碩士研究課現(xiàn)代分子生物學(xué)Molecularapproachesinbioremediation胡忠課件

Molecularapproachesinbioremediation

Bioremediation廣義的生物修復(fù)，指一切以利用生物為主體的環(huán)境污染的治理技術(shù)。它包括利用植物、動(dòng)物和微生物吸收、降解、轉(zhuǎn)化土壤和水體中的污染物，使污染物的濃度降低到可接受的水平，或?qū)⒂卸居泻Φ奈廴疚镛D(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)，也包括將污染物穩(wěn)定化，以減少其向周邊環(huán)境的擴(kuò)散。一般分為植物修復(fù)、動(dòng)物修復(fù)和微生物修復(fù)三種類型。狹義的生物修復(fù)，是指通過(guò)微生物的作用清除土壤和水體中的污染物，或是使污染物無(wú)害化的過(guò)程。它包括自然的和人為控制條件下的污染物降解或無(wú)害化過(guò)程。生物修復(fù)技術(shù)與其他工程措施相比,具有費(fèi)用低、就地處理、對(duì)周圍環(huán)境干擾少等許多優(yōu)點(diǎn)。本文綜述了分子方法在生物修復(fù)中的應(yīng)用，著重于根際修復(fù)（rhizoremediation）及其在降解含氯乙烯（chlorinatedethenes）中的應(yīng)用。

Proteinengineering

定向進(jìn)化（Directedevolution）是近20年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，是達(dá)爾文的進(jìn)化論思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和應(yīng)用。它不需要深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)室條件下人工模擬生物大分子自然進(jìn)化過(guò)程，在體外對(duì)基因進(jìn)行隨機(jī)誘變，使基因發(fā)生大量變異，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變體，從而可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)自然界幾百萬(wàn)年才能完成的進(jìn)化過(guò)程。

