分子生物學緒論第一章a課件

分子生物學

MolecularBiology2009.2緒論

Introduction何為“分子生物學”？是在分子水平上研究生命本質(zhì)的一門新興的邊緣學科，是生物學研究從宏觀發(fā)展到微觀而形成的。終極目標是要了解所有生物學現(xiàn)象的分子本質(zhì)。是當前生命科學中發(fā)展最快并正在與其它學科廣泛交叉與滲透的重要前沿領(lǐng)域。分子生物學的研究對象生物大分子核酸蛋白質(zhì)多糖脂類它以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)及其在遺傳信息和細胞信息傳遞中的作用為研究對象。第一章遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)--DNADNA一級結(jié)構(gòu)DNA二級結(jié)構(gòu)DNA三級結(jié)構(gòu)脫氧核糖核苷酸

3’,5’-磷酸二酯鍵

線狀或環(huán)狀DNA的一級結(jié)構(gòu)實際上就是DNA分子內(nèi)堿基的排列順序。重復(fù)序列（repetitivesequence）高度重復(fù)序列中度重復(fù)序列低度重復(fù)序列1、高度重復(fù)序列重復(fù)頻率高，幾十萬到幾百萬次；重復(fù)序列較短，5～300bp，多數(shù)為5～15bp；有些是反向重復(fù)序列。衛(wèi)星DNA回文結(jié)構(gòu)palindrome2、中度重復(fù)序列重復(fù)頻率和重復(fù)序列長度差異大；有些成串集中排列，有些與單拷貝序列間隔排列；有些是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因；一般有種的特異性，可作為探針，區(qū)分不同種間細胞DNA。差異大種的特異性3、低度重復(fù)序列序列不重復(fù)或只重復(fù)幾次、十幾次；重復(fù)序列長度>1000bp；攜帶大量能編碼功能蛋白質(zhì)的遺傳信息。又稱單拷貝序列TheDoubleHelix(1953)ThefoundationofmolecularbiologyFrancisH.CrickJamesD.Watson

