免疫組化講課原理及方法

免疫組織化學技術的原理及方法北京友誼醫(yī)院病理科黃受方現在是1頁\一共有73頁\編輯于星期三免疫組織化學技術的原理及其方法一.基本知識二.基本原理三.方法四.結果的判斷及異常著色原因分析和對策現在是2頁\一共有73頁\編輯于星期三一、免疫組化技術的基本知識現在是3頁\一共有73頁\編輯于星期三一、免疫組化技術的基本知識免疫組化的基本概念

利用抗原-抗體特異性結合原理檢測抗原或抗體一般是用抗體檢測抗原抗原

兩個主要屬性：免疫原性及特異反應性，蛋白質具有抗原性抗體

與抗原能特異性結合—生物學結合是免疫球蛋白Ig現在是4頁\一共有73頁\編輯于星期三免疫球蛋白的化學結構及其模式圖

免疫球蛋白根據重鏈結構命名

IgG(γ),IgA(α)，IgD(δ),IgE(ε),IgM(μ)五種免疫球蛋白只有兩種類型的輕連，即：

Kappa(κ)和Lambda(λ)每個抗體分子的輕鏈必須相同；某一單獨的抗體分子決不可能既有κ鏈又有λ鏈。這一點在免疫組化的淋巴瘤診斷中十分重要。現在是5頁\一共有73頁\編輯于星期三免疫球蛋白的化學結構及其模式圖Fc(Fragmentcrystalline)

是免疫球蛋白的羧基端，意為結晶片段，因其純化時呈結晶狀態(tài)而名之，該片段與抗原特異性有關

Fab(Fragmentantigenbingding)該端是抗體與抗原特異性結合的部位，每分子Ig能結合2個抗原分子

Fc

Fab

Ag現在是6頁\一共有73頁\編輯于星期三多克隆抗體與單克隆抗體及其產生

多克隆抗體：多株B細胞針對多個抗原決定簇產生的抗體單克隆抗體：針對某一抗原決定簇，由單株淋巴細胞（克隆）所產生的抗體多克隆抗體單克隆抗體現在是7頁\一共有73頁\編輯于星期三多克隆抗體與單克隆抗體及其產生多克隆抗體的產生以純化的抗原免疫動物而獲得，實際上是針對多個抗原決定簇的多個抗體組成，檢測范圍廣。在病理診斷中，有利劃歸腫瘤的基本類型。常用的多克隆抗體一般在兔身上產生，國外產品目錄上常以RaH（RabbitagainstHuman）表之。多克隆抗體亦可產生于羊、豬、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗體的動物來源種類，對后繼抗體的選用至關重要?，F在是8頁\一共有73頁\編輯于星期三多克隆抗體與單克隆抗體及其產生

單克隆抗體的產生

應用細胞融合的雜交瘤技術（Hybridization），以針對單一抗原決定簇的小鼠與小鼠骨髓瘤細胞（腫瘤性B細胞）融合形成雜交瘤，其特點是既能產生特異性抗體，又能在體外無限地增殖。將瘤細胞在體外培養(yǎng)或注入小鼠腹腔內而獲單克隆抗體，由此產生的小鼠抗人（抗原）的抗體常以MaH表示，現在亦有兔的單克隆抗體現在是9頁\一共有73頁\編輯于星期三免疫小鼠Mouse現在是10頁\一共有73頁\編輯于星期三抗原的制備：傳統用蛋白提純近來可應用分子生物學技術：已知抗原的基因結構，用其合成多肽，作為抗原，如ER、PR抗原的制備現有兔的單抗現在是11頁\一共有73頁\編輯于星期三多克隆抗體和多克隆抗體的選用單克隆抗體的制備比多克隆抗體復雜，價格更貴；在應用中不一定比多克隆抗體好。單克隆抗體的特異性強，多克隆抗體則敏感性高，為何使用完全決定于使用的目的性現在是12頁\一共有73頁\編輯于星期三市售抗體的種類某些抗體既有多克隆抗體也有單克隆抗體，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗體，如α-胰蛋白酶有些抗體的抗原來自動物，利用動物與人抗原之間的共同抗原性使該種抗體能應用于人的檢測。如Desmin來源于雞的肌肉近年來,市售單克隆抗體除小鼠源性外，還有兔源性現在是13頁\一共有73頁\編輯于星期三標記抗體在抗體上用化學方法聯接某種標記物，目的是使抗原抗體的結合能用肉眼觀察到標記物種類：熒光素：異硫氰酸熒光素或羅丹明酶：辣根過氧化酶，鹼性磷酸酶金屬離子：膠體金顆粒標記的方法：化學性結合將降低抗體效價及標記物的活性，從而使染色敏感性降低現在是14頁\一共有73頁\編輯于星期三酶—抗酶抗體復合物通過免疫反應而不是化學方法，將酶結合到抗體上，形成具酶活性的免疫復合物。如PAP復合物（PeroxidaseAntiPeroxidaseComplex），PAP復合物屬非標記性，保護了酶的活性，比免疫熒光法敏感上千倍?，F在是15頁\一共有73頁\編輯于星期三親和素—生物素復合物

