感染性疾病的分子診斷演示

（優(yōu)選）感染性疾病的分子診斷課件現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三感染的慨念

感染是病原體和人體之間的相互作用過程病原微生物：致病菌（條件致病菌）微生物人體微生物人體不同的感染狀態(tài)共生狀態(tài)在正常情況下，人體的一些腔道和體表均有微生物寄生現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三感染性疾病：由某種病原體所致，通過不同方式引起人體發(fā)生感染并出現(xiàn)臨床癥狀的疾病。病原體：病毒、細(xì)菌、原蟲、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲。

現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三常規(guī)檢測(cè)方法：

免疫學(xué)方法微生物學(xué)方法受敏感性、特異性限制，不易早期診斷，并且不易提供病原體分型及耐藥性方面的信息。現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體）：判斷有無(wú)感染是何種病原體感染常用方法：PCR＋雜交完整性策略：檢出病原體分型（分類）－亞型－耐藥性常用方法：雜交、PCR、基因芯片、DNA測(cè)序現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三感染性疾病分子診斷標(biāo)志物病原體核酸分子（DNA/RNA）基因表達(dá)產(chǎn)物代謝物免疫應(yīng)答分子細(xì)胞免疫體液免疫TT致敏T細(xì)胞淋巴因子B漿細(xì)胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出現(xiàn)臨近恢復(fù)期出現(xiàn)與原蟲和蠕蟲感染有關(guān)現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三二、感染性疾病分子診斷的常用方法

根據(jù)目的基因是否被放大，可分為雜交法和擴(kuò)增法。信號(hào)放大技術(shù)檢測(cè)方法

靶分子數(shù)目不變，而檢測(cè)的探針信號(hào)放大

采用多酶、多探針或二者結(jié)合等方法來增加探針標(biāo)志物的濃度使檢測(cè)信號(hào)得到放大。靶分子擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法

靶分子（RNA、DNA或探針）的擴(kuò)增PCR、替代擴(kuò)增、LCR等現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA擴(kuò)增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

圖8-3NASBA原理示意圖

引物A5’端帶有T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，3’端堿基與靶RNA3’端序列互補(bǔ);引物B的堿基序列與cDNA3’端序列互補(bǔ)現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三NASBA的特點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個(gè)反應(yīng)過程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實(shí)性高,其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好。

現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA擴(kuò)增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

圖8-3NASBA原理示意圖

引物A5’端帶有T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，3’端堿基與靶RNA3’端序列互補(bǔ);引物B的堿基序列與cDNA3’端序列互補(bǔ)現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三NASBA的特點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個(gè)反應(yīng)過程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實(shí)性高,其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好。

現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三三、感染性疾病分子診斷的標(biāo)本處理標(biāo)本采集處理主要包括選擇合適的標(biāo)本種類、標(biāo)本量、抗凝劑等及對(duì)標(biāo)本進(jìn)行合適的傳送、保存和預(yù)處理?，F(xiàn)在是14頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三四、感染性疾病分子診斷的結(jié)果解釋1.陰性結(jié)果

假陰性可能性方法的靈敏度太低方法失敗目標(biāo)分子2.陽(yáng)性結(jié)果

假陽(yáng)性可能性方法的特異性受到污染現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三3.定性檢測(cè)結(jié)果

有時(shí)不能提供病原體活力相關(guān)信息臨床治療病情緩解后一定時(shí)間內(nèi)，在患者樣本中仍可以檢測(cè)出相應(yīng)的病原體。有些病原體潛伏在進(jìn)體內(nèi)，沒有臨床癥狀。4.疾病狀況的判斷

