基因組和基因預(yù)測(cè)

基因組和基因預(yù)測(cè)1第1頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四課堂內(nèi)容一、基因、基因組的概念二、典型生物的基因組特征三、人類基因組計(jì)劃四、核酸測(cè)序技術(shù)五、基因組測(cè)序六、基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序七、基因的功能和預(yù)測(cè)2第2頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四一、基因、基因組的概念3第3頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四1、基因的概念基因是原核、真核生物以及病毒的DNA和RNA分子中具有遺傳效應(yīng)的核苷酸序列，是遺傳的基本單位。基因是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位對(duì)于編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因來說，基因是決定一條多肽鏈的DNA片段4第4頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四基因的由來孟德爾（GregorJohannMendel1822～1884），《植物雜交試驗(yàn)》一文中指出，生物每一個(gè)性狀都是通過遺傳因子來傳遞的，遺傳因子是一些獨(dú)立的遺傳單位5第5頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四Theoryofthegene

基因是染色體上的實(shí)體

基因象鏈珠(bead)一樣，孤立地呈線狀地排列在染色體上

基因是：

功能(functionalunit)突變(mutationunit)

交換(cross-overunit)

“三位一體”的(Threeinone)最小的不可分割的基本的遺傳單位(1926T.H.Morgan)6第6頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四基因概念的進(jìn)一步發(fā)展（1）基因具重疊性1977年桑格（F.Sanger）領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，根據(jù)大量研究事實(shí)繪制了共含有5375個(gè)核苷酸的ΦX174噬菌體DNA堿基順序圖，第一次揭示了遺傳的一種經(jīng)濟(jì)而巧妙的編排——B和E基因核苷酸順序分別與A和D基因的核苷酸順序的一部分互相重疊。當(dāng)然它們各有一套讀碼結(jié)構(gòu)，且基因末端密碼也有重疊現(xiàn)象（A基因終止密碼子TGA和C基因起始密碼子ATG重疊2個(gè)核苷酸；D基因的終止密碼子TAA與J基因起始密碼子ATG互相重疊1個(gè)核苷酸，順序?yàn)門AATG）7第7頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四基因重疊示意圖8第8頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四乙肝病毒的基因組9第9頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四（2）內(nèi)含子和外顯子人們?cè)谘芯啃‰u卵清蛋白基因時(shí)發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄形成的mRNA只有該基因長度的1/4，其原因是基因中一些間隔序列的轉(zhuǎn)錄物在RNA成熟過程中被切除了這些間隔序列叫內(nèi)含子，基因中另一些被轉(zhuǎn)錄形成RNA的序列叫外顯子。小雞的卵清蛋白基因中至少含7個(gè)內(nèi)含子。因而從基因轉(zhuǎn)錄效果看，基因由外顯子和內(nèi)含子構(gòu)成。1978Gilbert真核生物基因的新概念

Exon（外顯子）isanysegmentofaninterruptedgenethatisrepresentedinthematureRNAproduct.Intron（內(nèi)含子）isasegmentofDNAthatistranscribed,butremovedfromwithinthetranscriptbysplicingtogetherthesequences(exons)oneithersideofit.10第10頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四OvalbuminDNAXcDNAElectro-microscope7introns8exons11第11頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四（3）管家基因和奢侈基因管家基因house-keepinggene;housekeepinggene生物體各類細(xì)胞中都表達(dá)，對(duì)維持細(xì)胞存活和生長所必需的蛋白質(zhì)編碼的基因。如糖酵解和檸檬酸循環(huán)所需酶的編碼基因等奢侈基因luxurygene組織特異性基因

tissue-specificgene特定類型細(xì)胞中為其執(zhí)行特定功能蛋白質(zhì)編碼的基因12第12頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四（4）基因的游動(dòng)性早在20世紀(jì)40年代美國遺傳學(xué)家麥克林托克（B.McClintock）在玉米研究中發(fā)現(xiàn)“轉(zhuǎn)座因子”，直至1980年夏皮羅（J.Shapiro）等人證實(shí)了可移位的遺傳基因存在，說明某些基因具有游動(dòng)性。為此，這位“玉米夫人”榮獲了1983年度諾貝爾獎(jiǎng)13第13頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四DNA轉(zhuǎn)座現(xiàn)象的一般遺傳特點(diǎn)：a)不依賴Donorsite與Targetsite

間序列的同源性

(非同源重組過程，不依賴recA酶)b)轉(zhuǎn)座插入的靶位點(diǎn)并非完全隨機(jī)（插入專一型）Hotspots(熱點(diǎn))Regionalpreference(在3kb區(qū)域內(nèi)的隨機(jī)插入)c)某些轉(zhuǎn)座因子（Tn3）對(duì)同類轉(zhuǎn)座因子的插入具有排他性（免疫性）d)靶序列在轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)會(huì)形成正向重復(fù)(DR)e)轉(zhuǎn)座因子的切除與轉(zhuǎn)座將產(chǎn)生復(fù)雜的遺傳學(xué)效應(yīng)14第14頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四基因組中不同的區(qū)域具有不同的功能有些區(qū)域編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因有些區(qū)域復(fù)制及轉(zhuǎn)錄的調(diào)控信號(hào)有些區(qū)域的功能尚不清楚基因組：細(xì)胞內(nèi)遺傳信息的攜帶者DNA的總體2、基因組的概念15第15頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四①從細(xì)胞遺傳學(xué)的角度來看，基因組是指一個(gè)生物物種單倍體的所有染色體數(shù)目的總和；②從經(jīng)典遺傳學(xué)的角度來看，基因組是一個(gè)生物物種的所有基因的總和；③從分子遺傳學(xué)的角度來看，基因組是一個(gè)生物物種所有的不同核酸分子的總和；④從現(xiàn)代生物學(xué)的角度來看，基因組是指導(dǎo)一個(gè)生物物種的結(jié)構(gòu)和功能的所有遺傳信息的總和，包括全部的基因和調(diào)控元件等核酸分子。16第16頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四基因組的大?。篊值C值通常指一種生物單倍體基因組DNA的總量。ThetotalamountofDNAinthegenomeofhaploidisacharacteristicofeachlivingspeciesknownasitsMaximumCvalue