易錯(cuò)PCR是一種簡(jiǎn)便快速地在DNA序列中隨機(jī)制造突變的方法，它通過(guò)改變傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系中某些組分的濃度，使堿基在一定程度上隨機(jī)錯(cuò)配而引入多點(diǎn)突變。本法的關(guān)鍵在于選擇適當(dāng)?shù)耐蛔冾l率，當(dāng)突變頻率太高時(shí)，幾乎無(wú)法篩選到有益突變；若突變頻率太低，野生型將占據(jù)突變?nèi)后w的優(yōu)勢(shì)，也很難篩選到理想的突變體。費(fèi)力、費(fèi)時(shí)，且易出現(xiàn)同型堿基轉(zhuǎn)換1994年,Stemmer在Nature發(fā)表了一篇題為RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling的文章,首次提出了DNA改組(DNAshuffling)技術(shù)。Stemmer以β-內(nèi)酰胺酶系統(tǒng)為試驗(yàn)對(duì)象,用DNA改組,經(jīng)過(guò)三輪篩選和兩次回交得到一新菌株,其頭孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制濃度比原始菌株提高了32,000倍,也遠(yuǎn)高于易錯(cuò)PCR的突變篩選結(jié)果。DNA改組是基因在分子水平上進(jìn)行的有性重組，是一種反復(fù)性突變、重組的過(guò)程。主要包括以下步驟：（1）目的DNA片段的獲得；（2）目的基因的隨機(jī)片段化，即將目的基因（可以是單個(gè)基因或一組相關(guān)基因）酶切成隨機(jī)片段，這些隨機(jī)片段集合包含了來(lái)自不同的同源序列的寡核苷酸，這些寡核苷酸具有不同的3’末端，從而為下一步的無(wú)引物PCR提供了條件；（3）無(wú)引物PCR，即具有互補(bǔ)3’末端的寡核苷酸互為引物，各為模板，通過(guò)不斷的PCR循環(huán)，在不同模板上隨機(jī)互補(bǔ)結(jié)合并進(jìn)一步延伸；（4）有引物PCR，即以上輪無(wú)引物PCR的產(chǎn)物為模板，加入基因兩端序列為引物，經(jīng)過(guò)多輪PCR得到重排產(chǎn)物的集合，稱為突變文庫(kù)；（5）克隆、篩選、分析及多輪篩選，即進(jìn)一步對(duì)突變文庫(kù)進(jìn)行篩選，選擇改良的突變體組成下一輪改組的模板，重復(fù)上述步驟進(jìn)行多次重排和篩選，最終獲得性狀比較理想的突變體。與常規(guī)突變技術(shù)相比，DNA改組有以下顯著優(yōu)點(diǎn)：①DNA改組可在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)重組有效的突變體發(fā)掘所有可能的重組體與突變序列，從而大大加快進(jìn)化速度；而且對(duì)可操作的靶序列沒(méi)有任何要求，長(zhǎng)度可以達(dá)到幾十kb；②通過(guò)多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導(dǎo)致功能的明顯提高；③DNA改組從表型上早期進(jìn)行選擇，而不必了解DNA片斷上序列的信息，簡(jiǎn)化了操作程序；④DNA改組比隨機(jī)突變顯著提高了良性突變的概率。研究表明，DNA改組比隨機(jī)突變具有較大的優(yōu)勢(shì)，隨機(jī)突變的方法一般產(chǎn)生1%的良性突變，但DNA改組可產(chǎn)生13%的良性突變。點(diǎn)飽和突變技術(shù)(site-saturationmutagenesis),是通過(guò)對(duì)目的蛋白的編碼基因進(jìn)行改造,短時(shí)間內(nèi)獲取靶位點(diǎn)氨基酸分別被其它19種天然氨基酸所替代的突變子。它不是定點(diǎn)突變技術(shù)的簡(jiǎn)單延伸,而是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)理念的全面升華,廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)改造及結(jié)構(gòu)—功能關(guān)系研究中,并取得了一系列令人矚目的成績(jī)。如利用點(diǎn)飽和突變技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)功能位點(diǎn),提高酶比活力,改善酶熱穩(wěn)定性、底物結(jié)合特異性及立體異構(gòu)特異性等多方面性質(zhì)。目前已發(fā)展了多種點(diǎn)飽和突變方法,主要有以下幾種：1、寡核苷酸定向誘變(oligonucleotide-directedmutagenesis)該方法于上世紀(jì)70年代末建立,將目的基因克隆到噬菌體M13單鏈表達(dá)載體上,然后合成一段在靶位點(diǎn)處含突變寡核苷酸的引物,使其與目的基因配對(duì),再加入四種dNTP和KlenowDNA聚合酶,使寡聚核苷酸引物延伸成全長(zhǎng)基因,獲得的重組雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)染細(xì)菌后大量復(fù)制,進(jìn)而篩選出陽(yáng)性突變子。該法突出優(yōu)點(diǎn)是:目的基因可插入到噬菌體衣殼蛋白編碼基因內(nèi),通過(guò)噬菌體表面展示技術(shù)可方便地篩選出重組子。不足之處是:(1)對(duì)19種氨基酸須分別設(shè)計(jì)各自寡核苷酸引物,費(fèi)用較大;(2)大腸桿菌宿主細(xì)胞存在自身修復(fù)系統(tǒng),因突變修復(fù)而難以篩選出突變子;(3)不適合多點(diǎn)飽和突變。