檢測(cè)出病原體的存在并不能說此病原體就是引起疾病的直接原因。該病原體可能是一種正常菌群

現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三五、感染性疾病分子診斷的臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià)用于感染性疾病治療的監(jiān)控和預(yù)測(cè)、病情發(fā)展過程的危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)及疾病預(yù)后等。耐藥性的檢測(cè)細(xì)菌的分型流行病調(diào)查現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三第一節(jié)病毒的基因檢測(cè)人類許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、腦炎、流行性感冒等等，占人類傳染疾病的75%左右。400多種不同病毒。病毒結(jié)構(gòu)：大?。?0-300nm

核心區(qū)：核酸（DNA或RNA）外周衣殼：蛋白質(zhì)包膜：脂質(zhì)（鑲嵌有蛋白質(zhì)）現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三

我國(guó)是HBV高流行區(qū)，50%－70%的人受過感染，8%－10%是HBV攜帶者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，導(dǎo)致肝硬變，HBV又與原發(fā)性肝癌密切相關(guān)。外殼（HBsAg):外殼蛋白成分為表面抗原核心（HBcAg)：DNADNA聚合酶

HBcAg一、乙型肝炎病毒現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)HBsAgHBcAgHBVDNADNAPol（外膜蛋白）（核衣殼蛋白）完整的乙肝病毒顆粒直徑42納米由雙層外殼和一個(gè)核心組成的，核心直徑為27納米，內(nèi)含DNA雙鏈和DNA多聚酶現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三（一）病毒基因組結(jié)構(gòu)3.2kb雙鏈DNA病毒不完全雙連環(huán)狀DNA

長(zhǎng)鏈L為負(fù)鏈：有4個(gè)開放閱讀框S、C、P、XS區(qū)編碼外膜蛋白（HBsAg）

C區(qū)編碼HBeAg、HBcAgp區(qū)編碼DNA聚合酶

X區(qū)位編碼X蛋白，可能與病毒蛋白表達(dá)有關(guān)。

短鏈S為正鏈：長(zhǎng)短不一現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三pre-s1

pre-s2S

P

C

pre-c

XHBVDNA3.2kbpre-S1pre-S1蛋白pre-S2

pre-S2蛋白S

HBsAg

pre-C

HBeAg

C

HBcAgPDNAPX

HBxAgHBV基因組結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三HBV基因分型HBV基因序列差異的多少，可將HBV劃分為不同的基因型，至今為止已發(fā)現(xiàn)A、B、C、D、E、F、G、H共8種基因型：A型主要存在于白人，B型和C型主要存在于亞洲人群E型主要存在于西非F型僅見于中南美洲的土著人G型和H型很少見不同基因型序列長(zhǎng)度不同，主要是前S1區(qū)的不同。我國(guó)流行的主要是B和C基因型，長(zhǎng)江以北以C型為主，長(zhǎng)江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有較高比例的D型現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制A(n)mRNAcccDNAHBsAg

包膜負(fù)鏈DNA包裹后的前基因

mRNA傳染性HBV病毒顆粒傳染性HBV病毒顆粒部分雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶肝細(xì)胞現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三（二）分子診斷常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法，即二對(duì)半的檢測(cè)存在窗口期，不易早期診斷。1.PCR

采用普通PCR、FQ-PCR、競(jìng)爭(zhēng)性PCR、免疫雜交PCR，可提供直接、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷證據(jù)。引物是根據(jù)S、C、P、X基因中高度保守序列設(shè)計(jì)，決定擴(kuò)增的特異性和敏感度。現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片斷（bp)

P、X基因5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’2785’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’

C基因5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’4775’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’

C基因5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’2585’-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3’

現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三

有時(shí)為了證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行以下分析：

RLFP

斑點(diǎn)雜交

Southern雜交

現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三2.支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA）原理:①捕獲探針檢測(cè)②靶探針1

