免疫組化講課原理及方法

免疫組織化學(xué)技術(shù)的原理及方法北京友誼醫(yī)院病理科黃受方現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三免疫組織化學(xué)技術(shù)的原理及其方法一.基本知識(shí)二.基本原理三.方法四.結(jié)果的判斷及異常著色原因分析和對(duì)策現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三一、免疫組化技術(shù)的基本知識(shí)現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三一、免疫組化技術(shù)的基本知識(shí)免疫組化的基本概念

利用抗原-抗體特異性結(jié)合原理檢測(cè)抗原或抗體一般是用抗體檢測(cè)抗原抗原

兩個(gè)主要屬性：免疫原性及特異反應(yīng)性，蛋白質(zhì)具有抗原性抗體

與抗原能特異性結(jié)合—生物學(xué)結(jié)合是免疫球蛋白Ig現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三免疫球蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其模式圖

免疫球蛋白根據(jù)重鏈結(jié)構(gòu)命名

IgG(γ),IgA(α)，IgD(δ),IgE(ε),IgM(μ)五種免疫球蛋白只有兩種類型的輕連，即：

Kappa(κ)和Lambda(λ)每個(gè)抗體分子的輕鏈必須相同；某一單獨(dú)的抗體分子決不可能既有κ鏈又有λ鏈。這一點(diǎn)在免疫組化的淋巴瘤診斷中十分重要?，F(xiàn)在是5頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三免疫球蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其模式圖Fc(Fragmentcrystalline)

是免疫球蛋白的羧基端，意為結(jié)晶片段，因其純化時(shí)呈結(jié)晶狀態(tài)而名之，該片段與抗原特異性有關(guān)

Fab(Fragmentantigenbingding)該端是抗體與抗原特異性結(jié)合的部位，每分子Ig能結(jié)合2個(gè)抗原分子

Fc

Fab

Ag現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三多克隆抗體與單克隆抗體及其產(chǎn)生

多克隆抗體：多株B細(xì)胞針對(duì)多個(gè)抗原決定簇產(chǎn)生的抗體單克隆抗體：針對(duì)某一抗原決定簇，由單株淋巴細(xì)胞（克?。┧a(chǎn)生的抗體多克隆抗體單克隆抗體現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三多克隆抗體與單克隆抗體及其產(chǎn)生多克隆抗體的產(chǎn)生以純化的抗原免疫動(dòng)物而獲得，實(shí)際上是針對(duì)多個(gè)抗原決定簇的多個(gè)抗體組成，檢測(cè)范圍廣。在病理診斷中，有利劃歸腫瘤的基本類型。常用的多克隆抗體一般在兔身上產(chǎn)生，國(guó)外產(chǎn)品目錄上常以RaH（RabbitagainstHuman）表之。多克隆抗體亦可產(chǎn)生于羊、豬、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗體的動(dòng)物來源種類，對(duì)后繼抗體的選用至關(guān)重要。現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三多克隆抗體與單克隆抗體及其產(chǎn)生