2、盒式誘變(Cassettemutagenesis)該法利用一種含有突變靶位點(diǎn)和特殊酶切位點(diǎn)序列的密碼子盒(codoncassette)來(lái)引入突變序列。由于密碼子盒可從正反兩方向插入目的基因,因此只須11種密碼子盒就可替換產(chǎn)生全部20種氨基酸以達(dá)到點(diǎn)飽和突變的效果。該法突出優(yōu)點(diǎn)是:一個(gè)靶位點(diǎn)兩側(cè)的酶切位點(diǎn)經(jīng)過(guò)改造可替換成其它氨基酸,相對(duì)于寡核苷酸定向誘變而言節(jié)省了引物合成的費(fèi)用,而且可對(duì)多個(gè)非鄰近位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行點(diǎn)飽和突變。不足之處是:(1)每個(gè)靶位點(diǎn)兩側(cè)需分別設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn);(2)密碼子盒兩端存在重復(fù)序列,因自連而增加突變子篩選難度。2）、重疊延伸PCR(genesplicingbyoverlapextension)設(shè)計(jì)一對(duì)兼并引物,使其在靶位點(diǎn)附近有一定程度的重疊(圖2中的B、C引物),分別與基因5′和3′端引物(圖2中的A、D引物)組合,擴(kuò)增含突變靶位點(diǎn)的上游片段和下游片段,然后將上下游片段在靶位點(diǎn)處交錯(cuò),互為模板重疊延伸成全長(zhǎng)基因。該法主要優(yōu)點(diǎn)是:(1)能方便地對(duì)基因中間的靶位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)飽和突變,解決中間靶位點(diǎn)不易突變的難題;(2)突變與重組同時(shí)完成,大大縮短實(shí)驗(yàn)周期;(3)不存在突變修復(fù)問(wèn)題,容易篩選出全部突變子;(4)可方便地進(jìn)行多點(diǎn)飽和突變。不足之處是:當(dāng)靶位點(diǎn)靠近目的基因末端時(shí),分段擴(kuò)增的片段過(guò)小而不易回收;分別擴(kuò)增上下游片段時(shí),不能使用具有無(wú)模板加尾性能的polI型耐熱DNA聚合酶,而應(yīng)使用無(wú)加尾性能的高保真α型或混合型耐熱DNA聚合酶。圖2重疊延伸PCR技術(shù)流程A、D分別表示基因上下游引物；B、C分別表示靶位點(diǎn)正反向突變引物；基因上的黑色區(qū)域?yàn)榘形稽c(diǎn)，NNN表示兼并引物或突變核苷酸3、質(zhì)粒擴(kuò)增誘變(mutagenicplasmidamplification)在靶位點(diǎn)處設(shè)計(jì)一對(duì)反向兼并引物,擴(kuò)增質(zhì)粒全長(zhǎng)片段,然后用DpnI消化含甲基化位點(diǎn)的親本鏈,新合成鏈由于沒(méi)有甲基化位點(diǎn)而被保護(hù)。由于此法需要擴(kuò)增質(zhì)粒全長(zhǎng)序列,因此在PCR反應(yīng)中應(yīng)特別注意擴(kuò)增的保真性,一般采用高保真α型或混合型耐熱DNA聚合酶。successfulusesofproteinengineeringforbioremediation運(yùn)用DNA改組技術(shù)成功地獲得了具有高降解效率的生物催化劑，主要用于降解含氯乙烯（三氯乙烯、二氯乙烯、反二氯乙烯）和多環(huán)芳烴（萘、菲、芴、蒽）。Cho等通過(guò)兩輪的DNA改組和篩選，分離得到可提高降解甲基對(duì)硫磷的突變體,其中典型的突變體為22A11,水解甲基對(duì)硫磷的能力較野生型提高了25倍。Ang等對(duì)苯胺加雙氧酶的Val205進(jìn)行點(diǎn)飽和突變,獲得的突變子Val205Ala能極有效地降解2-異丙基苯胺Hill等對(duì)磷酸三酯酶His254、His257和Leu303位點(diǎn)進(jìn)行了點(diǎn)飽和突變,獲得了降解有機(jī)三酯速率提高3個(gè)數(shù)量級(jí)的進(jìn)化子,為解決有機(jī)磷污染提供了一個(gè)行之有效的途徑Canada等通過(guò)對(duì)BurkholderiacepaciaG4來(lái)源的甲苯單加氧酶進(jìn)行體外定向分子進(jìn)化,以提高其對(duì)氯乙烯和萘氧化物的活性。經(jīng)過(guò)體外分子進(jìn)化,獲得活性提高的突變酶。在大腸桿菌中表達(dá)突變的突變酶,其降解三氯乙烯、二氯乙烯速率明顯加快。表達(dá)突變酶的整個(gè)細(xì)胞的合成1-萘酚速度比野生型的突變酶快6倍,而且突變酶其區(qū)域?qū)Ｒ恍詻](méi)有改變。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在大腸桿菌中表達(dá)的突變酶表現(xiàn)出對(duì)三環(huán)復(fù)合物菲、芴和蒽較野生型更快的氧化效率。Dai等使用基因改組提高了S.chlorophenolicum降解五氯苯酚的水解能力和對(duì)高濃度五氯苯酚的耐受力。Bosma等構(gòu)建了一個(gè)能夠在三氯丙烷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物體。在亞甲基曙紅蘭的平板上選擇對(duì)降解三氯丙烷活性提高的鹵代烷脫鹵酶,經(jīng)過(guò)兩輪體外定向進(jìn)化,獲得含有兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變,Cys176Tyr和Tyr273Phe,表現(xiàn)出比野生型對(duì)三氯丙烷脫鹵效率提高8倍的鹵代烷脫鹵酶。FamilyandgenomeshufflingforPCBsand