氫鍵堿基堆積力DNA分子結(jié)構(gòu)狀態(tài)的維持是四種作用力相互競爭的結(jié)果靜電斥力疏水力有利于維持雙螺旋結(jié)構(gòu)不利于維持雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA二級結(jié)構(gòu)的多態(tài)性除B-DNA外，人們還發(fā)現(xiàn)到了其它的結(jié)構(gòu)參數(shù)有一定差異的DNA，如A-DNA,Z-DNA，三鏈和四鏈DNA等，這一現(xiàn)象稱為DNA結(jié)構(gòu)的多態(tài)性（polymorphism）。三鏈DNA分子間的三螺旋DNA分子內(nèi)的三螺旋DNA平行的三螺旋結(jié)構(gòu)R-DNAA-DNA：周堿基數(shù)可變DNAZ-DNA：左旋DNA雙鏈DNADNA三螺旋結(jié)構(gòu)中的第三條鏈與第一條鏈的序列和方向均相同，這種的DNA叫R-DNA。四鏈DNAG–四聯(lián)體螺旋：含有端粒重復(fù)序列的單鏈寡核苷酸可以形成四聯(lián)體螺旋結(jié)構(gòu)。DNA結(jié)構(gòu)的動態(tài)性不同DNA結(jié)構(gòu)形式相互轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，稱為DNA結(jié)構(gòu)的動態(tài)性。DNA基本結(jié)構(gòu)：B型天然DNA分子中，以B型結(jié)構(gòu)為主在這個分子的某些區(qū)段會出現(xiàn)A、Z型，甚至三鏈、四鏈。這些不同的結(jié)構(gòu)處于動態(tài)變化中DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)是指DNA雙螺旋進一步扭曲盤繞所形成的構(gòu)象，包括線形雙鏈中的紐結(jié)、超螺旋、多重螺旋、分子內(nèi)局部單鏈環(huán)和環(huán)狀DNA中的超螺旋及連環(huán)等拓撲學性質(zhì)。三、DNA三級結(jié)構(gòu)超螺旋結(jié)構(gòu)（最常見）生物學意義1、超螺旋DNA形狀更緊密，在DNA組裝中有重要作用；2、超螺旋程度的改變介導(dǎo)了DNA結(jié)構(gòu)的變化，有利于功能的發(fā)揮；3、超螺旋DNA能實現(xiàn)松弛態(tài)DNA所不能實現(xiàn)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。四、DNA的變性、復(fù)性與雜交DNA的變性（denaturation）在物理和化學因素的影響下，維系核酸二級結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA雙鏈解旋成單鏈，這一過程稱為DNA的變性。判斷：1、核酸的變性可發(fā)生在整個DNA分子中，也可發(fā)生在局部的雙螺旋節(jié)段上（局部變性）。2、DNA變性不涉及核苷酸中二酯鍵的斷裂。3、引起變性的因素有酸、堿、尿素、胍等變性劑和乙醇、丙酮等化學因素以及熱、紫外線等物理因素。4、變性后的DNA其一系列的物理、化學性質(zhì)都發(fā)生變化，如260nm處紫外吸收值降低，粘度下降，沉降速度增加，浮力密度上升等。5、熔解曲線的中點，即一半的DNA雙螺旋解為單鏈所對應(yīng)的溫度稱為熔解溫度或解鏈溫度。6、每一種DNA都有一個解鏈溫度，Tm值是一個固定常數(shù)。增色效應(yīng)同一種DNA分子在不同離子強度溶液中其Tm值不同變性的DNA重新恢復(fù)為雙螺旋的過程，叫做復(fù)性或退火。DNA的復(fù)性（renaturation）分子碰撞時間長核心作用時間短拉拉鏈作用限制因素復(fù)性機制①一定的鹽濃度②適宜的溫度ＤＮＡ復(fù)性的條件有哪些？為什么？復(fù)性是分子雜交的理論基礎(chǔ)核酸分子雜交Nucleicacidhybridization親緣關(guān)系很近的不同來源的DNA單鏈或RNA單鏈與DNA單鏈之間通過堿基互補形成雜交分子的過程,叫做核酸分子雜交。DNA/DNADNA/RNA根據(jù)核酸分子雜交的原理，有目的地人工制備或從基因組中分離一段已知序列的DNA，使其帶上標記，經(jīng)變性后成為單鏈，在一定條件下與待測DNA單鏈雜交，如兩者序列有同源性，就形成帶有標記的雙鏈DNA分子，即檢測到了待測的DNA。這段帶有標記的核苷酸序列稱為核酸探針或基因探針（Geneprobe）。核酸探針（Nucleicacidprobe）常用的核酸分子雜交方法Southern印跡雜交（Southernbloting）Northern印跡雜交（Northernbloting）斑點雜交（dotblotting）原位雜交（insituhybridization）五、DNA序列分析及進展DNA序列分析技術(shù)是揭開生命奧秘的一把金鑰匙吳瑞士引物-延伸測序策略1971年首次成功地測定了λ噬菌體兩個粘性末端的完整序列。F.Sanger末端終止法K.MullisPCRM.Smith堿基定點突變技術(shù)Sanger法1、基本原理Sanger雙脫氧末端終止法利用脫氧核苷三磷酸（dNTP）的類似物雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）取代正常的底物。在DNA合成反應(yīng)中除了加入4種正常dNTP外，再加入1種少量的ddNTP，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列長短不一的核苷酸鏈。在4組獨立的核苷酸反應(yīng)中，分別加入4種不同的ddNTP，結(jié)果生成4組核苷酸鏈，它們分別終止于每一個A、T、C、G的位置上。對這4組核苷酸進行聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個核苷酸的單鏈DNA，可讀出序列。2、反應(yīng)原理ddNTP可以在DNA聚合酶作用下和多核苷酸鏈的3’羥基形成磷酸二酯鍵，但卻不能再與下一個核苷酸縮合，結(jié)果使得多核苷酸鏈的延伸終止。ddNTP的作用方法過程ddNTP與dNTP聚丙烯酰胺凝膠電泳

DNA聚合酶單鏈DNA模板單鏈寡核苷酸引物

Mg2+4種dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP)4種ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)3、反應(yīng)體系DNA序列測定策略1、定向測序是從大片段DNA的一端開始按順序進行分析。2、隨機測序又稱鳥槍策略(shotgunstrategy)，是將人類基因組DNA用機械方法隨機切割成2Kb左右的小片段，把這些DNA片段裝入適當載體，建立亞克隆文庫，從中隨機挑取克隆片段。最后通過克隆片段的重疊組裝確定大片段DN