體系③靶探針2④bDNA分子:DNA主鏈上結(jié)合多個(gè)側(cè)鏈

現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三捕獲探針固化在微孔板上靶探針1分別與捕獲探針及待測(cè)核酸雜交靶探針2分別與待測(cè)核酸及bDNA雜交形成復(fù)合物：固相支持物捕獲探針靶探針1CEs待測(cè)核酸靶探針2LEsbDNA復(fù)合物現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三分支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(bDNA)現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三信號(hào)檢測(cè)：bDNA可結(jié)合很多酶標(biāo)探針，酶催化底物（1,2-二惡二酮，dioxetane）發(fā)光，使核酸信號(hào)放大，且發(fā)光強(qiáng)度與DNA量成正比。優(yōu)點(diǎn)：放大倍數(shù)確定陽(yáng)性檢出率高穩(wěn)定性和可重復(fù)性好操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，易于普及現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三3.基因芯片技術(shù)

標(biāo)本經(jīng)PCR擴(kuò)增后與芯片上的特異探針進(jìn)行雜交，可以檢測(cè)：是否有病毒感染感染病毒的種類及亞型病毒的耐藥情況特點(diǎn)：可同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三近年來陸續(xù)上市的核苷(酸)類似物對(duì)HBV的治療壓力集中在P區(qū)。干擾素治療對(duì)HBV的壓力主要集中在前C/C區(qū)及前S區(qū)。HBV耐藥突變lamivudineadefovirentecavirtelbivudine現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三YMDD

(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)

HBV對(duì)拉米夫定耐藥是HBVDNA聚合酶突變所致。耐藥基因位點(diǎn)(YMDD)位于聚合酶的C區(qū)(rtM2041或rtM204V)，分別是YMDD中的蛋氨酸(M)被異亮氨酸(I)或纈氨酸(V)所替代，形成YIDD或YVDD變異.拉米夫定作用靶位為HBVDNA聚合酶C區(qū)。有研究表明，拉米夫定與HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的親和力與位于第552位氨基酸側(cè)鏈長(zhǎng)度有關(guān)，異亮氨酸和纈氨酸取代蛋氨酸，使側(cè)鏈氨基酸長(zhǎng)度縮短，使逆轉(zhuǎn)錄酶dNTP結(jié)合區(qū)增大，不適于拉米夫定結(jié)合，從而誘發(fā)耐藥性?，F(xiàn)在是34頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三HBV耐藥檢測(cè)（YMDD突變檢測(cè)方法）現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三YMDD突變檢測(cè)方法1.基因測(cè)序法2.熒光定量PCR方法基本原理確定探針特定的TM值來區(qū)分是否突變常用方法覆蓋突變位點(diǎn)熒光雙探針雜交

YIDDYMDDYVDD46.91℃54.64℃50.74℃現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三（三）臨床意義1.早期診斷免疫學(xué)檢測(cè)敏感性：0.1μg/ml

核酸雜交檢測(cè)敏感性：0.1pg/mlPCR檢測(cè)：0.1fg/ml

因此，在感染早期即可通過DNA檢測(cè)證實(shí)病毒的存在?，F(xiàn)在是37頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三2.監(jiān)測(cè)治療效果:HBVDNA>107拷貝/ml提示病毒復(fù)制活躍；

HBVDNA＜104拷貝/ml治療有一定療效；

HBVDNA＜103拷貝/ml、HBeAg陰轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)氨酶正常為乙型肝炎臨床治愈指標(biāo)；3.判斷病情，指導(dǎo)制定合理的治療方案現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三4.病毒耐藥性的檢測(cè)乙肝病毒DNA聚合酶YMDD處的突變是病毒產(chǎn)生耐藥性的重要原因，通過監(jiān)測(cè)YMDD的突變情況，可以獲得病毒耐藥性方面的信息，指導(dǎo)抗病毒治療?，F(xiàn)在是39頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三二、流行性感冒病毒

流行性感冒病毒(Influenzavirus)，是引起流行性感冒的病原體;分為甲(A)、乙(B)和丙(C)3個(gè)型別;根據(jù)病毒顆粒表面血凝素(Haemagglutinin

