碩士研究課現(xiàn)代分子生物學Molecularapproachesinbioremediation胡忠課件

Molecularapproachesinbioremediation

Bioremediation廣義的生物修復，指一切以利用生物為主體的環(huán)境污染的治理技術(shù)。它包括利用植物、動物和微生物吸收、降解、轉(zhuǎn)化土壤和水體中的污染物，使污染物的濃度降低到可接受的水平，或?qū)⒂卸居泻Φ奈廴疚镛D(zhuǎn)化為無害的物質(zhì)，也包括將污染物穩(wěn)定化，以減少其向周邊環(huán)境的擴散。一般分為植物修復、動物修復和微生物修復三種類型。狹義的生物修復，是指通過微生物的作用清除土壤和水體中的污染物，或是使污染物無害化的過程。它包括自然的和人為控制條件下的污染物降解或無害化過程。生物修復技術(shù)與其他工程措施相比,具有費用低、就地處理、對周圍環(huán)境干擾少等許多優(yōu)點。本文綜述了分子方法在生物修復中的應用，著重于根際修復（rhizoremediation）及其在降解含氯乙烯（chlorinatedethenes）中的應用。

Proteinengineering

定向進化（Directedevolution）是近20年發(fā)展起來的一項新技術(shù)，是達爾文的進化論思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和應用。它不需要深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，在實驗室條件下人工模擬生物大分子自然進化過程，在體外對基因進行隨機誘變，使基因發(fā)生大量變異，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變體，從而可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)自然界幾百萬年才能完成的進化過程。