pentachlorophenol(多環(huán)芳烴和五氯酚)Crameri等于1998年首次提出“DNA家族改組”的概念。他們發(fā)現(xiàn),采用傳統(tǒng)的DNA改組方法雖然能完成定向進(jìn)化的目的,但其中隨機(jī)產(chǎn)生的多為點(diǎn)突變,且有益突變頻率低,導(dǎo)致篩選工作艱巨且進(jìn)展緩慢。

DNA家族改組(DNAfamilyshuffling)是以來(lái)自不同種屬的同源基因作為重排對(duì)象進(jìn)行DNA改組操作的技術(shù)。該技術(shù)打破不同種、屬間的遺傳界限,利用同源基因之間的同源序列進(jìn)行DNA改組,通過(guò)提高親本基因群中差異的組合頻率和改組子代的雜合度,以增加突變文庫(kù)的多樣性,提高突變文庫(kù)的質(zhì)量,進(jìn)而有效地產(chǎn)生滿足需要的突變體。與其他DNA改組技術(shù)相比,DNA家族改組技術(shù)不僅可以顯著加速有益突變的累積,還易于實(shí)現(xiàn)目的蛋白多種特性的共進(jìn)化。Kumamaru等對(duì)P.pseudoalcaligenesKF707的bphA1（聯(lián)二苯雙加氧酶）基因和Burkholderia

sp.strainLB400的bphA基因進(jìn)行了體外分子進(jìn)化改造,提高了菌株對(duì)多氯聯(lián)苯的降解能力,還擴(kuò)大了菌株的降解范圍。經(jīng)改組和篩選獲得的bph突變基因在大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng),對(duì)乙苯、丁苯和異丙苯降解能力較野生型高。successfulusesBarriault等針對(duì)聯(lián)二苯雙加氧酶基因的片段進(jìn)行改組。其中聯(lián)二苯雙加氧酶的同源基因片段分別來(lái)源于Burkholderiasp.,Comamonastestosteroni和Rhodococcusgloberulus。研究者在較小的庫(kù)容內(nèi)篩選到的新酶不僅對(duì)2,2-二氯聯(lián)苯、3,3-二氯聯(lián)苯和4,4-二氯聯(lián)苯活力提高,而且對(duì)不易分解的2,6-二氯聯(lián)苯也具有良好的氧化能力?；蚪M改組重組幾個(gè)菌株同源染色體可以提高整個(gè)生物體的活性。該方法已用于生物修復(fù)中五氯酚的降解，Dai等通過(guò)三輪基因組改組將Sphingobilumchlorophenolicum對(duì)劇毒殺蟲劑五氯苯酚的耐受濃度提高了10倍以上,并可將培養(yǎng)基中所含的3mmol·L-1五氯苯酚完全降解。Vezina等借助DNA家族改組技術(shù)探索了苯雙加氧酶BPDOs底物的立體專一性和結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系,獲得了對(duì)2,2’-CB(2,2’-二氯聯(lián)苯)中C5和C6的氧化活性提高的新酶S100、S149和S151。其中,S100還能催化2,2’-CB得到順-5,6-二氧-5,6-二羥基-2,2’-二氯聯(lián)苯,而且能降解一些其野生型雙加氧酶所不能降解的苯、甲苯類單環(huán)芳香化合物,擴(kuò)大了酶的底物范圍。我國(guó)的Li等選取15種硝化細(xì)菌,對(duì)其硝酸氧還酶的同源基因進(jìn)行家族改組后獲得了生長(zhǎng)速率加快的克隆(平均代時(shí)16h-18h),同時(shí)氧還酶的酶活提高10倍以上。Metabolicengineeringforchlorinatedaliphatics代謝工程(metabo1icengineering)又稱途徑工程,由著名生化工程專家BaileyJE于1991年首先提出,他將其定義為“采用重組DNA技術(shù),操縱細(xì)胞的酶、運(yùn)輸及調(diào)節(jié)功能,達(dá)到提高或改善細(xì)胞活性的目的”,并論述了代謝工程的應(yīng)用、潛力和設(shè)計(jì)。隨著代謝工程研究應(yīng)用的深入,現(xiàn)在將其定義為利用基因工程技術(shù),有目的地對(duì)細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行精確的修飾、改造或擴(kuò)展、構(gòu)建新的代謝途徑,以改變微生物原有代謝特性,并與微生物基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合,提高目的代謝產(chǎn)物活性或產(chǎn)量、或合成新的代謝產(chǎn)物的工程技術(shù)科學(xué)。代謝工程的一個(gè)重要應(yīng)用領(lǐng)域就是構(gòu)建能夠降解有害物質(zhì)的微生物。Lee等報(bào)道了雜交菌Pseudomonas可以同時(shí)聚集苯、甲苯、二甲苯而不積累其代謝中間體Suyama等構(gòu)建的雜交Pseudomonas可以生長(zhǎng)在碳?xì)渑囵B(yǎng)基上并可以降解三氯乙烯。Jung等構(gòu)建的菌株還能降解硝基苯類。這些都說(shuō)明利用代謝工程構(gòu)建新的菌株能高效的降解多種有機(jī)污染物。successfulusesArnold等利用山葵過(guò)氧化物酶(HRP)可以將苯酚或兒茶酚等具有羥基的芳香族化合物連接成可發(fā)出熒光的二聚體的原理而開發(fā)了一種高通量的熒光數(shù)字成像篩選方法,這種方法可以快速?gòu)腄NA改組后得到的大量產(chǎn)物中篩選出活性得到提高的加氧酶(該酶催化芳香族化合物的羥基化反應(yīng))。Rojo等成功改造了Pseudomonassp.硝基苯酚降解菌B13：將三種不同細(xì)菌的五種不同的代謝途徑重組于單個(gè)生物體進(jìn)行甲酚和甲苯的降解。2-氯甲苯是一種較難降解的氯代芳香族化合物。Haro等對(duì)2-氯甲苯的代謝降解途徑進(jìn)行了深入的研究，并構(gòu)建了可以降解2-氯甲苯的假單胞工程菌。Walker等將有機(jī)磷水解酶基因opd和來(lái)自Pseudomonas