，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuramiridase，NA)的抗原性，甲型流感病毒又可分為不同的亞型。甲型流感病毒易發(fā)生變異，致病力強(qiáng)，1918年發(fā)生在西方國(guó)家的大流感殺死了幾千萬(wàn)人，即是由甲型流感病毒引起。

Thereare16differentH

antigens

(H1toH16)andninedifferentNantigens(N1toN9).現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三（一）流感病毒基因組結(jié)構(gòu)

單鏈RNA病毒，RNA為負(fù)鏈；有8個(gè)RNA片段或7個(gè)RNA片段；所有RNA片段5’末端和3’末端高度保守；兩種不同亞型病毒感染宿主時(shí)，會(huì)生成基因重配的新病毒；RNA基因在復(fù)制過程中常會(huì)發(fā)生點(diǎn)突變。

現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三（二）分子診斷方法

可采用RT-PCR、FQ-PCR檢測(cè)流感病毒RNA。引物常按流感病毒保守的非結(jié)構(gòu)基因（NS）的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。為證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性或提高檢測(cè)的靈敏度，可用限制性內(nèi)切酶分析法、斑點(diǎn)雜交法、Southern印跡法進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的分析。

現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片段大小NS基因

5’-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3’190(bp)5’-CCCATTCTCATTACTGCTTC-3’

NS基因

5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)

5’-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3’

現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三（三）臨床意義流感病毒的診斷過去主要靠雞胚羊膜腔培養(yǎng)和血清學(xué)血凝抑制試驗(yàn)，這些方法比較費(fèi)時(shí)，靈敏度低，難以作出早期診斷。

PCR法敏感、特異、簡(jiǎn)便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病學(xué)調(diào)查。

現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三三.人類免疫缺陷病毒（HIV)HIV，humanimmunodeficiencyvirusAIDS，acquiredimmunodeficiencysyndromeHIV為艾滋病的病原體。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三種。1998年底艾滋病感染者和艾滋病患者總數(shù)為3.340萬(wàn)，已死亡1.390萬(wàn)，是全球十大主要死因之一?，F(xiàn)在是46頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識(shí)別攻擊宿主細(xì)胞所必不可少的；其內(nèi)為核衣殼?，F(xiàn)在是47頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三2.基因組結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄病毒，兩個(gè)拷貝的單股正鏈RNA；每個(gè)RNA長(zhǎng)約9.7Kb，有5’帽，3’端有多聚尾；

HIV是一種高度變異的病毒；含有g(shù)ag、env和pol三個(gè)基因以及6種調(diào)控基因tat,vif,vpr,vpx,nef,rev。

現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三①gag基因編碼病毒的核心蛋白；②pol基因編碼病毒復(fù)制所需要的酶類（逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶）；③env基因所編碼病毒包膜蛋白，是HIV免疫學(xué)診斷的主要檢測(cè)抗原。④調(diào)控基因編碼輔助蛋白，調(diào)節(jié)病毒蛋白合成和復(fù)制。

現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三（二）分子診斷方法抗體的檢測(cè)：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和免疫熒光檢測(cè)法（IFA）；感染2周后才能逐漸產(chǎn)生病毒抗體；抗原的檢測(cè)：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)P24抗原，靈敏度低現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三1.病毒載量檢測(cè)感染者體內(nèi)HIV的定量檢測(cè)，對(duì)病情判斷和治療效果檢測(cè)極有價(jià)值。目前常用三種技術(shù)：

RT-PCR最低檢測(cè)限50拷貝/mlbDNA最低價(jià)測(cè)限50拷貝/mlNASBA最低檢測(cè)限20拷貝/ml現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三PCRRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA整合到宿主基因組中復(fù)制，以被感染細(xì)胞DNA為模板PCR擴(kuò)增；

HIV為高變異病毒，不同患者體內(nèi)分離的病毒基因結(jié)構(gòu)有差異，引物設(shè)計(jì)應(yīng)根據(jù)各編碼區(qū)的保守序列設(shè)計(jì)；靈敏度高，特別是用于無(wú)癥狀HIV感染者。