(單倍體基因組總DNA的含量)

最大C值(MaximumCvalue)ThetotalamountofDNAforencodingthegenesinformationistermeditsMinimumcvalue（編碼基因信息的總DNA含量）

最小C值(Minimumcvalue)17第17頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四基因組的大小和C值矛盾某生物單倍體的DNA總量稱C值，C值與生物的進(jìn)化程度不完全對(duì)應(yīng)。18第18頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四霉菌藻類G+細(xì)菌G-細(xì)菌顯花植物鳥類哺乳類爬行類兩棲類硬骨魚類軟骨魚類棘皮類甲殼類昆蟲類軟體動(dòng)物蠕蟲類真菌支原體Cvalueparadoxofnucleotide

A生物體進(jìn)化程度與大

C值不成明顯正相關(guān)B親緣關(guān)系相近的生物間大C值相差較大

C一種生物內(nèi)大C值與小c值相差極大（Euk.人體c=C/10）

(Prok.Φx174c＞C)

19第19頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四某些生物的基因組數(shù)據(jù)

物種基因組大小基因數(shù)目基因長度

ΦX1740.7kb10λ噬菌體45Kb100大腸桿菌4.2Mb42001.2kb釀酒酵母13.5Mb63001.4kb果蠅14Mb1200011.3kb人3.3Gb3500016.3kb擬南芥70Gb2500020第20頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四二、典型生物的基因組特征21第21頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四1、真核生物基因的特點(diǎn)22第22頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四真核生物基因組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，儲(chǔ)存于細(xì)胞核內(nèi)，除配子細(xì)胞外，體細(xì)胞內(nèi)的基因的基因組是雙份的（即雙倍體，diploid），即有兩份同源的基因組。真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。一個(gè)結(jié)構(gòu)基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯生成一個(gè)mRNA分子和一條多肽鏈。存在重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可達(dá)百萬次以上?；蚪M中不編碼的區(qū)域多于編碼區(qū)域。大部分基因含有內(nèi)含子，因此，基因是不連續(xù)的?；蚪M遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物的基因組，具有許多復(fù)制起點(diǎn)，而每個(gè)復(fù)制子的長度較小。23第23頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四，內(nèi)含子、啟動(dòng)子24第24頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四2、

細(xì)菌基因組及其特點(diǎn)

a.細(xì)菌的“染色體”通常有一個(gè)環(huán)狀或線型DNA分子組成，只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。不少細(xì)菌含有若干個(gè)小的環(huán)狀DNA，被稱作質(zhì)粒(plasmid)。有些質(zhì)粒可以從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌，不少經(jīng)過改造的質(zhì)粒在基因工程中被用作基因轉(zhuǎn)移的載體。b.編碼蛋白質(zhì)的基因?yàn)閱慰截惖模玶RNA基因一般是多拷貝的。c.基因組中有多種調(diào)控區(qū)，和少量重復(fù)序列，調(diào)控原件比病毒復(fù)雜，但比真核生物簡(jiǎn)單，重復(fù)序列比真核生物少得多。