單克隆抗體的產(chǎn)生

應(yīng)用細(xì)胞融合的雜交瘤技術(shù)（Hybridization），以針對(duì)單一抗原決定簇的小鼠與小鼠骨髓瘤細(xì)胞（腫瘤性B細(xì)胞）融合形成雜交瘤，其特點(diǎn)是既能產(chǎn)生特異性抗體，又能在體外無限地增殖。將瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)或注入小鼠腹腔內(nèi)而獲單克隆抗體，由此產(chǎn)生的小鼠抗人（抗原）的抗體常以MaH表示，現(xiàn)在亦有兔的單克隆抗體現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三免疫小鼠Mouse現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三抗原的制備：傳統(tǒng)用蛋白提純近來可應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)：已知抗原的基因結(jié)構(gòu)，用其合成多肽，作為抗原，如ER、PR抗原的制備現(xiàn)有兔的單抗現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三多克隆抗體和多克隆抗體的選用單克隆抗體的制備比多克隆抗體復(fù)雜，價(jià)格更貴；在應(yīng)用中不一定比多克隆抗體好。單克隆抗體的特異性強(qiáng)，多克隆抗體則敏感性高，為何使用完全決定于使用的目的性現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三市售抗體的種類某些抗體既有多克隆抗體也有單克隆抗體，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗體，如α-胰蛋白酶有些抗體的抗原來自動(dòng)物，利用動(dòng)物與人抗原之間的共同抗原性使該種抗體能應(yīng)用于人的檢測(cè)。如Desmin來源于雞的肌肉近年來,市售單克隆抗體除小鼠源性外，還有兔源性現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三標(biāo)記抗體在抗體上用化學(xué)方法聯(lián)接某種標(biāo)記物，目的是使抗原抗體的結(jié)合能用肉眼觀察到標(biāo)記物種類：熒光素：異硫氰酸熒光素或羅丹明酶：辣根過氧化酶，鹼性磷酸酶金屬離子：膠體金顆粒標(biāo)記的方法：化學(xué)性結(jié)合將降低抗體效價(jià)及標(biāo)記物的活性，從而使染色敏感性降低現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三酶—抗酶抗體復(fù)合物通過免疫反應(yīng)而不是化學(xué)方法，將酶結(jié)合到抗體上，形成具酶活性的免疫復(fù)合物。如PAP復(fù)合物（PeroxidaseAntiPeroxidaseComplex），PAP復(fù)合物屬非標(biāo)記性，保護(hù)了酶的活性，比免疫熒光法敏感上千倍?，F(xiàn)在是15頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三親和素—生物素復(fù)合物

（Avidin-BiotinComplexABC）親和素有四個(gè)生物素分子特異性結(jié)合部位，其結(jié)合力強(qiáng)，不可逆，還可和辣根過氧化酶或熒光素等結(jié)合親和素-生物素復(fù)合物是一個(gè)三維空間的結(jié)構(gòu)，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體聯(lián)接第一抗體，另一端通過生物素化酶與顯色系統(tǒng)相連接，產(chǎn)生多級(jí)放大，從而提高此生物反應(yīng)的敏感性和特異性AB復(fù)合物多用于ABC法的免疫組化中現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三

酶標(biāo)親和素（Labelledstreptavidin）在AB復(fù)合物中，酶是標(biāo)記在生物素上，而后與親和素合成復(fù)合物。在標(biāo)記的親和素-生物素方法中是將辣根過氧化酶直接標(biāo)記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強(qiáng)的結(jié)合力，因此LSAB法比ABC法更敏感現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三多聚物載體一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKOEPOS及DAKOEnvision試劑核心是一種柔韌的多聚物，它能結(jié)合一抗和酶分子，起到載體的作用一步法多聚物載體試劑是多聚物結(jié)合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯(lián)結(jié)的由HRP標(biāo)記的多聚物現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三一步法：EPOStissueantigen

dextranbackboneprimaryantibodyenzymemolecule

現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三二步法：EnVision現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三葡萄球菌蛋白A（StaphylococcalproteinA,SPA）現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三二、免疫過氧化物酶染色技術(shù)的基本原理現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三免疫過氧化酶染色技術(shù)的基本原理現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三識(shí)別系統(tǒng)特異性抗體識(shí)別組織或細(xì)胞中的靶抗原。特異性抗體具有識(shí)別并結(jié)合靶抗原的功能，這是本技術(shù)的理論依據(jù)所在特異性抗體品種繁多，應(yīng)根據(jù)待檢測(cè)抗原的要求選用特異性抗體有的屬單抗，有的屬多抗，有的既有單抗又有多抗，可根據(jù)不同染色要求而選用識(shí)別系統(tǒng)的組成比較恒定，識(shí)別功能由特異的第一抗完成現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三顯示系統(tǒng)也是顯色系統(tǒng)?？贵w抗原的結(jié)合是肉眼看不見的，顯示系統(tǒng)的目的就是使這種看不見的反應(yīng)變?yōu)榭吹靡?，從而確定抗原的存在及其定位顯色系統(tǒng)由酶、底物加上顯色劑組成，最終可在標(biāo)記位點(diǎn)形成有色分子的終末產(chǎn)物，若顯色劑為DAB，則出現(xiàn)棕褐色細(xì)顆粒沉淀

E(酶)+S(底物)

