【課件】探究.實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第2節(jié)

基因工程的基本操作程序第3課時DNA片段的擴增及電泳鑒定第3章

基因工程DNA片段的擴增及電泳鑒定1.利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理：探究·實踐一、實驗原理(1)PCR利用了

原理，通過調(diào)節(jié)

來控制DNA雙鏈的

，PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。(2)PCR擴增DNA片段還利用了

的原理。一次PCR一般要經(jīng)歷

次循環(huán)。DNA的熱變性溫度解聚與結(jié)合DNA半保留復(fù)制305’--3’3’--5’3’--5’5’--3’5’--3’-5’5’-3’--5’5’--3’-5’5’-3’--5’3’--3’高溫變性延伸復(fù)性低溫中溫1次循環(huán)DNA片段的擴增及電泳鑒定2.DNA片段電泳鑒定的原理：(1)帶電粒子：DNA分子具有___________，在一定的pH下，這些基團可以帶上____________。(2)遷移動力與方向：在____的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷_____的電極移動，這個過程就是_____。(3)遷移速度：PCR的產(chǎn)物一般通過

來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與_________、_____________和____等有關(guān)。(4)檢測：凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為______的_______下被檢測出來?？山怆x的基團正電荷或負電荷電泳相反電場凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構(gòu)象探究·實踐一、實驗原理（呈負相關(guān)）瓊脂糖凝膠電泳(1)凝膠濃度：制成的瓊脂糖凝膠是一種帶孔的篩網(wǎng)狀多聚物。凝膠濃度越小，篩孔越大，DNA分子遷移速率就越高；凝膠濃度越大，篩孔越小，DNA分子遷移速率就越低。影響DNA遷移速率的因素(2)DNA分子的大小：當(dāng)凝膠濃度相同時，較大的DNA分子因體積大，所占據(jù)的空間大，在穿過凝膠孔隙時會遇到較大的阻力，穿過孔隙相對困難，遷移速率低。反之，遷移速率就高。因此，電泳一段時間后，較大的DNA分子遷移距離小，離加樣孔近；而較小的DNA分子遷移距離大，離加樣孔遠。相同大小的DNA分子則會聚集在凝膠同一特定的位置上。根據(jù)這一特性，可以把不同大小的DNA分子分離開來。(3)DNA的構(gòu)象:遷移速率：雙螺旋環(huán)狀DNA＞雙螺旋鏈狀DNA＞單鏈DNA。DNA片段的擴增及電泳鑒定探究·實踐二、材料用具1.用具:(1)PCR儀(自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴增)(2)微量離心管(實際上是進行PCR反應(yīng)的場所)(3)微量移液器(用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體)(4)一次性吸液槍頭(微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭)(5)電泳裝置(包括電泳儀、電泳槽等)PCR儀微量移液槍電泳裝置DNA片段的擴增及電泳鑒定探究·實踐二、材料用具2.試劑:(1)4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水。10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μLPCR反應(yīng)體系的配方為保證加入反應(yīng)體系中的各試劑體積的準(zhǔn)確性，建議按照加入體積的大小，由大到小依次加入各試劑，即先加入無菌水。為保護酶的活性，一般最后加入DNA聚合酶。DNA片段的擴增及電泳鑒定探究·實踐二、材料用具2.試劑:(2)電泳緩沖液(TAE或TBE)、凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑——溴酚藍)、瓊脂糖和核酸染料(常用核酸染料為EB即溴化乙錠)等。具體內(nèi)容見P117。EB可插入DNA雙鏈堿基之間，形成EB-DNA復(fù)合物。該復(fù)合物在紫外線激發(fā)下，發(fā)射出紅橙色熒光。EB-DNA復(fù)合物熒光強度與DNA含量成正相關(guān)，根據(jù)熒光強度可粗略地估計樣品中DNA含量。（EB有劇毒）電源+電泳槽瓊脂糖凝膠樣品孔緩沖液—DNA分子可發(fā)生兩性解離，其等電點為pH2-2.5，當(dāng)電泳緩沖液pH大于其等電點時，DNA分子帶負電，當(dāng)電泳緩沖液的pH小于其等電點時，DNA分子帶正電。在常規(guī)的電泳緩沖液中(pH約8.5)，核酸分子帶負電荷，在電場中向正極移動。DNA片段的擴增及電泳鑒定探究·實踐三、實驗步驟1.DNA片段的擴增過程移液用