d.功能相關(guān)的幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因往往串聯(lián)在一起，受它們上游的共同調(diào)控區(qū)控制，形成操縱子結(jié)構(gòu)。e.基因組中存在與真核生物類似的可移動(dòng)DNA序列（轉(zhuǎn)座子）。25第25頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四26第26頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四DNAfromalysedE.colicell.Inthiselectronmicrographseveralsmall,circularplasmidDNAsareindicatedbywhitearrows.Theblackspotsandwhitespecksareartifactsofthepreparation.27第27頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四蛋白結(jié)構(gòu)功能含量/每細(xì)胞相當(dāng)于核蛋白基因HUα和β亞基，每個(gè)9KD使DNA壓縮、類核凝聚，刺激復(fù)制，和1HF有關(guān)4萬個(gè)二聚體H2BhupA.BH兩個(gè)相同亞基，各28KD促使雙鏈的互補(bǔ)、復(fù)性3萬個(gè)二聚體H2A？IHFα10.5KDβ9.5KD有助于att位點(diǎn)配對(duì)重組？？himA.D.H1(H-NS)15KD亞基和DNA結(jié)合，與DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有關(guān)1萬？osZbglYpilGHLP117KD單體？2萬？firAP3KD亞基？？魚精蛋白(DNA結(jié)合蛋白)？E.coli含有的各種DNA結(jié)合蛋白28第28頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四3、病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能病毒是最簡(jiǎn)單的生物形式，完整的病毒顆粒包括外殼蛋白和內(nèi)部的基因組DNA或RNA（有些病毒的外殼蛋白外面有一層由宿主細(xì)胞構(gòu)成的被膜（envelope），被膜內(nèi)含有病毒基因編碼的糖蛋白。病毒不能獨(dú)立地復(fù)制，必需進(jìn)入宿主細(xì)胞中借助細(xì)胞內(nèi)的一些酶類和細(xì)胞器才能使病毒得以復(fù)制。外殼蛋白（或被膜）的功能是識(shí)別和侵襲特定的宿主細(xì)胞并保護(hù)病毒基因組不受核酸酶的破壞。29第29頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四病毒基因組大小相差較大，與細(xì)菌或真核細(xì)胞相比，病毒的基因組很小病毒基因組可以由DNA組成，也可以由RNA組成多數(shù)RNA病毒的基因組是由連續(xù)的核糖核酸鏈組成基因重疊即同一段DNA片段能夠編碼兩種甚至三種蛋白質(zhì)分子病毒基因組的大部分是用來編碼蛋白質(zhì)的病毒基因組DNA序列中功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因或rRNA的基因往往叢集在基因組的一個(gè)或幾個(gè)特定的部位,形成一個(gè)功能單位或轉(zhuǎn)錄單元。除了反轉(zhuǎn)錄病毒以外，一切病毒基因組都是單倍體，每個(gè)基因在病毒顆粒中只出現(xiàn)一次。反轉(zhuǎn)錄病毒基因組有兩個(gè)拷貝。噬菌體（細(xì)胞病毒）的基因是連續(xù)的；而真核細(xì)胞病毒的基因是不連續(xù)的30第30頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四三、人類基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃的啟動(dòng)

1986年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者R.Dulbecco提出人類基因組計(jì)劃--測(cè)出人類全套基因組的DNA堿基序列（1n:3X109b）31第31頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四

人類基因組計(jì)劃February2001,TheHGPconsortiumpublishesitsworkingdraftinNature(15February),andCelerapublishesitsdraftinScience(16February).32第32頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四2003年完成的人類基因組30億個(gè)堿基對(duì)測(cè)序耗時(shí)10多年，耗資約40億美元。到2003年底大約測(cè)出150個(gè)物種的基因組全序列。2007年5月底，Watson個(gè)人的基因組全序列公布，60億個(gè)堿基對(duì)的測(cè)定耗時(shí)不足2年，耗資不足200萬美元。2007年10月，中國人的基因組全序列測(cè)定完成。2008年1月，中國的第一個(gè)個(gè)人基因組全序列測(cè)定完成。81歲的沃森（2007年）

33第33頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四各物種基因組的比較：34第34頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四（1）繪制染色體的高分辨率遺傳圖譜，用各種分子標(biāo)記或限制性酶所作的物理圖譜。（2）對(duì)DNA進(jìn)行切割和克隆，構(gòu)成重疊群。（3）測(cè)定DNA的序列，繪制DNA的序列圖譜。（4）對(duì)基因進(jìn)行鑒定。（5）建立數(shù)據(jù)庫，開發(fā)相應(yīng)的軟件。人類基因組計(jì)劃的研究方法：1、前述的真核基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)基本上都適用于人類基因組。2、基因組DNA有30億個(gè)堿基對(duì)(3×109bp)，5－10萬個(gè)基因，目前已定位的有2000個(gè)3、編碼序列只占基因組總DNA量的5%以下，非編碼區(qū)占95%以上，大量為重復(fù)序列人類基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：35第35頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四

解碼生命了解生命的起源了解生命體生長發(fā)育的規(guī)律認(rèn)識(shí)種屬之間和個(gè)體之間存在差異的起因認(rèn)識(shí)疾病產(chǎn)生的機(jī)制以及長壽與衰老等生命現(xiàn)象為疾病的診治提供科學(xué)依據(jù)HGP（人類基因組計(jì)劃）的目的36第36頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四

