流式細(xì)胞術(shù)分析及應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)分析及應(yīng)用1.流式細(xì)胞術(shù)的原理流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)處理流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備主要內(nèi)容2.流式細(xì)胞儀(FlowCytometer):是集光電子物理，光電測量，計算機，細(xì)胞熒光化學(xué)，單抗技術(shù)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry):利用流式細(xì)胞儀對處于快速流動的細(xì)胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速（每秒可達1000-10000個）的定量分析和分選（純度可達99%以上）的技術(shù)。一、流式細(xì)胞術(shù)的原理3.現(xiàn)代流式細(xì)胞儀包括液流系統(tǒng)聚焦細(xì)胞以供檢測光學(xué)系統(tǒng)

激發(fā)和收集光信號電子系統(tǒng)將光信號轉(zhuǎn)化為電信號，并使其數(shù)字化以供計算機分析

4.液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)將樣本懸液聚焦在光源的中心處5.SampleFlowinOpticalCuvetteSampleLaminar

FlowLowSampleFlowRate12mL/minSheathSheathSampleLaminar

FlowSheathSheathOpticalCuvetteHighSampleFlowRate60mL/min6.樣品和鞘液流7.InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid8.流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)激光(Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長、單一方向、同步的穩(wěn)定光照。激光波長:臺式機為固定波長488nm,635nm，大型機波長譜線寬包括325，457.9，488,514.5，520.8，530.9，568.3，633，647nm光收集系統(tǒng)是由若干組透鏡，濾波片，小孔組成，將產(chǎn)生的光信號引導(dǎo)至檢測器。9.流式細(xì)胞儀的光信號散射光信號熒光信號10.1.散射光信號前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

入射激光的同向散射光信號

細(xì)胞相對大小及其表面積。側(cè)向角散射（SSC,SideScatter）

入射激光90角的散射光信號

細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對復(fù)雜性。11.前向角散射光——FSCFALSSensorLaser12.側(cè)向角散射光——SSCFALSSensor90LSSensorLaser13.散射光散射光能被用來區(qū)分不同細(xì)胞群體的基本形態(tài)上的差異

- 通常使用“散點圖”來看散射光信號

- 散點圖上的一個點就代表一個細(xì)胞顆粒的數(shù)據(jù)14.散點圖——DotPlotlysedwholeblood15.2.熒光信號熒光素吸收激光能量熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為 振動能和熱能 釋放較入射光波長更長的光量子熒光素與特異抗體結(jié)合熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號越強

16.Fluorochromespecification17.Compensation18.二、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞表型分析胞內(nèi)蛋白的檢測細(xì)胞周期分析細(xì)胞因子測定分選細(xì)胞內(nèi)鈣離子測量……19.1.細(xì)胞表型分析20.2.胞內(nèi)蛋白的檢測21.22.3.細(xì)胞周期的檢測23.CFSE（羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂）

24.4.細(xì)胞凋亡的檢測25.1、熒光信號的面積：對熒光光通量進行積分2、DNA指數(shù)(DI)：相對DNA含量=樣品G0/G1細(xì)胞DNA含量平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)二倍體DNA量的平均數(shù)3、異倍體：非二倍體，包括近二倍體、四倍體、多倍體、非整倍體26.凋亡細(xì)胞的特點在形態(tài)上，早期細(xì)胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)顯新月體形、核碎裂；細(xì)胞漿和細(xì)胞器密度增高、細(xì)胞體積變??；細(xì)胞膜皺折卷曲，但早期細(xì)胞膜的完整性未受到破壞凋亡細(xì)胞的FSC降低，SSC增加。細(xì)胞壞死時，細(xì)胞腫脹，F(xiàn)SC增大，SSC也增大27.AnnexinVAssay

28.AnnexinV/PI雙染活細(xì)胞為（AnnexinV-/PI-）壞死細(xì)胞為（AnnexinV+/PI+）凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）29.AnnexinVAssay----能夠區(qū)分死亡與凋亡30.5、細(xì)胞因子測定++Antigen(cytokines)FluorescenceDetectorantibodyCapturebeads

CaptureantibodyBeads31.BeadsProvideaFlexiblePlatformMultiplesizesBeadsprovideanexpandableassayplatformforusewithaflowcytometerDifferentintensitiesDifferentcolorswithdifferentintensities32.MultiplexedBeadsShadesofacolorAntibodycoupledbeads,emittingatdistinctFL3intensitiesVariousanalytesAntibodycoupledPElabel,emittingatFL2intensityproportionaltoanalyteconc.33.Example6-beadassayIL-8IL-1bIL-6IL-10TNFIL-12Capture

BeadsLysateorSupernatantSampleDetectorAntibodiesWashAnalyzeonflowcytometer34.CBAStandardcurves35.6、細(xì)胞分選488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector36.37.

細(xì)胞分選38.三、流式細(xì)胞數(shù)的數(shù)據(jù)處理2.43.44.compensation45.46.分析軟件常用軟件FlowJo

47.Gating1.52.四、流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備單細(xì)胞懸液，避免任何細(xì)胞沉積被檢細(xì)胞或顆粒大小0.2－40um樣品中至少20000個細(xì)胞，濃度105-106個/毫升53.抗體的選擇首選直接標(biāo)記抗體熒光分子PE最強，適用于弱表達抗原

FITC最便宜，適用于強表達抗原間接標(biāo)記：效果有時不太好54.實驗對照的設(shè)計空白對照：陰性對照：常用同型抗體對照單色分析：設(shè)同型抗體對照多色分析：同型對照，單陽性對照（單標(biāo)）同型對照(Isotype)：使用與抗體相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于檢測由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色。陽性對照：檢測陰性時55.表面分子檢測樣品制備將細(xì)胞樣本制成單細(xì)胞懸液，注意懸液內(nèi)不能有粘集，團塊，盡量避免多的細(xì)胞碎片。調(diào)整細(xì)胞濃度為5104-1×105個，用PBS洗兩次，用100ulPBS重懸細(xì)胞。加入適量Fc受體阻斷劑（與抗體匹配的動物的血清或IgG），4℃避光放置30分鐘。加入適量的特異性表面標(biāo)記熒光抗體或獨特型對照抗體，4℃避光放置30分鐘。用PBS洗兩遍，用200ul固定液重懸細(xì)胞，上機檢測。56.胞內(nèi)分子檢測的樣品制備收集細(xì)胞，調(diào)至1×106細(xì)胞/毫升。4%固定液重懸細(xì)胞，常溫或4℃