易錯PCR是一種簡便快速地在DNA序列中隨機制造突變的方法，它通過改變傳統(tǒng)PCR反應體系中某些組分的濃度，使堿基在一定程度上隨機錯配而引入多點突變。本法的關(guān)鍵在于選擇適當?shù)耐蛔冾l率，當突變頻率太高時，幾乎無法篩選到有益突變；若突變頻率太低，野生型將占據(jù)突變?nèi)后w的優(yōu)勢，也很難篩選到理想的突變體。費力、費時，且易出現(xiàn)同型堿基轉(zhuǎn)換1994年,Stemmer在Nature發(fā)表了一篇題為RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling的文章,首次提出了DNA改組(DNAshuffling)技術(shù)。Stemmer以β-內(nèi)酰胺酶系統(tǒng)為試驗對象,用DNA改組,經(jīng)過三輪篩選和兩次回交得到一新菌株,其頭孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制濃度比原始菌株提高了32,000倍,也遠高于易錯PCR的突變篩選結(jié)果。DNA改組是基因在分子水平上進行的有性重組，是一種反復性突變、重組的過程。主要包括以下步驟：（1）目的DNA片段的獲得；（2）目的基因的隨機片段化，即將目的基因（可以是單個基因或一組相關(guān)基因）酶切成隨機片段，這些隨機片段集合包含了來自不同的同源序列的寡核苷酸，這些寡核苷酸具有不同的3’末端，從而為下一步的無引物PCR提供了條件；（3）無引物PCR，即具有互補3’末端的寡核苷酸互為引物，各為模板，通過不斷的PCR循環(huán)，在不同模板上隨機互補結(jié)合并進一步延伸；（4）有引物PCR，即以上輪無引物PCR的產(chǎn)物為模板，加入基因兩端序列為引物，經(jīng)過多輪PCR得到重排產(chǎn)物的集合，稱為突變文庫；（5）克隆、篩選、分析及多輪篩選，即進一步對突變文庫進行篩選，選擇改良的突變體組成下一輪改組的模板，重復上述步驟進行多次重排和篩選，最終獲得性狀比較理想的突變體。與常規(guī)突變技術(shù)相比，DNA改組有以下顯著優(yōu)點：①DNA改組可在短時間內(nèi)通過重組有效的突變體發(fā)掘所有可能的重組體與突變序列，從而大大加快進化速度；而且對可操作的靶序列沒有任何要求，長度可以達到幾十kb；②通過多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導致功能的明顯提高；③DNA改組從表型上早期進行選擇，而不必了解DNA片斷上序列的信息，簡化了操作程序；④DNA改組比隨機突變顯著提高了良性突變的概率。研究表明，DNA改組比隨機突變具有較大的優(yōu)勢，隨機突變的方法一般產(chǎn)生1%的良性突變，但DNA改組可產(chǎn)生13%的良性突變。點飽和突變技術(shù)(site-saturationmutagenesis),是通過對目的蛋白的編碼基因進行改造,短時間內(nèi)獲取靶位點氨基酸分別被其它19種天然氨基酸所替代的突變子。它不是定點突變技術(shù)的簡單延伸,而是蛋白質(zhì)設(shè)計理念的全面升華,廣泛地應用于蛋白質(zhì)改造及結(jié)構(gòu)—功能關(guān)系研究中,并取得了一系列令人矚目的成績。如利用點飽和突變技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)功能位點,提高酶比活力,改善酶熱穩(wěn)定性、底物結(jié)合特異性及立體異構(gòu)特異性等多方面性質(zhì)。目前已發(fā)展了多種點飽和突變方法,主要有以下幾種：1、寡核苷酸定向誘變(oligonucleotide-directedmutagenesis)該方法于上世紀70年代末建立,將目的基因克隆到噬菌體M13單鏈表達載體上,然后合成一段在靶位點處含突變寡核苷酸的引物,使其與目的基因配對,再加入四種dNTP和KlenowDNA聚合酶,使寡聚核苷酸引物延伸成全長基因,獲得的重組雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)染細菌后大量復制,進而篩選出陽性突變子。該法突出優(yōu)點是:目的基因可插入到噬菌體衣殼蛋白編碼基因內(nèi),通過噬菌體表面展示技術(shù)可方便地篩選出重組子。