sp.ENV2030的對(duì)硝基苯酚降解基因簇轉(zhuǎn)入Pseudomonasputida中得到能以對(duì)硫磷作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的工程菌，為該類污染物的降解提出了新的方法。Reichmuth等利用randomPCR對(duì)dszB的啟動(dòng)子進(jìn)行隨機(jī)突變獲得不同的啟動(dòng)子突變體庫(kù)，然后把啟動(dòng)子突變體克隆到綠色熒光蛋白基因（greenfluorescenceproteingene，gfp）的上游形成一個(gè)dszB-gfp操縱子，通過(guò)GFP（greenfluorescenceprotein）的強(qiáng)度的變化來(lái)篩選強(qiáng)的啟動(dòng)子，提高DszB的表達(dá)水平，得到了對(duì)二苯噻吩脫硫速率快的菌株。Richins等研究表明,表面展示有機(jī)磷水解酶(organophosphorushydrolase,OPH)的工程菌降解對(duì)硫磷和對(duì)氧磷(paraoxon)的速度是胞內(nèi)表達(dá)OPH菌株的7倍,而且比純化的OPH更穩(wěn)定。Sicilian和Greer報(bào)道，接種假單孢菌Pseudomonassp.后，草地麥雀在含有41g/kgTNT（三硝基甲苯）土壤中的生長(zhǎng)量比不接種處理增加了50%，而TNT的降解量也增加了30%，表明該菌株在增強(qiáng)草地麥雀對(duì)TNT污染適應(yīng)性的同時(shí)，通過(guò)改變根際微生物種群結(jié)構(gòu)而加速TNT的降解。代謝工程在混合污染處理中也得到成功的應(yīng)用。例如，許多超級(jí)投資場(chǎng)所都被氯化物如TCE（三氯乙烯）和重金屬污染，因此，有效解決這種混合污染的策略就是用能在重金屬污染土壤中生長(zhǎng)的、降解TCE的根際細(xì)菌。Shim等構(gòu)建表面表達(dá)金屬結(jié)合肽EC20、植物螯合肽(Glu-Cys)20的根際菌株，能積累金屬和降解的TCE，使鎘積聚提高6倍。當(dāng)鎘存在而菌株缺乏EC20表達(dá)時(shí)，TCE降解率降低，然而EC20的表達(dá)能完全修復(fù)TCE的降解。這些結(jié)果表明EC20的表達(dá)不僅積聚鎘，還降低鎘對(duì)細(xì)菌降解TCE的毒性影響。Wu等研究表明惡臭假單胞菌06909表達(dá)的EC20能積聚鎘，降低鎘對(duì)向日葵的毒性。MetabolicengineeringformixedwastesWhole-transcriptomeprofilingtofacilitate

