基因工程的原理課件

第一節(jié)基因工程的原理乳汁中含有人生長(zhǎng)激素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷)基因工程的概念基因工程的別名基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過(guò)程結(jié)果

基因工程是指按照人們的愿望，將一種生物的基因在體外剪切，并與特殊的運(yùn)載工具進(jìn)行拼接，然后導(dǎo)入另一種生物體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，并使之表達(dá)產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的技術(shù)。定向的改造生物的遺傳性狀。DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)生物體外基因DNA分子水平剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)定向的改造了生物的性狀_________________的培育成功，宣告了基因工程的誕生。雙重抗性大腸桿菌轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉抗蟲(chóng)棉普通棉一、基因手術(shù)刀：限制性?xún)?nèi)切酶二、基因縫紉針：DNA連接酶三、基因運(yùn)輸車(chē)：載體探究1：基因工程的基本工具是什么？（1）識(shí)別特定的脫氧核苷酸序列（回文序列）；（2）并在特異性位點(diǎn)把雙鏈DNA分子“切割”開(kāi)。主要從原核生物中分離純化一、基因手術(shù)刀：限制性?xún)?nèi)切酶1、來(lái)源：2、功能：3、酶切結(jié)果：形成黏性末端。4、作用實(shí)質(zhì)：特定部位的磷酸二酯鍵（酶切位點(diǎn)）斷開(kāi)

EcoRⅠ黏性末端黏性末端識(shí)別特定的脫氧核苷酸序列的特點(diǎn)：中軸線(xiàn)兩側(cè)的堿基反向?qū)ΨQ(chēng)重復(fù)排列的回文序列。切割的位點(diǎn)：G、A之間斷裂的化學(xué)鍵是：磷酸二酯鍵AB限制酶作用是A處還是B處？A處T1234512345A思考：某DNA分子被限制性?xún)?nèi)切酶Ⅰ切后形成1個(gè)DNA片段，有1000個(gè)堿基對(duì)，該DNA分子若被限制性?xún)?nèi)切酶Ⅱ切后形成2個(gè)DNA片段，分別有600個(gè)堿基對(duì)和400個(gè)堿基對(duì)，若該DNA分子同時(shí)被限制性?xún)?nèi)切酶Ⅰ和Ⅱ切割后形成2種DNA片段，分別有600個(gè)堿基對(duì)和200個(gè)堿基對(duì)。問(wèn)：該DNA分子有何特點(diǎn)？限制性?xún)?nèi)切酶Ⅰ有幾個(gè)酶切位點(diǎn)？限制性?xún)?nèi)切酶Ⅱ有幾個(gè)酶切位點(diǎn)？該DNA為環(huán)狀1個(gè)2個(gè)GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCG雙鏈斷開(kāi)不同來(lái)源的DNA片段結(jié)合可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵GCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG二、基因縫紉針：DNA連接酶GCTTAAAATTCG二、基因縫紉針：DNA連接酶DNA連接酶與DNA聚合酶比較DNA聚合酶DNA連接酶相同不同作用對(duì)象模板形成磷酸二酯鍵單個(gè)脫氧核苷酸DNA片斷需要不需要（1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；（2）具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接；（3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)篩選運(yùn)載體是否進(jìn)入受體細(xì)胞。（如熒光蛋白基因、抗四環(huán)素基因、抗氨芐青霉素基因）（4）對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害質(zhì)粒，λ噬菌體的衍生物，動(dòng)植物病毒等三、基因運(yùn)輸車(chē)：載體2、載體必須具備的條件：1、常用的載體有：常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有限制性?xún)?nèi)切酶切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別1、關(guān)于限制酶的說(shuō)法中，正確的是（）A、限制酶是一種酶，只識(shí)別GAATTC堿基序列B、EcoRI切割的是G—A之間的氫鍵C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中課堂鞏固2、DNA連接酶催化的反應(yīng)是()A．DNA復(fù)制時(shí)母鏈與子鏈之間形成氫鍵B．黏性末端堿基之間形成氫鍵C．兩個(gè)DNA片段黏性末端之間的縫隙的連接D．A、B、C都不正確3、作為基因的運(yùn)輸工具——載體，必須具備的條件及理由是()A、能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保存下來(lái)并大量復(fù)制，以便提供大量的目的基因B、具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便于目的基因的表達(dá)C．具有某些標(biāo)記基因，以便為目的基因的表達(dá)提供條件D、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存，以便于進(jìn)行篩選4、質(zhì)粒是基因工程最常見(jiàn)的載體，它的主要特點(diǎn)是()①能自主復(fù)制 ②不能自主復(fù)制 ③結(jié)構(gòu)很小 ④是蛋白質(zhì) ⑤是環(huán)狀RNA ⑥是環(huán)狀DNA ⑦能“友好”地“借居”A、①③⑤⑦B、②④⑥C．①③⑥⑦D．②③⑥⑦（1）識(shí)別_____的脫氧核苷酸序列；（2）并在___________把雙鏈DNA分子“切割”開(kāi)。切開(kāi)的化學(xué)鍵為_(kāi)__________，形成___________。主要從_____生物中分離純化