不足之處是:(1)對19種氨基酸須分別設(shè)計各自寡核苷酸引物,費用較大;(2)大腸桿菌宿主細胞存在自身修復系統(tǒng),因突變修復而難以篩選出突變子;(3)不適合多點飽和突變。2、盒式誘變(Cassettemutagenesis)該法利用一種含有突變靶位點和特殊酶切位點序列的密碼子盒(codoncassette)來引入突變序列。由于密碼子盒可從正反兩方向插入目的基因,因此只須11種密碼子盒就可替換產(chǎn)生全部20種氨基酸以達到點飽和突變的效果。該法突出優(yōu)點是:一個靶位點兩側(cè)的酶切位點經(jīng)過改造可替換成其它氨基酸,相對于寡核苷酸定向誘變而言節(jié)省了引物合成的費用,而且可對多個非鄰近位點同時進行點飽和突變。不足之處是:(1)每個靶位點兩側(cè)需分別設(shè)計酶切位點;(2)密碼子盒兩端存在重復序列,因自連而增加突變子篩選難度。2）、重疊延伸PCR(genesplicingbyoverlapextension)設(shè)計一對兼并引物,使其在靶位點附近有一定程度的重疊(圖2中的B、C引物),分別與基因5′和3′端引物(圖2中的A、D引物)組合,擴增含突變靶位點的上游片段和下游片段,然后將上下游片段在靶位點處交錯,互為模板重疊延伸成全長基因。該法主要優(yōu)點是:(1)能方便地對基因中間的靶位點進行點飽和突變,解決中間靶位點不易突變的難題;(2)突變與重組同時完成,大大縮短實驗周期;(3)不存在突變修復問題,容易篩選出全部突變子;(4)可方便地進行多點飽和突變。不足之處是:當靶位點靠近目的基因末端時,分段擴增的片段過小而不易回收;分別擴增上下游片段時,不能使用具有無模板加尾性能的polI型耐熱DNA聚合酶,而應使用無加尾性能的高保真α型或混合型耐熱DNA聚合酶。圖2重疊延伸PCR技術(shù)流程A、D分別表示基因上下游引物；B、C分別表示靶位點正反向突變引物；基因上的黑色區(qū)域為靶位點，NNN表示兼并引物或突變核苷酸3、質(zhì)粒擴增誘變(mutagenicplasmidamplification)在靶位點處設(shè)計一對反向兼并引物,擴增質(zhì)粒全長片段,然后用DpnI消化含甲基化位點的親本鏈,新合成鏈由于沒有甲基化位點而被保護。由于此法需要擴增質(zhì)粒全長序列,因此在PCR反應中應特別注意擴增的保真性,一般采用高保真α型或混合型耐熱DNA聚合酶。successfulusesofproteinengineeringforbioremediation運用DNA改組技術(shù)成功地獲得了具有高降解效率的生物催化劑，主要用于降解含氯乙烯（三氯乙烯、二氯乙烯、反二氯乙烯）和多環(huán)芳烴（萘、菲、芴、蒽）。Cho等通過兩輪的DNA改組和篩選，分離得到可提高降解甲基對硫磷的突變體,其中典型的突變體為22A11,水解甲基對硫磷的能力較野生型提高了25倍。Ang等對苯胺加雙氧酶的Val205進行點飽和突變,獲得的突變子Val205Ala能極有效地降解2-異丙基苯胺Hill等對磷酸三酯酶His254、His257和Leu303位點進行了點飽和突變,獲得了降解有機三酯速率提高3個數(shù)量級的進化子,為解決有機磷污染提供了一個行之有效的途徑Canada等通過對BurkholderiacepaciaG4來源的甲苯單加氧酶進行體外定向分子進化,以提高其對氯乙烯和萘氧化物的活性。經(jīng)過體外分子進化,獲得活性提高的突變酶。在大腸桿菌中表達突變的突變酶,其降解三氯乙烯、二氯乙烯速率明顯加快。表達突變酶的整個細胞的合成1-萘酚速度比野生型的突變酶快6倍,而且突變酶其區(qū)域?qū)Ｒ恍詻]有改變。進一步研究發(fā)現(xiàn),在大腸桿菌中表達的突變酶表現(xiàn)出對三環(huán)復合物菲、芴和蒽較野生型更快的氧化效率。Dai等使用基因改組提高了S.chlorophenolicum降解五氯苯酚的水解能力和對高濃度五氯苯酚的耐受力。Bosma等構(gòu)建了一個能夠在三氯丙烷培養(yǎng)基中生長的生物體。在亞甲基曙紅蘭的平板上選擇對降解三氯丙烷活性提高的鹵代烷脫鹵酶,經(jīng)過兩輪體外定向進化,獲得含有兩個氨基酸位點的突變,Cys176Tyr和Tyr273Phe,表現(xiàn)出比野生型對三氯丙烷脫鹵效率提高8倍的鹵代烷脫鹵酶。FamilyandgenomeshufflingforPCBsand