rhizoremediation利用DNA微數(shù)列的Whole-transcriptomeprofiling的優(yōu)勢(shì)是：與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相比，更容易檢測(cè)全部基因組的轉(zhuǎn)錄子相對(duì)量，蛋白組不能簡(jiǎn)便的辨別鑒定所有的蛋白質(zhì)。然而，轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄子的變化來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)形成的變化，可能不是特別準(zhǔn)確，但對(duì)于主要調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平的原核生物是很準(zhǔn)確的。轉(zhuǎn)錄組即一個(gè)活細(xì)胞所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有mRNA。研究轉(zhuǎn)錄組的一個(gè)重要方法就是利用DNA芯片技術(shù)檢測(cè)有機(jī)體基因組中基因的表達(dá)。從基因組DNA轉(zhuǎn)錄的基因總和，即轉(zhuǎn)錄組，也稱味表達(dá)譜，是研究細(xì)胞表型和功能的一個(gè)重要手段。而研究生物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組的發(fā)生和變化規(guī)律的科學(xué)就稱為轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)。第一個(gè)根際細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄學(xué)研究是鑒定了白楊樹根致病綠膿假單胞菌的幾個(gè)新的細(xì)菌毒力基因，并用這個(gè)轉(zhuǎn)錄本調(diào)查研究了植株對(duì)致病菌的全轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)答。在生物修復(fù)中，全轉(zhuǎn)錄組學(xué)還用來(lái)檢測(cè)根際生物修復(fù)菌株的相互影響，如生長(zhǎng)在玉米根部的惡臭假單胞菌的90個(gè)根際正調(diào)節(jié)基因被鑒定。Proteomicsinbioremediation盡管微陣列的分析能力很強(qiáng)大，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究平臺(tái)只包括那些適應(yīng)生長(zhǎng)條件變化細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄物。大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的生物化學(xué)過(guò)程都會(huì)受到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或者其他蛋白質(zhì)-底物相互作用的影響。蛋白質(zhì)組水平的基因表達(dá)分析提供了一個(gè)快速的可控制生物合成的快照過(guò)程，其中大部分是由轉(zhuǎn)錄組學(xué)平臺(tái)調(diào)控的。同時(shí)，轉(zhuǎn)錄組本身通過(guò)表達(dá)的蛋白質(zhì)或者是細(xì)胞生化狀態(tài)下其他的變化，進(jìn)行反饋控制。人類基因組計(jì)劃被譽(yù)為20世紀(jì)的三大科技工程之一。其劃時(shí)代的研究成果——人類基因組序列草圖的完成，宣告了一個(gè)新的紀(jì)元——“后基因組時(shí)代”的到來(lái)。其中，功能基因組學(xué)（functionalgenomics）成為研究的重心，蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）則是其“中流砥柱”。正因?yàn)槿绱?，Nature、Science分別在2001年2月15日、16日公布人類基因組草圖的同時(shí)，分別發(fā)表了“Andnowfortheproteome”（Nature409：747，2001）、“Proteomicsingenomeland”(Science291：1221,2001)的述評(píng)與展望，將蛋白質(zhì)組學(xué)的地位提到前所未有的高度，認(rèn)為是功能基因組學(xué)這一前沿研究的戰(zhàn)略制高點(diǎn)，蛋白質(zhì)組學(xué)將成為新世紀(jì)最大戰(zhàn)略資源——人類基因尤其是重要功能基因爭(zhēng)奪戰(zhàn)的重要“戰(zhàn)場(chǎng)”。

雙向電泳技術(shù)、計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)被稱為蛋白質(zhì)組研究的三大基本支撐技術(shù)。蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)路線如下圖：樣品細(xì)胞、組織、體液雙向電泳電轉(zhuǎn)印到膜上圖象分析，數(shù)據(jù)處理膠上原位酶切直接1繼續(xù)處理2繼續(xù)處理3蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)路線Edman降解氨基酸分析N端序列氨基酸組成肽混合物MALDI/TOF/MS肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索ESI/MS/MS肽序列標(biāo)簽PSD/MALDI/TOF/MS32蛋白質(zhì)鑒定寡核苷酸合成蛋白實(shí)驗(yàn)免疫組化肽合成基因抗體蛋白活力蛋白定位蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)二維凝膠電泳分離技術(shù)

定義：二維電泳是將不同種類的蛋白質(zhì)按照等電點(diǎn)和分子量差異進(jìn)行高分辨率的分離分析方法。成功的二維電泳可以將2000到3000種蛋白質(zhì)進(jìn)行分離.