一、基因手術(shù)刀：__________1、來(lái)源：2、功能：

二、基因縫紉針：_________1、功能：恢復(fù)被限制性?xún)?nèi)切酶切開(kāi)了的__________。2、DNA連接酶與DNA聚合酶比較有何異同？三、基因運(yùn)輸車(chē)：_______2、載體必須具備的條件？1、常用的載體有：________溫故知新原核特定回文特異性位點(diǎn)磷酸二酯鍵限制性?xún)?nèi)切酶DNA連接酶載體磷酸二酯鍵質(zhì)粒黏性末端下圖為DNA分子的切割和連接過(guò)程。(1)EcoRI是一種

酶，其識(shí)別序列是

，切割位點(diǎn)是

與

之間的

鍵。切割結(jié)果產(chǎn)生的DNA片段末端形式為

。(2)不同來(lái)源DNA片段結(jié)合，在這里需要的酶應(yīng)是

，此酶的作用是在

與

之間形成

鍵，而起“縫合”作用的。限制性?xún)?nèi)切GAATTC鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸

腺嘌呤脫氧核苷酸

磷酸二酯黏性末端DNA連接酶鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸

腺嘌呤脫氧核苷酸

磷酸二酯①分離程序：用限制性?xún)?nèi)切酶將完整的DNA分子切成適當(dāng)長(zhǎng)度的片段，然后通過(guò)檢測(cè)的方法挑選出所需要的基因。用限制酶切斷成許多片段a.鳥(niǎo)槍法(散彈射擊法）核酸探針：是用放射性同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的核酸單鏈，具有非常特意的核苷酸序列，能與DNA互補(bǔ)鏈結(jié)合，可用于特定的基因檢測(cè)。②檢測(cè)方法：應(yīng)用核酸探針③擴(kuò)增：用PCR儀擴(kuò)增b.反轉(zhuǎn)錄法c.化學(xué)合成法雙鏈DNA(即目的基因)合成單鏈DNA(cDNA)目的基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA的核苷酸序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列化學(xué)合成推測(cè)推測(cè)目的基因質(zhì)粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA二、重組載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種限制酶目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。二、重組載體的構(gòu)建二、重組載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的組成：b、目的基因a、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因e、復(fù)制原點(diǎn)1、1997年，科學(xué)家將動(dòng)物體內(nèi)的能夠合成胰島素的基因與大腸桿菌的DNA分子重組，并且在大腸桿菌中表達(dá)成功。請(qǐng)據(jù)右下圖回答問(wèn)題。(1)此圖表示的是采取__________合成基因的方法獲取__________基因的過(guò)程。(2)圖中①DNA是以為_(kāi)________模板，形成單鏈DNA，在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得了所需要的目的基因。(3)圖中③代表

，它往往含

基因，以便對(duì)目的基因的檢測(cè)。人工目的

信使RNA

重組DNA分子

標(biāo)記

受體細(xì)胞導(dǎo)入方法微生物細(xì)胞Ca處理法動(dòng)物受精卵顯微注射法植物體細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法植物受精卵花粉管通道法、基因槍法轉(zhuǎn)化——目的基因?qū)隷________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)三、重組載體的導(dǎo)入和篩選2+