pentachlorophenol(多環(huán)芳烴和五氯酚)Crameri等于1998年首次提出“DNA家族改組”的概念。他們發(fā)現(xiàn),采用傳統(tǒng)的DNA改組方法雖然能完成定向進化的目的,但其中隨機產(chǎn)生的多為點突變,且有益突變頻率低,導致篩選工作艱巨且進展緩慢。

DNA家族改組(DNAfamilyshuffling)是以來自不同種屬的同源基因作為重排對象進行DNA改組操作的技術(shù)。該技術(shù)打破不同種、屬間的遺傳界限,利用同源基因之間的同源序列進行DNA改組,通過提高親本基因群中差異的組合頻率和改組子代的雜合度,以增加突變文庫的多樣性,提高突變文庫的質(zhì)量,進而有效地產(chǎn)生滿足需要的突變體。與其他DNA改組技術(shù)相比,DNA家族改組技術(shù)不僅可以顯著加速有益突變的累積,還易于實現(xiàn)目的蛋白多種特性的共進化。Kumamaru等對P.pseudoalcaligenesKF707的bphA1（聯(lián)二苯雙加氧酶）基因和Burkholderia

sp.strainLB400的bphA基因進行了體外分子進化改造,提高了菌株對多氯聯(lián)苯的降解能力,還擴大了菌株的降解范圍。經(jīng)改組和篩選獲得的bph突變基因在大腸桿菌細胞培養(yǎng),對乙苯、丁苯和異丙苯降解能力較野生型高。successfulusesBarriault等針對聯(lián)二苯雙加氧酶基因的片段進行改組。其中聯(lián)二苯雙加氧酶的同源基因片段分別來源于Burkholderiasp.,Comamonastestosteroni和Rhodococcusgloberulus。研究者在較小的庫容內(nèi)篩選到的新酶不僅對2,2-二氯聯(lián)苯、3,3-二氯聯(lián)苯和4,4-二氯聯(lián)苯活力提高,而且對不易分解的2,6-二氯聯(lián)苯也具有良好的氧化能力?；蚪M改組重組幾個菌株同源染色體可以提高整個生物體的活性。該方法已用于生物修復中五氯酚的降解，Dai等通過三輪基因組改組將Sphingobilumchlorophenolicum對劇毒殺蟲劑五氯苯酚的耐受濃度提高了10倍以上,并可將培養(yǎng)基中所含的3mmol·L-1五氯苯酚完全降解。Vezina等借助DNA家族改組技術(shù)探索了苯雙加氧酶BPDOs底物的立體專一性和結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系,獲得了對2,2’-CB(2,2’-二氯聯(lián)苯)中C5和C6的氧化活性提高的新酶S100、S149和S151。其中,S100還能催化2,2’-CB得到順-5,6-二氧-5,6-二羥基-2,2’-二氯聯(lián)苯,而且能降解一些其野生型雙加氧酶所不能降解的苯、甲苯類單環(huán)芳香化合物,擴大了酶的底物范圍。我國的Li等選取15種硝化細菌,對其硝酸氧還酶的同源基因進行家族改組后獲得了生長速率加快的克隆(平均代時16h-18h),同時氧還酶的酶活提高10倍以上。Metabolicengineeringforchlorinatedaliphatics代謝工程(metabo1icengineering)又稱途徑工程,由著名生化工程專家BaileyJE于1991年首先提出,他將其定義為“采用重組DNA技術(shù),操縱細胞的酶、運輸及調(diào)節(jié)功能,達到提高或改善細胞活性的目的”,并論述了代謝工程的應用、潛力和設(shè)計。隨著代謝工程研究應用的深入,現(xiàn)在將其定義為利用基因工程技術(shù),有目的地對細胞代謝途徑進行精確的修飾、改造或擴展、構(gòu)建新的代謝途徑,以改變微生物原有代謝特性,并與微生物基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合,提高目的代謝產(chǎn)物活性或產(chǎn)量、或合成新的代謝產(chǎn)物的工程技術(shù)科學。代謝工程的一個重要應用領(lǐng)域就是構(gòu)建能夠降解有害物質(zhì)的微生物。Lee等報道了雜交菌Pseudomonas可以同時聚集苯、甲苯、二甲苯而不積累其代謝中間體Suyama等構(gòu)建的雜交Pseudomonas可以生長在碳氫培養(yǎng)基上并可以降解三氯乙烯。Jung等構(gòu)建的菌株還能降解硝基苯類。這些都說明利用代謝工程構(gòu)建新的菌株能高效的降解多種有機污染物。successfulusesArnold等利用山葵過氧化物酶(HRP)可以將苯酚或兒茶酚等具有羥基的芳香族化合物連接成可發(fā)出熒光的二聚體的原理而開發(fā)了一種高通量的熒光數(shù)字成像篩選方法,這種方法可以快速從DNA改組后得到的大量產(chǎn)物中篩選出活性得到提高的加氧酶(該酶催化芳香族化合物的羥基化反應)。Rojo等成功改造了Pseudomonassp.硝基苯酚降解菌B13：將三種不同細菌的五種不同的代謝途徑重組于單個生物體進行甲酚和甲苯的降解。2-氯甲苯是一種較難降解的氯代芳香族化合物。Haro等對2-氯甲苯的代謝降解途徑進行了深入的研究，并構(gòu)建了可以降解2-氯甲苯的假單胞工程菌。Walker等將有機磷水解酶基因opd和來自Pseudomonas