①等電聚焦：電荷②SDS凝膠電泳：分子大小常用的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

二維凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE)是目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離與展示的分離技術(shù)。2-DE是由O’Farrell和Klose

于1975年分別提出的，在2-DE中，蛋白質(zhì)首先根據(jù)等電點(diǎn)的不同在一向等電聚焦電泳中分離，接著被轉(zhuǎn)移到二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，再根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小不同被分離。由于電泳裝置的限制和載體兩性電解質(zhì)的特性，使得2-DE的重復(fù)性很差，很難制備大量重復(fù)性好的2-DE膠。20世紀(jì)80年代初期出現(xiàn)的固相化pH梯度(immobilizedpHgradient，IPG)等電聚焦電泳技術(shù)．使2-DE的重復(fù)性和上樣量大大改善，不同實(shí)驗(yàn)室之間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以進(jìn)行比較，加之后續(xù)的微量鑒定技術(shù)如Edman微量測(cè)序技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)靈敏度的提高，使得2-DE獲得了廣泛的應(yīng)用，成為蛋白質(zhì)組研究中首選的分離技術(shù)。盡管如此，2-DE技術(shù)仍存在許多不足，如膜蛋白、堿性蛋白、低豐度蛋白的分離與檢測(cè)、重復(fù)性以及規(guī)?；妥詣?dòng)化的問(wèn)題。

Silverstained2-Dgelsfromtissuesamplesofrabbithearts.

生物質(zhì)譜技術(shù)1、發(fā)展歷程七十年代初用于小分子分析鑒定的電離技術(shù)，如：電子轟擊(Electronimpact,EI)電離和化學(xué)電離(Chemicalionization,CI)技術(shù)等。質(zhì)量分析器主要為磁場(chǎng)分析器(magneticSector)。七十年代末、八十年代初出現(xiàn)了場(chǎng)解吸(Fielddesorption,FD)、場(chǎng)電離(Fieldionization,FI)和快原子轟擊(Fast-atombombardment,FAB)技術(shù)。質(zhì)量分析器主要為磁場(chǎng)分析器(sector)、四極桿濾波器(quadrupole,Q)和離子回旋共振(ioncyclotronresonance,ICR)分析器。近十幾年出現(xiàn)了電噴霧電離(Electrosprayionization,ESI)技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization,MALDI)技術(shù)和表面增強(qiáng)激光解吸電離(Surface-enhancedlaserdesorption/ionization,SELDI)技術(shù)等.質(zhì)量分析器為磁場(chǎng)分析器(sector)、四極桿濾波器(quadrupole,Q)、離子阱分析器(Iontrap)、離子回旋共振(ioncyclotronresonance,ICR)分析器和飛行時(shí)間分析器(Time-of-flight,ToF)。2、主要質(zhì)譜儀

目前商業(yè)化的生物質(zhì)譜儀，其離子化方式主要是電噴霧電離與基質(zhì)輔助激光解吸電離，前者常采用四極桿質(zhì)量飛行器，所構(gòu)成的儀器稱為電噴霧(四極桿)質(zhì)譜儀，后者常采用飛行時(shí)間質(zhì)量分析器，所構(gòu)成的儀器稱為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。電噴霧質(zhì)譜的特點(diǎn)之一是可以和液相色譜、毛細(xì)管電泳等高效分離手段聯(lián)用，因而可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜化合物分離與鑒定的聯(lián)機(jī)操作。而MALDI-TOF質(zhì)譜儀的特點(diǎn)是對(duì)鹽和填加物的耐受能力強(qiáng)，且操作簡(jiǎn)便，測(cè)定速度快，易于實(shí)現(xiàn)高通量，譜峰與樣品成分的質(zhì)量有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，圖譜容易解析。此外，用于生物大分子測(cè)定的質(zhì)譜儀還有離子阱(iontrap)