遺傳圖譜（geneticmap）又稱連鎖圖譜(linkagemap)，它是以具有遺傳多態(tài)性（在一個(gè)遺傳位點(diǎn)上具有一個(gè)以上的等位基因，在群體中的出現(xiàn)頻率皆高于1%）的遺傳標(biāo)記為“路標(biāo)”，以遺傳學(xué)距離（在減數(shù)分裂事件中兩個(gè)位點(diǎn)之間進(jìn)行交換、重組的百分率，1%的重組率稱為1cM）為圖距的基因組圖。遺傳圖譜的建立為基因識(shí)別和完成基因定位創(chuàng)造了條件。遺傳連鎖圖：通過計(jì)算連鎖的遺傳標(biāo)志之間的重組頻率，確定它們的相對(duì)距離，一般用厘摩（cM，即每次減數(shù)分裂的重組頻率為1%）表示HGP的主要任務(wù)37第37頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四物理圖譜（physicalmap）是指有關(guān)構(gòu)成基因組的全部基因的排列和間距的信息，它是通過對(duì)構(gòu)成基因組的DNA分子進(jìn)行測(cè)定而繪制的。繪制物理圖譜的目的是把有關(guān)基因的遺傳信息及其在每條染色體上的相對(duì)位置線性而系統(tǒng)地排列出來。轉(zhuǎn)錄圖譜是在識(shí)別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上繪制的結(jié)合有關(guān)基因序列、位置及表達(dá)模式等信息的圖譜。序列圖譜：隨著遺傳圖譜和物理圖譜的完成，測(cè)序就成為重中之重的工作。DNA序列分析技術(shù)是一個(gè)包括制備DNA片段化及堿基分析、DNA信息翻譯的多階段的過程。通過測(cè)序得到基因組的序列圖譜38第38頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四四、核酸測(cè)序技術(shù)39第39頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四1950196019701980199020002010DevelopmentofSangerSequencing(1977)InventionofAutomatedFluorescentSequencer(1985)InventionofCapillarySequencer(1996)InventionofAppliedBiosystemsSolidSystem(2007)InventionofIlluminaGenomeAnalyzerSystem(2006)Inventionof454GS20Sequencer(2005)chemicaldegradationmethodbyMaxam-Gilbertmethod(1977)ChemicaldegradationmethodbyWhitfield(1954)InventionofHeliscopesinglemolecularsequencerInventionofSinglemoleculerealtime(SMRT)DNAsequencingInventionofNanoporesinglemolecularsequencing(OxfordNanoporecorporation)1、測(cè)序技術(shù)的發(fā)展介紹（1）、測(cè)序技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史40第40頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四（2）、一代測(cè)序技術(shù)--Sanger測(cè)序法PCR末端終止技術(shù)+電泳檢測(cè)技術(shù)單個(gè)片段序列測(cè)定最高通量：小于4MB/天基于平板膠的測(cè)序技術(shù)96通道毛細(xì)管陣列41第41頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四一代測(cè)序發(fā)展：1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法，標(biāo)志著第一代測(cè)序技術(shù)的誕生。1954年，Whitfeld等提出了測(cè)定多聚核糖核苷酸鏈的降解法，利用磷酸單酯酶的脫磷酸作用和高碘酸鹽的氧化作用從鏈末端逐一分離寡核糖核苷酸并測(cè)定其種類。80年代中期出現(xiàn)了以熒光標(biāo)記代替放射性同位素標(biāo)記、以熒光信號(hào)接收器和計(jì)算機(jī)信號(hào)分析系統(tǒng)代替放射性自顯影的自動(dòng)測(cè)序儀90年代中期出現(xiàn)的毛細(xì)管電泳技術(shù)使得測(cè)序的通量大為提高完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測(cè)序工作成本高、速度慢等方面的不足42第42頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四（3）、二代測(cè)序技術(shù)ShotGun文庫構(gòu)建DNA片段固定簇序列讀取反應(yīng)圖像獲得和處理序列組裝和比較單條模板擴(kuò)增1234TTTT…T

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…測(cè)序原理簡(jiǎn)介43第43頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四123789456TTTTTTT

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A

T…44第44頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四2、主要測(cè)序技術(shù)平臺(tái)Metzker,NatureReviewsGenetics(2010)11:3145第45頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四200520062007BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche454IlluminaGenomeAnalyzer/Hiseq2000ABISOLiD46第46頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四2.1Roche公司的454測(cè)序技術(shù)

焦磷酸測(cè)序待測(cè)DNA文庫的構(gòu)建噴霧法300-800bpEmulsionPCR測(cè)序數(shù)據(jù)分析釋放的焦磷酸基團(tuán)會(huì)與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化酶反應(yīng)形成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化反應(yīng)體系中的熒光素分子并發(fā)出熒光。47第47頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四2.2Illumina公司的Solexa技術(shù)邊合成邊測(cè)序向反應(yīng)體系中同時(shí)添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4種dNTP。由于這些dNTP的3′羥基被化學(xué)方法保護(hù)，因而每輪合成反應(yīng)都只能添加一個(gè)dNTP。未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會(huì)被洗脫。加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號(hào)，用光學(xué)設(shè)備完成熒光信號(hào)的記錄，再通過計(jì)算機(jī)分析轉(zhuǎn)化為測(cè)序結(jié)果。待測(cè)DNA文庫的構(gòu)建200-500bpDNA與流動(dòng)槽的附著BridgePCRdsDNA的變性測(cè)序數(shù)據(jù)分析48第48頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四2.3ABI公司的SOLiD技術(shù)待測(cè)DNA文庫的構(gòu)建EmulsionPCR連接酶測(cè)序數(shù)據(jù)分析體系中加入DNA連接酶、通用測(cè)序引物n和具有3’-XXnnnzzz-5’結(jié)構(gòu)的八聚核苷酸；第1和第2位（XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類的不同在第6-8位（zzz）上加了不同的熒光標(biāo)記。49第49頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四（4）、三代測(cè)序優(yōu)點(diǎn)：1）更高的通量；2）更短的測(cè)序時(shí)間；3）更長的讀取長度；4）更高的精確性，可以檢測(cè)出極少的變異；5）需要很少的起始樣本量；6）低成本第三代測(cè)序?yàn)閱畏肿訙y(cè)序，不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增50第50頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四4.1、HelicoBioScience單分子測(cè)序技術(shù)邊合成邊測(cè)序用末端轉(zhuǎn)移酶在3‘末端加上poly(A),以及在poly(A)的末端進(jìn)行熒光標(biāo)記和阻斷，阻斷的目的是防止在測(cè)序過程中核苷酸在模板的3’末端進(jìn)行延伸。把這些小片段與帶有poly(T)的平板雜交，poly(T)的作用不僅是捕獲模板，也是延伸時(shí)的引物。成像來獲得已經(jīng)雜交模板所處的位置，建立邊合成邊測(cè)序的位點(diǎn)。加入聚合酶和被Cy3熒光標(biāo)記脫氧核苷酸進(jìn)行DNA合成，每次只加入一種脫氧核苷酸，然后將未參與合成的的dNTP和DNA聚合酶洗脫，直接對(duì)Cy3成像，觀測(cè)模板位點(diǎn)上是否有熒光信號(hào)Helicos公司51第51頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四4.2、PacificBioscienceSMRTT（