sp.ENV2030的對硝基苯酚降解基因簇轉(zhuǎn)入Pseudomonasputida中得到能以對硫磷作為唯一碳源和能源生長的工程菌，為該類污染物的降解提出了新的方法。Reichmuth等利用randomPCR對dszB的啟動子進行隨機突變獲得不同的啟動子突變體庫，然后把啟動子突變體克隆到綠色熒光蛋白基因（greenfluorescenceproteingene，gfp）的上游形成一個dszB-gfp操縱子，通過GFP（greenfluorescenceprotein）的強度的變化來篩選強的啟動子，提高DszB的表達水平，得到了對二苯噻吩脫硫速率快的菌株。Richins等研究表明,表面展示有機磷水解酶(organophosphorushydrolase,OPH)的工程菌降解對硫磷和對氧磷(paraoxon)的速度是胞內(nèi)表達OPH菌株的7倍,而且比純化的OPH更穩(wěn)定。Sicilian和Greer報道，接種假單孢菌Pseudomonassp.后，草地麥雀在含有41g/kgTNT（三硝基甲苯）土壤中的生長量比不接種處理增加了50%，而TNT的降解量也增加了30%，表明該菌株在增強草地麥雀對TNT污染適應性的同時，通過改變根際微生物種群結(jié)構(gòu)而加速TNT的降解。代謝工程在混合污染處理中也得到成功的應用。例如，許多超級投資場所都被氯化物如TCE（三氯乙烯）和重金屬污染，因此，有效解決這種混合污染的策略就是用能在重金屬污染土壤中生長的、降解TCE的根際細菌。Shim等構(gòu)建表面表達金屬結(jié)合肽EC20、植物螯合肽(Glu-Cys)20的根際菌株，能積累金屬和降解的TCE，使鎘積聚提高6倍。當鎘存在而菌株缺乏EC20表達時，TCE降解率降低，然而EC20的表達能完全修復TCE的降解。這些結(jié)果表明EC20的表達不僅積聚鎘，還降低鎘對細菌降解TCE的毒性影響。Wu等研究表明惡臭假單胞菌06909表達的EC20能積聚鎘，降低鎘對向日葵的毒性。MetabolicengineeringformixedwastesWhole-transcriptomeprofilingtofacilitate

rhizoremediation利用DNA微數(shù)列的Whole-transcriptomeprofiling的優(yōu)勢是：與蛋白質(zhì)組學技術(shù)相比，更容易檢測全部基因組的轉(zhuǎn)錄子相對量，蛋白組不能簡便的辨別鑒定所有的蛋白質(zhì)。然而，轉(zhuǎn)錄組學可以通過轉(zhuǎn)錄子的變化來預測蛋白質(zhì)形成的變化，可能不是特別準確，但對于主要調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平的原核生物是很準確的。轉(zhuǎn)錄組即一個活細胞所能轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA。研究轉(zhuǎn)錄組的一個重要方法就是利用DNA芯片技術(shù)檢測有機體基因組中基因的表達。從基因組DNA轉(zhuǎn)錄的基因總和，即轉(zhuǎn)錄組，也稱味表達譜，是研究細胞表型和功能的一個重要手段。而研究生物細胞中轉(zhuǎn)錄組的發(fā)生和變化規(guī)律的科學就稱為轉(zhuǎn)錄組學(transcriptomics)。第一個根際細菌的轉(zhuǎn)錄學研究是鑒定了白楊樹根致病綠膿假單胞菌的幾個新的細菌毒力基因，并用這個轉(zhuǎn)錄本調(diào)查研究了植株對致病菌的全轉(zhuǎn)錄組響應答。在生物修復中，全轉(zhuǎn)錄組學還用來檢測根際生物修復菌株的相互影響，如生長在玉米根部的惡臭假單胞菌的90個根際正調(diào)節(jié)基因被鑒定。Proteomicsinbioremediation盡管微陣列的分析能力很強大，轉(zhuǎn)錄組學研究平臺只包括那些適應生長條件變化細胞的轉(zhuǎn)錄物。大多數(shù)細胞內(nèi)和細胞間的生物化學過程都會受到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或者其他蛋白質(zhì)-底物相互作用的影響。蛋白質(zhì)組水平的基因表達分析提供了一個快速的可控制生物合成的快照過程，其中大部分是由轉(zhuǎn)錄組學平臺調(diào)控的。同時，轉(zhuǎn)錄組本身通過表達的蛋白質(zhì)或者是細胞生化狀態(tài)下其他的變化，進行反饋控制。人類基因組計劃被譽為20世紀的三大科技工程之一。其劃時代的研究成果——人類基因組序列草圖的完成，宣告了一個新的紀元——“后基因組時代”的到來。其中，功能基因組學（functionalgenomics）成為研究的重心，蛋白質(zhì)組學（proteomics）則是其“中流砥柱”。正因為如此，Nature、Science分別在2001年2月15日、16日公布人類基因組草圖的同時，分別發(fā)表了“Andnowfortheproteome”（Nature409：747，2001）、“Proteomicsingenomeland”(Science291：1221,2001)的述評與展望，將蛋白質(zhì)組學的地位提到前所未有的高度，認為是功能基因組學這一前沿研究的戰(zhàn)略制高點，蛋白質(zhì)組學將成為新世紀最大戰(zhàn)略資源——人類基因尤其是重要功能基因爭奪戰(zhàn)的重要“戰(zhàn)場”。