（Avidin-BiotinComplexABC）親和素有四個生物素分子特異性結合部位，其結合力強，不可逆，還可和辣根過氧化酶或熒光素等結合親和素-生物素復合物是一個三維空間的結構，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體聯接第一抗體，另一端通過生物素化酶與顯色系統相連接，產生多級放大，從而提高此生物反應的敏感性和特異性AB復合物多用于ABC法的免疫組化中現在是16頁\一共有73頁\編輯于星期三

酶標親和素（Labelledstreptavidin）在AB復合物中，酶是標記在生物素上，而后與親和素合成復合物。在標記的親和素-生物素方法中是將辣根過氧化酶直接標記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強的結合力，因此LSAB法比ABC法更敏感現在是17頁\一共有73頁\編輯于星期三多聚物載體一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKOEPOS及DAKOEnvision試劑核心是一種柔韌的多聚物，它能結合一抗和酶分子，起到載體的作用一步法多聚物載體試劑是多聚物結合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯結的由HRP標記的多聚物現在是18頁\一共有73頁\編輯于星期三一步法：EPOStissueantigen

dextranbackboneprimaryantibodyenzymemolecule

現在是19頁\一共有73頁\編輯于星期三二步法：EnVision現在是20頁\一共有73頁\編輯于星期三葡萄球菌蛋白A（StaphylococcalproteinA,SPA）現在是21頁\一共有73頁\編輯于星期三二、免疫過氧化物酶染色技術的基本原理現在是22頁\一共有73頁\編輯于星期三免疫過氧化酶染色技術的基本原理現在是23頁\一共有73頁\編輯于星期三識別系統特異性抗體識別組織或細胞中的靶抗原。特異性抗體具有識別并結合靶抗原的功能，這是本技術的理論依據所在特異性抗體品種繁多，應根據待檢測抗原的要求選用特異性抗體有的屬單抗，有的屬多抗，有的既有單抗又有多抗，可根據不同染色要求而選用識別系統的組成比較恒定，識別功能由特異的第一抗完成現在是24頁\一共有73頁\編輯于星期三顯示系統也是顯色系統?？贵w抗原的結合是肉眼看不見的，顯示系統的目的就是使這種看不見的反應變?yōu)榭吹靡?，從而確定抗原的存在及其定位顯色系統由酶、底物加上顯色劑組成，最終可在標記位點形成有色分子的終末產物，若顯色劑為DAB，則出現棕褐色細顆粒沉淀

E(酶)+S(底物)

E?S(酶底物復合物)

P(反應產物)

+E(酶)