現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片斷（bp)

gag基因5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’3425’-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3’

gap基因5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3’1155’-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3’

pol基因5‘-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3’3605’-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3’

現(xiàn)在是54頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三2.病毒表型和耐藥檢測(cè)HIV表型主要依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶基因突變的檢測(cè)最常用的耐藥檢測(cè)方法是基因型檢測(cè)方法,即查找與病毒耐藥有關(guān)的基因突變。檢測(cè)病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）和蛋白酶（PI）基因的序列，然后把這些結(jié)果與已知的沒有發(fā)生突變的HIV（稱為野生株）基因序列進(jìn)行比較，與之不同的基因序列就認(rèn)為發(fā)生了突變。檢測(cè)出的任何突變都有可能導(dǎo)致形成HIV耐藥性，但具體結(jié)果的解釋必須要有非常有經(jīng)驗(yàn)的專家和醫(yī)師來進(jìn)行?，F(xiàn)在是55頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三（三）臨床意義1.原位雜交：可以顯示病毒感染的部位；2.PCR：可對(duì)無(wú)癥狀的感染者進(jìn)行早期診斷；3.病毒載量檢測(cè)：在臨床進(jìn)展情況的判定及療效觀察上極有價(jià)值。現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三第九章：細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢驗(yàn)概述正常菌群：存在于人體表及與外界相通部位的細(xì)菌；條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類細(xì)菌；病原菌：具有毒性和侵襲力的細(xì)菌，造成人體感染；現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三病原菌的診斷方法：①直接涂片法②生化試驗(yàn)③血清學(xué)試驗(yàn)④分離培養(yǎng)⑤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)⑥分子生物學(xué)：靈敏、特異，可進(jìn)行早期診斷、分型、耐藥性檢測(cè)；不能確診或進(jìn)行分型、耐藥性的檢測(cè)，或費(fèi)時(shí)等現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三

全世界1/5人口感染，每年約300萬(wàn)死于結(jié)核，中國(guó)占70%，免疫低下個(gè)體特別是HIV感染者更易于感染結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲，分枝狀，有莢膜，抗酸染色陽(yáng)性，對(duì)多種抗生素有抵抗力。一.結(jié)核分枝桿菌現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三形態(tài)

現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三(一)基因組結(jié)構(gòu)

1.TBH37Rv株基因組是環(huán)狀雙鏈DNA，共有4411529bp;2.共有4033基因，功能已知的有1734個(gè),1694個(gè)可能為新基因;3.基因組中有許多藥物抗性因子的編碼序列，包括水解酶或者藥物修飾酶。

現(xiàn)在是61頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是63頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三（二）分子診斷方法

普通PCR、FQ-PCR、競(jìng)爭(zhēng)性PCR、免疫雜交PCR

擴(kuò)增靶序列：

65KDa抗原基因（細(xì)菌細(xì)胞壁上蛋白）

MPB蛋白基因（結(jié)核桿菌復(fù)合群特有）

rRNA基因（種屬鑒定）

ISDNA6110插入序列現(xiàn)在是64頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三靶序列引物序列擴(kuò)增片斷（bp）

IS6110插入5‘-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3’3175’-TCAGCCGCGTCCACGCCGCCA-3’

16SrRNA5’-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3’4635’-TGCACACAGGCCACAAGGGA-3’

DNA重復(fù)序列5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3’2455’-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3’

現(xiàn)在是65頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三TB耐藥檢測(cè)利福平耐藥-RNA聚合酶rpoB基因異煙肼耐藥-katG基因鏈霉素耐藥-S12的rpsL基因

16SrRNA的rrs基因喹諾酮的耐藥-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因水解酶或藥物修飾酶（β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶和藥物外排系統(tǒng)等）現(xiàn)在是66頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三細(xì)菌耐藥基因的檢測(cè)

