(jié)果為無效結(jié)果，應重試。競爭法的結(jié)果斷定則相反2020/11/3345免疫膠體金技術的特點簡捷快速：操作簡單，一般只要5-10min就會出結(jié)果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR需要時間更長。結(jié)果易于斷定：陰、陽性呈色很明顯，肉眼很容易判斷。特異性好：因為該技術大多用單克隆抗體標記，這決定了它具有很好的特異性。2020/11/3356

膠體金技術的應用2020/11/336

7相關儀器

噴膜儀儀器參數(shù)

儀器尺寸為：430mmx410mmX360mm

平臺大小:450mmX70mm

平臺挪動速度:0-330mm/sec

X、Y、Z軸挪動誤差:<50um

定位精度:±10umin1axis;±25umin2axis

噴點方式

BJQ3000:非接觸噴點

AJQ3000:非接觸噴點

劃線寬度

BJQ3000:0.50mm/line〔噴點0.20mm/drop〕

AJQ3000:0.5-5mm

最小噴量

BJQ3000:10nl/drop

AJQ3000:1ul/cm

劃線精細度

BJQ3000:±1%

AJQ3000:±2%2020/11/337切條機儀器參數(shù):進料寬度：≤100mm進料長度：不限,可連續(xù)進料切割切割寬度：≥1mm,寬度連續(xù)可調(diào)切割寬度設定位數(shù)：0.01mm切割精度：±0.1mm切割速度：230次/分鐘,速度連續(xù)可調(diào)切條計數(shù)：單次工作和總工作分別計數(shù)刀片:日本進口,耐磨高碳鋼材料抗靜電裝置：建議選配電源：220VAC重量：20KG尺寸：430(L)×330(W)×260(H)mm2020/11/338它采用抗原與抗體的特異反響將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反響，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。

在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體〔免疫吸附劑〕②酶標記的抗原或抗體〔標記物〕③酶作用的底物〔顯色劑〕四酶聯(lián)免疫檢測〔ELISA)技術簡介1.ELISA的原理2020/11/339

測量時，抗原〔抗體〕先結(jié)合在固相載體上，但仍保存其免疫活性，然后加一種抗體〔抗原〕與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物〔標記物〕，此偶聯(lián)物仍保存其原免疫活性與酶活性，當偶聯(lián)物與固相載體上的抗原〔抗體〕反響結(jié)合后，再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化復原反響而呈顏色。2020/11/340

其所生成的顏色深淺與欲測的抗原〔抗體〕含量成正比。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計〔酶標儀〕加以測定。其方法簡單，特異性強。2020/11/3412

ELISA的類型2.1雙抗原夾心法測抗體用特異性抗原進展包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。2020/11/3422.2雙抗體夾心法測抗原反響原理和形式與雙抗原夾心法類似。用特異性抗體進展包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應的抗原。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗體代替酶標抗抗體。2020/11/3432.3間接法測抗體

間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體〔二抗〕以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。。2020/11/3442.4競爭法測抗原

小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進展測定，可以采用競爭法形式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。2020/11/3452.5捕獲法測IgM抗體2020/11/346

3ELISA的試劑制備及操作以雙抗體夾心法為例2020/11/347獲得待分析物的未標定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)參加封閉蛋白溶液以封閉載體外表殘留的蛋白結(jié)合位點洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標本〔抗原〕形成固相抗體－抗原復合物洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加酶標抗體生成抗體—待測抗原—酶標記抗體的復合物加底物進展酶催化反響根據(jù)顏色反響的程度進展該抗原的定性或定量測定2020/11/3484.特點4.1特異性

抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間?；瘜W構(gòu)造和空間構(gòu)型互補關系，具有高度的特異性。測定某一特定的物質(zhì)，而不需先別離待檢物。