按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在＿中依次加入各組分。

離心待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約

，使反應(yīng)液集中在離心管的

（提高反應(yīng)速率）。反應(yīng)參照下表的參數(shù)，設(shè)置好

的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進行反應(yīng)?？筛鶕?jù)目的片段長度適當(dāng)調(diào)整延伸時間。微量移液器微量離心管10s底部循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。PCR儀微量移液器使用方法容量設(shè)定吸液槍頭安裝預(yù)洗吸液槍頭吸液放液卸去吸液槍頭應(yīng)采取旋轉(zhuǎn)安裝法，用力不能過猛。先向下按壓推動桿至第一停點，然后將吸液槍頭垂直侵入液面，再平穩(wěn)松開。將吸液槍頭緊貼容器壁，先向下按壓推動桿至第一停點，稍作停頓后再按至第二停點，確保吸液槍頭內(nèi)沒有液體殘留。DNA片段的擴增及電泳鑒定探究·實踐三、實驗步驟2.PCR擴增產(chǎn)物電泳鑒定的過程配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。制備凝膠將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞撸⒉迦牒线m大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜加樣將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物電泳接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相電泳儀電泳槽制好的瓊脂糖凝膠制膠模具梳子梳子留一個加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物DNA片段的擴增及電泳鑒定探究·實踐四、注意事項1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴增不能隨意加大試劑用量。DNA片段的擴增及電泳鑒定探究·實踐五、結(jié)果分析與評價1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結(jié)果。進行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是一條條帶。該片段大小約為750bp。DNA片段的擴增及電泳鑒定探究·實踐五、結(jié)果分析與評價2.你進行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個結(jié)果的可能原因。未出現(xiàn)擴增條帶可能的原因有：①TaqDNA聚合酶失活；②引物出現(xiàn)質(zhì)量問題；③變性時溫度低，變性時間短④Mg2+濃度過低出現(xiàn)非特異性擴增帶可能的原因有：①引物特異性不強或容易聚合成二聚體②復(fù)性時的溫度過低③DNA聚合酶的濃度過高④模板DNA出現(xiàn)污染⑤Mg2+濃度過高對照組設(shè)置項目無關(guān)DNA模板DNA目的DNA引物陽性對照1+—++陽性對照2——++陰性對照1————陰性對照2+——+無關(guān)DNA：不包含目的序列，它和模板DNA在長度、濃度等方面均相近。模板DNA：用于PCR擴增的DNA目的DNA：已知的包含目的序列的片段，可以是重組DNA、基因組DNA等，目的DNA的濃度應(yīng)與模板DNA的濃度相近。陽性對照：用于檢測PCR擴增效率陰性對照：用于檢測是否存在含有目的序列的DNA的污染。凝膠載樣緩沖液溴酚藍和二甲苯青FF是兩種在電場中以預(yù)知速率向正極泳動的染料。溴酚藍呈現(xiàn)藍紫色，與長300bp的雙鏈線狀DNA的遷移速度相同，而二甲苯青FF呈現(xiàn)藍色，與長4kb的雙鏈線狀DNA的遷移速度相同。這兩種指示劑能夠分別顯示300bpDNA和4kbDNA的電泳進程，指示終止電泳的時間。在電泳時，當(dāng)溴酚藍染料移動到距凝膠前沿1~2cm處，要停止電泳。染料的另一個作用是使樣本呈現(xiàn)顏色，完成加樣的加樣孔呈現(xiàn)藍色，未加樣的加樣孔為無色，從而使加樣操作更加便利。樣品密度較小，容易流人附近加樣孔，會造成交叉污染，影響結(jié)果的分析。緩沖液中含有的甘油或蔗糖成分能夠增加