細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致治療失敗、感染復(fù)發(fā)、增加昂貴抗生素的使用。機(jī)理：由于細(xì)菌基因組的變異，導(dǎo)致

1.細(xì)菌細(xì)胞外膜通透性改變；

2.產(chǎn)生滅活酶和鈍化酶，如-內(nèi)酰胺酶；

3.藥物作用靶位改變；

4.代謝途徑改變；現(xiàn)在是67頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三（三）臨床意義1.準(zhǔn)確、快速、早期診斷TB2.區(qū)分TB與其它分枝桿菌3.疫情監(jiān)控和抗癆治療療效的評(píng)價(jià)

現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三二、淋球菌

淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌的唯一自然宿主。淋病在我國(guó)性傳播疾病種中，發(fā)病率居首位。淋球菌耐藥菌株的出現(xiàn)和流行對(duì)淋病的控制帶來很大困難。傳播途徑：1.直接性接觸感染

2.間接接觸感染

現(xiàn)在是69頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是70頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三（一）基因組結(jié)構(gòu)

1.染色體分子量980M，可編碼約5000個(gè)基因，GC含量為50%；

2.無(wú)操縱子結(jié)構(gòu)

3.含有1至數(shù)個(gè)質(zhì)粒（2.6MDa，24.5MDa），通過質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥性在不同菌株間的轉(zhuǎn)移；

現(xiàn)在是71頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是72頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三（二）分子診斷1.PCR:

擴(kuò)增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結(jié)構(gòu)基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時(shí)存在于染色體及質(zhì)粒上）

現(xiàn)在是73頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三靶序列引物序列擴(kuò)增片斷（bp）

CPPB基因5’-GTTTGGCTGGTTGATTCAAG-3’6335’-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3’

外膜蛋白Ⅲ5’-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3’4945’-TTTTCACATCTACGCGGCGG-3’

5’-CCGAAGCTCAAGACAACCTC-3’

181現(xiàn)在是74頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三2.LCR（Ligasechainreaction

）連接酶鏈反應(yīng)(Ligasechainreaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)，主要用于點(diǎn)突變的研究及靶基因的擴(kuò)增.

現(xiàn)在是75頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三原理：在PCR反應(yīng)體系中加入二對(duì)引物，加熱(94～95℃)使DNA變性，雙鏈打開，然后降溫退火(65℃)，引物與模板DNA結(jié)合并留下一缺口，如果引物與模板完全互補(bǔ)，DNA連接酶即連接封閉缺口，PCR反應(yīng)接著進(jìn)行，擴(kuò)增出大量的目標(biāo)DNA.若有點(diǎn)突變，引物不能與模板精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接酶不能封閉缺口，PCR反應(yīng)不能進(jìn)行，無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物生成，據(jù)此可判斷模板DNA中有無(wú)突變.現(xiàn)在是76頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是77頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三（三）臨床意義

1.分子診斷技術(shù)具有靈敏性高、快速、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，可檢測(cè)極微量的淋球菌。2.應(yīng)用于以下幾方面：對(duì)菌株進(jìn)行分型和耐藥性分析?？股刂委熜Ч挠^察。進(jìn)行流行病學(xué)分析。對(duì)疑似病例的診斷和鑒別診斷?，F(xiàn)在是78頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三衣原體的基因檢測(cè)

衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過細(xì)菌濾器，專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的一類原核生物。沙眼衣原體是一種在人體內(nèi)長(zhǎng)期生存并又廣泛傳播的病原體，常導(dǎo)致人泌尿生殖道疾病及眼病，有15種血清型?，F(xiàn)在是79頁(yè)\一共有88頁(yè)\編輯于星期三一、基因組沙眼衣原體（血清型D）基因組大小1042Kbp，GC含量為41.3%，另有一個(gè)7493bp的質(zhì)粒，整個(gè)基因組有894個(gè)蛋