E?S(酶底物復(fù)合物)

P(反應(yīng)產(chǎn)物)

+E(酶)

循環(huán)使用現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三顯示系統(tǒng)辣根過氧化酶的免疫組化染色的反應(yīng)過程:HRP+H2O2

HRP?H2O2

有色分子終末產(chǎn)物+HRP

DAB（電子供體）

HRP：酶

H2O2：底物

HRP?H2O2：酶?底物復(fù)合物

現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三免疫過氧化酶染色的多種方法中，其主要的不同點(diǎn)在于顯色系統(tǒng)的差異：間接酶標(biāo)法：利用標(biāo)記于橋聯(lián)抗體的酶PAP法：利用PAP復(fù)合物ABC法：利用AB復(fù)合物L(fēng)SAB法:利用直接標(biāo)記于親和素的酶EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物載體

其目的都是設(shè)法提高免疫組化染色的敏感性顯示系統(tǒng)現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三聯(lián)結(jié)系統(tǒng)聯(lián)結(jié)或橋聯(lián)抗體（一般為第二抗體）按免疫學(xué)要求將識(shí)別系統(tǒng)與顯色系統(tǒng)聯(lián)結(jié)成為統(tǒng)一體應(yīng)采用何種聯(lián)結(jié)抗體決定于特異性第一抗體是多克隆還是單克隆：若一抗是多克隆抗體，則二抗是羊或其它動(dòng)物的抗兔血清；若一抗是單克隆抗體，則二抗常是兔抗鼠的血清有的聯(lián)結(jié)抗體既能聯(lián)結(jié)多抗，亦能聯(lián)結(jié)單抗現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三三、免疫組化染色方法的類別現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三免疫組化染色方法的類別直接法間接法PAP法ABC法LSAB法一步法（EPOS）兩步法（Envision）現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三直接法將熒光、酶、金直接標(biāo)記在一抗上進(jìn)行顯色，沒有聯(lián)結(jié)系統(tǒng)、未用橋抗體。優(yōu)點(diǎn)：特異性高、非特異染色輕。缺點(diǎn)：敏感性低，要求抗體濃度高。每種一抗均需用酶來標(biāo)記現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三間接法將標(biāo)記物標(biāo)記在橋聯(lián)抗體上（即二抗、三抗）一抗往往是兔身上產(chǎn)生的多克隆抗體，其酶標(biāo)抗體必須是針對(duì)兔優(yōu)點(diǎn)：敏感性高，只需少數(shù)幾種動(dòng)物的二抗就可以和所有一抗相匹配缺點(diǎn)：特異性差現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三PrimaryAntibodySecondaryAntibodySubstrate-chromogenesolution現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三PAP法

（Peroxidase-AntiPeroxidase，過氧化酶-抗過氧化酶法）組成：一抗是針對(duì)靶抗原的特異性抗體二抗是聯(lián)結(jié)抗體，一面聯(lián)結(jié)一抗，另一面聯(lián)結(jié)PAP復(fù)合物三抗是以過氧化物酶為抗原，在與一抗同種動(dòng)物身上誘發(fā)產(chǎn)生的抗體，并與辣根過氧化物酶形成復(fù)合物（PAP）現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三PAP法

（Peroxidase-AntiPeroxidase，過氧化酶-抗過氧化酶法）優(yōu)點(diǎn)：PAP復(fù)合物中含酶更多，且是一種非標(biāo)記的免疫組化方法，敏感性更高PAP復(fù)合物常來自兩種不同的動(dòng)物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗為單克隆抗體的染色，兔PAP多用于一抗為多克隆抗體的染色可用于福爾馬林固定的石蠟切片現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三PAPPrimaryAntibodySecondaryAntibodyPeroxidase-anti-PeroxidaseSubstrate-chromogenesolution現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三ABC法

（Avidin-BiotinComplex，親和素-生物素法）組成：一抗、生物素化的二抗、ABC復(fù)合物（親和素+酶標(biāo)生物素）優(yōu)點(diǎn)：親和素和生物素有強(qiáng)大親和力，使其比直接和間接酶標(biāo)法更敏感，也超過PAP法。能用于常規(guī)石蠟切片?，F(xiàn)在是38頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三親和素—生物素復(fù)合物