Single-moleculeReal-time）

技術(shù)PacificBiosciences公司邊合成邊測(cè)序SMRT芯片是一種帶有很多ZMW(zero-modewaveguides)孔的厚度為100nm的金屬片將DNA聚合酶、待測(cè)序列和不同熒光標(biāo)記的dNTP放入ZMW孔的底部，進(jìn)行合成反應(yīng)。與其他技術(shù)不同的是，熒光標(biāo)記的位置是磷酸基團(tuán)而不是堿基。當(dāng)一個(gè)dNTP被添加到合成鏈上的同時(shí)，它會(huì)進(jìn)入ZMW孔的熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)并在激光束的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)熒光的種類就可以判定dNTP的種類。52第52頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四4.3、OxfordNanoporeTechnologies的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)OxfordNanoporeTechnologies公司電信號(hào)測(cè)序以α-溶血素來構(gòu)建生物納米孔，核酸外切酶依附在孔一側(cè)的外表面，一種合成的環(huán)糊精做為傳感器共價(jià)結(jié)合到納米孔的內(nèi)表面。這個(gè)系統(tǒng)被鑲嵌在一個(gè)脂雙分子層內(nèi)，為了提供既符合堿基區(qū)分檢測(cè)又滿足外切酶活性的物理?xiàng)l件，脂雙分子層兩側(cè)為不同的鹽濃度。在適合的電壓下，核酸外切酶消化單鏈DNA，單個(gè)堿基落入孔中，并與孔內(nèi)的環(huán)糊精短暫的相互作用，影響了流過納米孔原本的電流，腺嘌呤與胸腺嘧啶的電信號(hào)大小很相近，但胸腺嘧啶在環(huán)糊精停留是時(shí)間是其他核苷酸的2～3倍，所以每個(gè)堿基都因其產(chǎn)生電流干擾振幅是特有的而被區(qū)分開來。53第53頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四三代測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)的比較54第54頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四五、基因組測(cè)序及其應(yīng)用

（一）、基因組從頭測(cè)序（二）、基因組重測(cè)序55第55頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四構(gòu)建不同長度的插入片段文庫高通量測(cè)序基因組雜合度分析覆蓋基因區(qū)估計(jì)得到框架圖或更高覆蓋度500bpfragment文庫Paired-end測(cè)序，測(cè)序深度達(dá)到40×以上3KBMatepair文庫Paired-end測(cè)序，測(cè)序深度達(dá)到60×以上10KBMatepair文庫Paired-end測(cè)序，測(cè)序深度達(dá)到80×以上基因雜合度＞5%，同時(shí)啟動(dòng)BAC-to-BAC測(cè)序（一）、基因組從頭測(cè)序經(jīng)典策略56第56頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四從頭測(cè)序的數(shù)據(jù)分析和產(chǎn)出指標(biāo)框架圖

覆蓋基因組常染色體區(qū)域90%，覆蓋基因區(qū)域95%，contigN50達(dá)到5Kb，scaffoldN50達(dá)到20Kb，單堿基錯(cuò)誤率在萬分之一以下精細(xì)圖

覆蓋基因組常染色體區(qū)域95%，覆蓋基因區(qū)域98%，contigN50達(dá)到20Kb，scaffoldN50達(dá)到300Kb，單堿基錯(cuò)誤率在萬分之一以下完成圖

完整的基因組序列，單堿基錯(cuò)誤率在十萬分之一以下從頭測(cè)序的覆蓋度指標(biāo)從頭測(cè)序主要數(shù)據(jù)分析原始數(shù)據(jù)比對(duì)組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)覆蓋度、深度評(píng)價(jià)基因注釋比較基因組及進(jìn)化分析57第57頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四藍(lán)藻~1Mb線蟲~100Mb果蠅>100Mb人~3,000Mb用于基因和基因組進(jìn)化的分析小鼠~3,000Mb58第58頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四生物進(jìn)化譜系樹大鼠、小鼠、狗、大熊貓、?！译u、火雞……斑馬魚……擬南芥、水稻、楊樹、釀酒葡萄、短柄草、黃瓜、高粱、玉米……1535個(gè)細(xì)菌基因組、49個(gè)真菌基因組和78個(gè)古細(xì)菌……

利什曼原蟲、椎體蟲……四類藍(lán)藻……隱藻……蜜蜂……59第59頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四意義：第一個(gè)完全運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)模式完成的動(dòng)物基因組從頭測(cè)序；方法和結(jié)果：不同插入片段測(cè)序文庫雙末端測(cè)序技術(shù)的嘗試：包括150bp、500bp、2kb、5kb和10kb不同插入片段，測(cè)序深度達(dá)73倍，覆蓋94%的基因組區(qū)域；獲得2.7MSNP位點(diǎn)，證明大熊貓仍然具備很高的雜合率和較高的遺傳多態(tài)性；Lietal.,Nature(2009)463：311-3171、大熊貓基因組從頭測(cè)序和組裝60第60頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四大熊貓基因組從頭測(cè)序和組裝利用9個(gè)Sanger測(cè)序的BAC序列評(píng)價(jià)測(cè)序的質(zhì)量，表明98%的BAC序列可以比對(duì)到scaffold上預(yù)測(cè)大熊貓約有21001個(gè)基因大熊貓與人、狗和鼠的基因進(jìn)化分析測(cè)序數(shù)據(jù)與BAC序列比較61第61頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四2、大腸桿菌基因組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究材料：一名16歲女孩感染者分離出菌株策略：IonTorrent（79M）Hiseq（1Gb,576Mb,576Mb）Newbler,SOAPdenovo