循環(huán)使用現在是25頁\一共有73頁\編輯于星期三顯示系統辣根過氧化酶的免疫組化染色的反應過程:HRP+H2O2

HRP?H2O2

有色分子終末產物+HRP

DAB（電子供體）

HRP：酶

H2O2：底物

HRP?H2O2：酶?底物復合物

現在是26頁\一共有73頁\編輯于星期三免疫過氧化酶染色的多種方法中，其主要的不同點在于顯色系統的差異：間接酶標法：利用標記于橋聯抗體的酶PAP法：利用PAP復合物ABC法：利用AB復合物LSAB法:利用直接標記于親和素的酶EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物載體

其目的都是設法提高免疫組化染色的敏感性顯示系統現在是27頁\一共有73頁\編輯于星期三聯結系統聯結或橋聯抗體（一般為第二抗體）按免疫學要求將識別系統與顯色系統聯結成為統一體應采用何種聯結抗體決定于特異性第一抗體是多克隆還是單克?。喝粢豢故嵌嗫寺】贵w，則二抗是羊或其它動物的抗兔血清；若一抗是單克隆抗體，則二抗常是兔抗鼠的血清有的聯結抗體既能聯結多抗，亦能聯結單抗現在是28頁\一共有73頁\編輯于星期三三、免疫組化染色方法的類別現在是29頁\一共有73頁\編輯于星期三免疫組化染色方法的類別直接法間接法PAP法ABC法LSAB法一步法（EPOS）兩步法（Envision）現在是30頁\一共有73頁\編輯于星期三直接法將熒光、酶、金直接標記在一抗上進行顯色，沒有聯結系統、未用橋抗體。優(yōu)點：特異性高、非特異染色輕。缺點：敏感性低，要求抗體濃度高。每種一抗均需用酶來標記現在是31頁\一共有73頁\編輯于星期三現在是32頁\一共有73頁\編輯于星期三間接法將標記物標記在橋聯抗體上（即二抗、三抗）一抗往往是兔身上產生的多克隆抗體，其酶標抗體必須是針對兔優(yōu)點：敏感性高，只需少數幾種動物的二抗就可以和所有一抗相匹配缺點：特異性差現在是33頁\一共有73頁\編輯于星期三PrimaryAntibodySecondaryAntibodySubstrate-chromogenesolution現在是34頁\一共有73頁\編輯于星期三PAP法

（Peroxidase-AntiPeroxidase，過氧化酶-抗過氧化酶法）組成：一抗是針對靶抗原的特異性抗體二抗是聯結抗體，一面聯結一抗，另一面聯結PAP復合物三抗是以過氧化物酶為抗原，在與一抗同種動物身上誘發(fā)產生的抗體，并與辣根過氧化物酶形成復合物（PAP）現在是35頁\一共有73頁\編輯于星期三PAP法

（Peroxidase-AntiPeroxidase，過氧化酶-抗過氧化酶法）優(yōu)點：PAP復合物中含酶更多，且是一種非標記的免疫組化方法，敏感性更高PAP復合物常來自兩種不同的動物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗為單克隆抗體的染色，兔PAP多用于一抗為多克隆抗體的染色可用于福爾馬林固定的石蠟切片現在是36頁\一共有73頁\編輯于星期三PAPPrimaryAntibodySecondaryAntibodyPeroxidase-anti-PeroxidaseSubstrate-chromogenesolution現在是37頁\一共有73頁\編輯于星期三ABC法

（Avidin-BiotinComplex，親和素-生物素法）組成：一抗、生物素化的二抗、ABC復合物（親和素+酶標生物素）優(yōu)點：親和素和生物素有強大親和力，使其比直接和間接酶標法更敏感，也超過PAP法。能用于常規(guī)石蠟切片?，F在是38頁\一共有73頁\編輯于星期三親和素—生物素復合物

（Avidin-BiotinComplexABC）親和素有四個生物素分子特異性結合部位，其結合力強，不可逆，還可和辣根過氧化酶或熒光素等結合親和素-生物素復合物是一個三維空間的結構，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體聯接第一抗體，另一端通過生物素化酶與顯色系統相連接，產生多級放大，從而提高此生物反應的敏感性和特異性AB復合物多用于ABC法的免疫組化中現在是39頁\一共有73頁\編輯于星期三ABC法