大腸桿菌細(xì)胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是:（1）將細(xì)菌用CaCl2處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。（2）使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。（3）目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非常快，在很短的時(shí)間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。

農(nóng)桿菌介轉(zhuǎn)化法（導(dǎo)入植物體細(xì)胞）花粉管通道法（導(dǎo)入植物受精卵）顯微注射法（導(dǎo)入動(dòng)物受精卵）篩選出獲得目的基因的重組細(xì)胞四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因通過(guò)轉(zhuǎn)化，有的細(xì)胞可能導(dǎo)入了重組載體，利用選擇性培養(yǎng)基就可以把它們篩選出來(lái)。1、基因表達(dá)基因表達(dá)指基因組中某基因在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄為mRNA和翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程。基因表達(dá)的改變預(yù)示著細(xì)胞在分子水平上的變化。它往往是細(xì)胞形態(tài)功能變化之前的變化。DNARNAProtein轉(zhuǎn)錄翻譯四、目的基因的表達(dá)和鑒定基因工程成功的標(biāo)志：目的基因表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的性狀——檢查是否成功四、目的基因的表達(dá)和鑒定從蘇云金芽苞桿菌中提取抗蟲(chóng)基因從土壤農(nóng)桿菌中提取帶有選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒同一種限制酶處理抗蟲(chóng)基因與質(zhì)粒結(jié)合形成重組質(zhì)粒將重組質(zhì)粒導(dǎo)入土壤農(nóng)桿菌(農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入)篩選將土壤農(nóng)桿菌與棉花細(xì)胞混合培養(yǎng)侵染重組質(zhì)粒將抗蟲(chóng)基因?qū)朊藁?xì)胞并整合到棉花的DNA上植物組織培養(yǎng)獲得抗蟲(chóng)棉抗蟲(chóng)棉的培育流程圖基因工程的基本原理概念圖下圖為利用生物技術(shù)獲得動(dòng)物乳腺反應(yīng)器和抗蟲(chóng)棉的過(guò)程，據(jù)圖回答：⑴在基因工程中，A表示

，如果直接從蘇云金桿菌中獲得抗蟲(chóng)基因，①過(guò)程使用的酶區(qū)別于其他酶的特點(diǎn)是

，B表示

。

⑵在研究過(guò)程中，研究人員首先從相關(guān)基因組中獲取了目的基因，并采用

技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行了擴(kuò)增，然后將目的基因與質(zhì)粒等載體組合形成了重組載體。在重組載體的構(gòu)建過(guò)程中需要的工具酶

。

目的基因識(shí)別特定的核苷酸序列，并且在特定的位點(diǎn)上切割DNA分子重組DNA

PCR

限制性?xún)?nèi)切酶、DNA連接酶

⑶基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心，一個(gè)完整的基因表達(dá)載體至少包括哪些部分?

。

⑷將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過(guò)程中，在③過(guò)程中一般是采用

方法，在②過(guò)程中一般采用

方法，受體細(xì)胞一般是

。

⑸由于轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物存在于山羊的乳汁中，檢測(cè)其體內(nèi)是否出現(xiàn)藥用蛋白，在分子水平上的檢測(cè)方法及結(jié)果是什么?

。

⑹要確定目的的基因（抗蟲(chóng)基因）導(dǎo)入棉花細(xì)胞后，是否能穩(wěn)定遺傳并表達(dá)，需進(jìn)行檢測(cè)和鑒定工作，請(qǐng)寫(xiě)出在個(gè)體水平上的鑒定過(guò)程：

。目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等部分

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)受精卵

進(jìn)行抗原—抗體雜交

如果出現(xiàn)雜交帶，表明奶牛中出現(xiàn)了抗原蛋白；不出現(xiàn)雜交帶，表明奶牛中未出現(xiàn)抗原蛋白讓害蟲(chóng)吞食棉花葉，觀察害蟲(chóng)是否具有抗蟲(chóng)性狀1.下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作的名詞及對(duì)應(yīng)的內(nèi)容，正確的組合是 2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫(kù)中提?、蹚氖荏w細(xì)胞中提取④利用PCR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥3.細(xì)菌的質(zhì)粒分子帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是

A．提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性B．有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè)C．增加質(zhì)粒分子的分子量D．便于與外源基