拼接組裝研究成果完成圖包括環(huán)狀基因組及3個(gè)質(zhì)粒（pESBL,pAA,pG2011）。發(fā)現(xiàn)志賀毒素產(chǎn)生基因和大量抗生素抗性基因完成設(shè)計(jì)診斷試劑盒；包括I型集聚性粘附菌毛編碼基因（AAF/Ⅰ）與Ⅱ型志賀毒素產(chǎn)生基因Stx2華大基因,UniversityMedicalCenterHamburg-Eppendorf,伯明翰大學(xué)2011年5月-6月德國爆發(fā)由E.coliO104:H4引起的急性腸出血性流行病疫情。研究意義Rohde,etal.NEnglJMed.2011,365(8):718-724.62第62頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四Stx2-conveyprophageAcompositetransposonharboringmulti-resistantgenespTy3plasmidSepAaggregativeadherencefimbriaITwoantibioticsresistantgenespTY1plasmid(89,963bp)pTY2plasmid(76,284bp)63第63頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四OutbreakstrainGenenameResistanceOccurrenceratein92sequencedE.colistrainsdrfA7trimethoprim16.30%sulIsulfonamide13.04%sulIIsulfonamide19.57%strAstreptomycin19.57%strBstreptomycin18.48%tetAtetracycline10.87%blaCTX-M-15monobactampenicillincephalosporinceftazidime/blaTEM-1amino-andcarboxy-penicillin/64第64頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四Stx2-conveyprophageinoutbreakstrainissyntenicwithEnterobacteriaphageVT2phi_272.65第65頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四HGP項(xiàng)目：20世紀(jì)90年代美國能源部資助啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃，六個(gè)國家的科學(xué)家耗資4.37億，于2000年完成人類基因組工作草圖。方法和結(jié)果：應(yīng)用分層shotgun+Sanger測(cè)序法，結(jié)果預(yù)測(cè)了31,000個(gè)基因，證明基因組的95%是非編碼序列。意義：人類基因組測(cè)序的完成標(biāo)志著分子醫(yī)學(xué)時(shí)代的到來；此項(xiàng)目也催生了高通量測(cè)序技術(shù)。Nature(2001)409:860-921人類基因組從頭測(cè)序分析分層的shotgun測(cè)序法66第66頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四（二）、重測(cè)序生物信息學(xué)分析內(nèi)容67第67頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四中科院上海生命科學(xué)院、北京基因組所等六家科研機(jī)構(gòu)對(duì)150個(gè)水稻RIL系進(jìn)行測(cè)序利用IlluminaGA，每16個(gè)樣一個(gè)道，以3個(gè)堿基為標(biāo)簽，測(cè)序讀長為36堿基，每個(gè)樣的測(cè)序深度約0.02倍第一次利用全基因組重測(cè)序篩選SNP位點(diǎn)，對(duì)群體進(jìn)行表型分析1、利用全基因組重測(cè)序分析表型差異68第68頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四利用全基因組重測(cè)序分析表型差異分析兩個(gè)親本的基因組差異發(fā)現(xiàn)1,226,791SNP位點(diǎn)，即3.2SNPs/kb分析150個(gè)RILs發(fā)現(xiàn)了1,493,461SNP位點(diǎn)，即1SNP/40kb實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)69第69頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四利用全基因組重測(cè)序分析表型差異與以前的該RILs的重組圖譜比較分析，在150個(gè)RILs中鑒定出2334個(gè)重組框，平均每個(gè)框的大小約164kb利用slidingwindow方法分析SNP位點(diǎn)與表型間的關(guān)系與重組位點(diǎn)Slidingwindow方法70第70頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四Genetech公司（已被羅氏制藥收購）生物信息學(xué)與計(jì)算機(jī)生物學(xué)部，與CompleteGenomics公司合作對(duì)一名煙齡超過15年，平均每天吸煙25根的原發(fā)性肺部腫瘤患者進(jìn)行分析，將這名患者的癌細(xì)胞和相鄰正常組織的基因組進(jìn)行測(cè)序?qū)Π┘?xì)胞完成了60倍的測(cè)序深度，相鄰正常組織完成了46倍的測(cè)序深度。