（Avidin-BiotinComplexABC）親和素有四個(gè)生物素分子特異性結(jié)合部位，其結(jié)合力強(qiáng)，不可逆，還可和辣根過氧化酶或熒光素等結(jié)合親和素-生物素復(fù)合物是一個(gè)三維空間的結(jié)構(gòu)，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體聯(lián)接第一抗體，另一端通過生物素化酶與顯色系統(tǒng)相連接，產(chǎn)生多級(jí)放大，從而提高此生物反應(yīng)的敏感性和特異性AB復(fù)合物多用于ABC法的免疫組化中現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三ABC法

（Avidin-BiotinComplex，親和素-生物素法）現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三一抗二抗ABCDABABC現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三ABC與PAP法的比較現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三LSAB（SP）法

（labelledstreptavidinbiotinmethod）標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素法特點(diǎn)：將HRP直接標(biāo)記于鏈霉親和素上優(yōu)點(diǎn)：更快速：空間結(jié)構(gòu)更小更敏感：鏈霉親和素的親和性更強(qiáng)，更易于到達(dá)深部位點(diǎn)非特異背景更少：鏈霉親和素空間結(jié)構(gòu)特殊，不易與高荷電的組織成分（膠原纖維、結(jié)締組織）聯(lián)結(jié)現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三

酶標(biāo)親和素（Labelledstreptavidin）在AB復(fù)合物中，酶是標(biāo)記在生物素上，而后與親和素合成復(fù)合物。在標(biāo)記的親和素-生物素方法中是將辣根過氧化酶直接標(biāo)記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強(qiáng)的結(jié)合力，因此LSAB法比ABC法更敏感現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三SPPrimaryAntibodyBiotinylatedSecondaryAntibodyEnsyme-conjugatedStreptavidinSubstrate-chromogensolution現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三ABC與LSAB(SP)法的比較現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三一步法（EPOS）及兩步法（Envision）特點(diǎn)以多聚體為載體，聯(lián)結(jié)了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法）優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)便，省時(shí)提高了敏感性和特異性減少了背景著色避免內(nèi)源性生物素的干擾現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三多聚物載體一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKOEPOS及DAKOEnvision試劑核心是一種柔韌的多聚物，它能結(jié)合一抗和酶分子，起到載體的作用一步法多聚物載體試劑是多聚物結(jié)合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯(lián)結(jié)的由HRP標(biāo)記的多聚物現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三一步法：EPOStissueantigen

dextranbackboneprimaryantibodyenzymemolecule

現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三二步法：EnVision現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三一步法（EPOS）及兩步法（Envision）比較現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三Substrate-chromogensolutionEPOS一步法現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三PrimaryAntibodyPolymercomplexSubstrate-chromogensolutionEnVision二步法現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三四、免疫組化染色結(jié)果的判斷及異常著色的原因分析及其對(duì)策現(xiàn)在是54頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三特異性著色具備特點(diǎn)

特定的組織特定的定位特定的細(xì)胞特定的細(xì)胞內(nèi)的部位分布上的不均一著色的不均一性著色強(qiáng)度的不均一顆粒性顯色：DAB顯色劑應(yīng)為棕黃到棕褐色免疫組化染色結(jié)果的判斷現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三CK染色，結(jié)腸腺癌細(xì)胞膜特異性著色現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三Kappa胞漿著色現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三TdT染色，胞核著色現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三PR胞核著色現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三ER胞核著色現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三免疫組化染色結(jié)果的判斷對(duì)照的設(shè)置空白對(duì)照陽性對(duì)照吸收試驗(yàn)對(duì)照替代對(duì)照自身對(duì)照現(xiàn)在是61頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三異常著色（假陽性）原因及對(duì)策異常著色原因內(nèi)源酶及內(nèi)源性生物素抗體本身原因切片制作不當(dāng)沖洗不充分DAB顯色產(chǎn)生背景著色抗原的丟失抗原的遮蔽抗體試劑因素操作不當(dāng)假陰性的原因現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期三內(nèi)源酶及內(nèi)源生物素非特異性著色原因及對(duì)策滅活過氧化物酶-----