（Avidin-BiotinComplex，親和素-生物素法）現在是40頁\一共有73頁\編輯于星期三一抗二抗ABCDABABC現在是41頁\一共有73頁\編輯于星期三ABC與PAP法的比較現在是42頁\一共有73頁\編輯于星期三LSAB（SP）法

（labelledstreptavidinbiotinmethod）標記的鏈霉親和素-生物素法特點：將HRP直接標記于鏈霉親和素上優(yōu)點：更快速：空間結構更小更敏感：鏈霉親和素的親和性更強，更易于到達深部位點非特異背景更少：鏈霉親和素空間結構特殊，不易與高荷電的組織成分（膠原纖維、結締組織）聯結現在是43頁\一共有73頁\編輯于星期三

酶標親和素（Labelledstreptavidin）在AB復合物中，酶是標記在生物素上，而后與親和素合成復合物。在標記的親和素-生物素方法中是將辣根過氧化酶直接標記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強的結合力，因此LSAB法比ABC法更敏感現在是44頁\一共有73頁\編輯于星期三SPPrimaryAntibodyBiotinylatedSecondaryAntibodyEnsyme-conjugatedStreptavidinSubstrate-chromogensolution現在是45頁\一共有73頁\編輯于星期三ABC與LSAB(SP)法的比較現在是46頁\一共有73頁\編輯于星期三一步法（EPOS）及兩步法（Envision）特點以多聚體為載體，聯結了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法）優(yōu)點操作簡便，省時提高了敏感性和特異性減少了背景著色避免內源性生物素的干擾現在是47頁\一共有73頁\編輯于星期三多聚物載體一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKOEPOS及DAKOEnvision試劑核心是一種柔韌的多聚物，它能結合一抗和酶分子，起到載體的作用一步法多聚物載體試劑是多聚物結合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯結的由HRP標記的多聚物現在是48頁\一共有73頁\編輯于星期三一步法：EPOStissueantigen

dextranbackboneprimaryantibodyenzymemolecule

現在是49頁\一共有73頁\編輯于星期三二步法：EnVision現在是50頁\一共有73頁\編輯于星期三一步法（EPOS）及兩步法（Envision）比較現在是51頁\一共有73頁\編輯于星期三Substrate-chromogensolutionEPOS一步法現在是52頁\一共有73頁\編輯于星期三PrimaryAntibodyPolymercomplexSubstrate-chromogensolutionEnVision二步法現在是53頁\一共有73頁\編輯于星期三四、免疫組化染色結果的判斷及異常著色的原因分析及其對策現在是54頁\一共有73頁\編輯于星期三特異性著色具備特點

特定的組織特定的定位特定的細胞特定的細胞內的部位分布上的不均一著色的不均一性著色強度的不均一顆粒性顯色：DAB顯色劑應為棕黃到棕褐色免疫組化染色結果的判斷現在是55頁\一共有73頁\編輯于星期三CK染色，結腸腺癌細胞膜特異性著色現在是56頁\一共有73頁\編輯于星期三Kappa胞漿著色現在是57頁\一共有73頁\編輯于星期三TdT染色，胞核著色現在是58頁\一共有73頁\編輯于星期三PR胞核著色現在是59頁\一共有73頁\編輯于星期三ER胞核著色現在是60頁\一共有73頁\編輯于星期三免疫組化染色結果的判斷對照的設置空白對照陽性對照吸收試驗對照替代對照自身對照現在是61頁\一共有73頁\編輯于星期三異常著色（假陽性）原因及對策異常著色原因內源酶及內源性生物素抗體本身原因切片制作不當沖洗不充分DAB顯色產生背景著色抗原的丟失抗原的遮蔽抗體試劑因素操作不當假陰性的原因現在是62頁\一共有73頁\編輯于星期三內源酶及內源生物素非特異性著色原因及對策滅活過氧化物酶-----