(Leeetal.Nature(2010)465:473)2、利用重測(cè)序進(jìn)行比較基因組學(xué)研究--肺癌組織測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)71第71頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四肺癌組織比較基因組研究發(fā)現(xiàn)了超過5萬個(gè)基因點(diǎn)突變，其中530個(gè)得到確認(rèn)，它們當(dāng)中392個(gè)在編碼區(qū)域，包括以前已知的變異，如KRAS“原致癌基因”突變和放大體細(xì)胞單核苷酸突變趨勢(shì)和模式統(tǒng)計(jì)72第72頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四MAPK信號(hào)通路中多個(gè)基因的突變的作用模式肺癌組織比較基因組研究表明遺傳上復(fù)雜的腫瘤可能包含很多部分冗余的突變，而且要識(shí)別復(fù)發(fā)性致癌“驅(qū)動(dòng)突變”（drivermutation），將需要對(duì)很多尚未測(cè)序的樣本進(jìn)行測(cè)序。這些癌基因的發(fā)現(xiàn)對(duì)于未來研究肺癌靶向治療，以及基因突變具有重要的意義73第73頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四猶他大學(xué)（Universityofutah），CompleteGenomics公司，華盛頓大學(xué)等對(duì)一對(duì)夫妻和他們的兩個(gè)孩子進(jìn)行了全基因組測(cè)序。這家的兩個(gè)孩子都患有米勒綜合征和原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙，這兩種疾病都是常染色體隱性遺傳病測(cè)序深度分別為父親88倍，母親51倍，兒子52倍，女兒54倍Coachetal.,Science(2010)328(597):636–639

3、應(yīng)用全基因組重測(cè)序技術(shù)在家系中分析遺傳力74第74頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四父母和子女的測(cè)序覆蓋度分別達(dá)到91%、85%、92%和91%與參考序列相比，96%序列至少在一個(gè)家系成員中被檢測(cè)到，81%序列在家系四個(gè)成員中都檢測(cè)到應(yīng)用全基因組測(cè)序技術(shù)在家系中分析遺傳力測(cè)序數(shù)據(jù)與NCBI參考基因組序列比較分析測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)75第75頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四通過比較兩代之間的基因組序列，科學(xué)家們對(duì)兒童基因組描繪出精確的重組圖譜。這讓他們校正了70%的測(cè)序錯(cuò)誤，使測(cè)序準(zhǔn)確率達(dá)99.999%。使研究人員精確確定了重組位點(diǎn)和稀有的單核苷酸多態(tài)性。在他們最終的分析中，只保留了四個(gè)候選基因的突變，包括已知在纖毛運(yùn)動(dòng)障礙中突變的基因以及導(dǎo)致米勒綜合征的變異體應(yīng)用全基因組測(cè)序技術(shù)在家系中分析遺傳力重組圖譜SNP分析76第76頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四這些結(jié)果暗示對(duì)任何簡(jiǎn)單的單基因遺傳病，一個(gè)或兩個(gè)家庭的全基因組測(cè)序就有可能鑒定出致病突變研究人員還第一次估算出兩代人之間的遺傳突變率，即基因組從一代人到下一代人的遺傳過程中會(huì)發(fā)生多大程度的改變，約為1.1×10-8。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從父母到孩子的基因變異率僅為之前醫(yī)學(xué)界預(yù)期的一半。應(yīng)用全基因組測(cè)序技術(shù)在家系中分析遺傳力77第77頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四4、個(gè)人基因組計(jì)劃（PGP）哈佛醫(yī)學(xué)院計(jì)算遺傳中心主任GeorgeChurch提出PGP目標(biāo)是創(chuàng)建一個(gè)包含100,000人、公眾可以公開訪問的在線基因庫，幫助科學(xué)家了解基因之間的聯(lián)系和遺傳特征現(xiàn)已公布了1000人的基因組序列個(gè)人基因組測(cè)序是個(gè)性化醫(yī)療保健的基礎(chǔ)

/

GeorgeChurch和他的研究團(tuán)隊(duì)78第78頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四重測(cè)序意義在個(gè)體或群體水平進(jìn)行差異性分析輔助分子育種，能夠快速的進(jìn)行種質(zhì)資源普查篩選遺傳進(jìn)化分析及重要性狀候選基因預(yù)測(cè)遺傳疾病分析79第79頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四RNA是遺傳信息的載體六、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及其應(yīng)用80第80頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)錄組測(cè)序生物信息學(xué)分析內(nèi)容81第81頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四1、應(yīng)用RNA-seq分析葡萄漿果發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組意大利維羅納大學(xué)Vitisvinifera（葡萄）漿果發(fā)育三個(gè)階段中（開花后5周、10周和15周，即著果期、轉(zhuǎn)色期和成熟期三種發(fā)育階段中）的轉(zhuǎn)錄組研究數(shù)據(jù)量超過59M的36至44bp讀長

，82%的測(cè)序序列能夠比對(duì)到基因組上

第一次使用RNA-seq分析葡萄漿果發(fā)育過程中的基因轉(zhuǎn)錄差異

有參考序列82第82頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四應(yīng)用RNA-seq分析葡萄漿果發(fā)育轉(zhuǎn)錄組分析92,051剪切點(diǎn)，大約0.8%剪切點(diǎn)參與385個(gè)基因的可變剪切與葡萄參考基因組（PinotNoir40024）比較，檢測(cè)到85870個(gè)eSNP分析基因的可變剪切83第83頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四應(yīng)用RNA-seq分析葡萄漿果發(fā)育轉(zhuǎn)錄組鑒定了漿果發(fā)育過程中的17324個(gè)基因，其中的6695的基因是以時(shí)期特異性方式表達(dá)的分析漿果發(fā)育過程中的marker基因，表明RNA-seq分析的準(zhǔn)確性84第84頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四中科院上海生命科學(xué)院、北京基因組所和上海交通大學(xué)對(duì)一個(gè)japonica(Nipp)和兩個(gè)

indica(Gla4and93-11)發(fā)芽?jī)芍艿臉悠愤M(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序每個(gè)樣本兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣本測(cè)三次，2×40堿基測(cè)兩次和2×76堿基測(cè)一次第一次運(yùn)用高通量測(cè)序分析轉(zhuǎn)錄組以鑒定外顯子剪切位點(diǎn)2、運(yùn)用RNA-seq對(duì)水稻轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行功能注釋有參考序列85第85頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四運(yùn)用RNA-seq對(duì)水稻轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行功能注釋與參考序列比較，約38.8%~57.3%能夠比對(duì)到基因組的一個(gè)位置上共鑒定了15708個(gè)新的TARs（transcriptionalactiveregions）測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)新的TAR統(tǒng)計(jì)86第86頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四運(yùn)用RNA-seq對(duì)水稻轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行功能注釋約48%的水稻基因具有可變剪切，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以前預(yù)測(cè)的頻率檢測(cè)到參考基因注釋中的83.1%基因6228個(gè)基因的5’和/或3’末端至少比預(yù)測(cè)的延長50bp87第87頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四2、酵母菌-高產(chǎn)機(jī)理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究材料：菌株Spas和Cten策略：1.Spas43.77×；Cten26.9×2.系統(tǒng)進(jìn)化分析、直系同源基因分析；3.不同表型菌株之間共有基因和特有基因分析；4.不同碳源下轉(zhuǎn)錄水平分析（3株木糖發(fā)酵型、1株木糖利用型、1株木糖利用缺陷型）。研究成果組裝結(jié)果：Spas：43.77×，13.1Mb，8個(gè)scaffoldCten：26.9×，10.7Mb，61個(gè)scaffold。14株菌中，和木糖利用相關(guān)的直系同源基因都存在，包括不能利用木糖的菌株；推測(cè)是還有其他輔助因子。篩選獲得10個(gè)備選基因，經(jīng)驗(yàn)證其中兩個(gè)可促進(jìn)菌株生長，另外兩個(gè)可以提高菌株對(duì)木糖的利用率。大部分微生物不能利用半纖維素中的五碳糖。兩株可以用木糖的菌株測(cè)序期望提高生物燃料產(chǎn)量研究意義Wohlbach,etal.ProcNatlAcadSciUSA.2011,108(32):13212-13217.88第88頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)錄組測(cè)序應(yīng)用領(lǐng)域轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究：UTR鑒定、Intron邊界鑒定、可變剪切研究、Startcodon鑒定等基因轉(zhuǎn)錄水平研究全新轉(zhuǎn)錄區(qū)域研究Non-codingRNA研究89第89頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四miRNA是調(diào)控基因表達(dá)的一種普遍方式SmallRNA測(cè)序及其應(yīng)用90第90頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四SmallRNA的生物信息學(xué)分析和應(yīng)用領(lǐng)域分類鑒定：miRNA,siRNA和piRNA和其它SmallRNA注釋新的miRNA預(yù)測(cè)miRNA表達(dá)模式分析共有和特有SmallRNA分析miRNA的表達(dá)模式聚類分析miRNA靶基因預(yù)測(cè)已知miRNA的家族分析SmallRNA的系統(tǒng)識(shí)別和鑒定SmallRNA的進(jìn)化分析SmallRNA參與細(xì)胞分化和發(fā)育的功能分析SmallRNA藥物、biomarker及藥物靶點(diǎn)的研究SmallRNA參與生命調(diào)節(jié)的研究SmallRNA與疾病發(fā)生的關(guān)系91第91頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四俄克拉荷馬州立大學(xué)，生物化學(xué)與分子生物學(xué)系對(duì)逆境條件干旱、高鹽和正常條件下的水稻4周幼苗進(jìn)行miRNA測(cè)序三種處理分別得到102,876、54,016和174,530測(cè)序序列(43003、80990和58781個(gè)miRNAs)1、利用高通量測(cè)序鑒定水稻miRNA92第92頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定水稻miRNA目前水稻中公布的miRNA家族為53個(gè)，鑒定了23種新的miRNA6種新的miRNA為單子葉植物特有的miRNA預(yù)測(cè)了40個(gè)候選miRNA單子葉植物特有的miRNA93第93頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定水稻miRNA預(yù)測(cè)了9種新發(fā)現(xiàn)miRNA的20個(gè)靶點(diǎn)分析miRNA的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)特異性表達(dá)的miRNA，而保守的miRNA是最容易檢測(cè)到的94第94頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四2、利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定花生miRNA山東農(nóng)科院對(duì)正常培養(yǎng)兩周的花生苗的根、莖、葉進(jìn)行smallRNA分析測(cè)序共獲得6005941條測(cè)序序列95第95頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定花生miRNAsmallRNA的長度主要為24bp鑒定了14個(gè)花生特有的新的miRNA和75個(gè)預(yù)測(cè)的miRNA特有的miRNA表達(dá)量低于保守miRNA，其表達(dá)具有組織特異性或者只在特定的發(fā)育階段表達(dá)。SmallRNA長度分布保守的miRNA家族96第96頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四根據(jù)是否具有轉(zhuǎn)錄和翻譯功能可以分為三類第一類是編碼蛋白質(zhì)的基因，它具有轉(zhuǎn)錄和翻譯功能，包括編碼酶和結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)基因以及編碼阻遏蛋