雙向電泳技術(shù)、計算機圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)被稱為蛋白質(zhì)組研究的三大基本支撐技術(shù)。蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)路線如下圖：樣品細胞、組織、體液雙向電泳電轉(zhuǎn)印到膜上圖象分析，數(shù)據(jù)處理膠上原位酶切直接1繼續(xù)處理2繼續(xù)處理3蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)路線Edman降解氨基酸分析N端序列氨基酸組成肽混合物MALDI/TOF/MS肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)庫檢索ESI/MS/MS肽序列標簽PSD/MALDI/TOF/MS32蛋白質(zhì)鑒定寡核苷酸合成蛋白實驗免疫組化肽合成基因抗體蛋白活力蛋白定位蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫二維凝膠電泳分離技術(shù)

定義：二維電泳是將不同種類的蛋白質(zhì)按照等電點和分子量差異進行高分辨率的分離分析方法。成功的二維電泳可以將2000到3000種蛋白質(zhì)進行分離.

①等電聚焦：電荷②SDS凝膠電泳：分子大小常用的蛋白質(zhì)組學技術(shù)

二維凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE)是目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時分離與展示的分離技術(shù)。2-DE是由O’Farrell和Klose

于1975年分別提出的，在2-DE中，蛋白質(zhì)首先根據(jù)等電點的不同在一向等電聚焦電泳中分離，接著被轉(zhuǎn)移到二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，再根據(jù)相對分子質(zhì)量大小不同被分離。由于電泳裝置的限制和載體兩性電解質(zhì)的特性，使得2-DE的重復性很差，很難制備大量重復性好的2-DE膠。20世紀80年代初期出現(xiàn)的固相化pH梯度(immobilizedpHgradient，IPG)等電聚焦電泳技術(shù)．使2-DE的重復性和上樣量大大改善，不同實驗室之間的實驗結(jié)果可以進行比較，加之后續(xù)的微量鑒定技術(shù)如Edman微量測序技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)靈敏度的提高，使得2-DE獲得了廣泛的應用，成為蛋白質(zhì)組研究中首選的分離技術(shù)。盡管如此，2-DE技術(shù)仍存在許多不足，如膜蛋白、堿性蛋白、低豐度蛋白的分離與檢測、重復性以及規(guī)?；妥詣踊膯栴}。

Silverstained2-Dgelsfromtissuesamplesofrabbithearts.

生物質(zhì)譜技術(shù)1、發(fā)展歷程七十年代初用于小分子分析鑒定的電離技術(shù)，如：電子轟擊(Electronimpact,EI)電離和化學電離(Chemicalionization,CI)技術(shù)等。質(zhì)量分析器主要為磁場分析器(magneticSector)。七十年代末、八十年代初出現(xiàn)了場解吸(Fielddesorption,FD)、場電離(Fieldionization,FI)和快原子轟擊(Fast-atombombardment,FAB)技術(shù)。質(zhì)量分析器主要為磁場分析器(sector)、四極桿濾波器(quadrupole,Q)和離子回旋共振(ioncyclotronresonance,ICR)分析器。近十幾年出現(xiàn)了電噴霧電離(Electrosprayionization,ESI)技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization,MALDI)技術(shù)和表面增強激光解吸電離(Surface-enhancedlaserdesorption/ionization,SELDI)技術(shù)等.質(zhì)量分析器為磁場分析器(sector)、四極桿濾波器(quadrupole,Q)、離子阱分析器(Iontrap)、離子回旋共振(ioncyclotronresonance,ICR)分析器和飛行時間分析器(Time-of-flight,ToF)。2、主要質(zhì)譜儀

目前商業(yè)化的生物質(zhì)譜儀，其離子化方式主要是電噴霧電離與基質(zhì)輔助激光解吸電離，前者常采用四極桿質(zhì)量飛行器，所構(gòu)成的儀器稱為電噴霧(四極桿)質(zhì)譜儀，后者常采用飛行時間質(zhì)量分析器，所構(gòu)成的儀器稱為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀。電噴霧質(zhì)譜的特點之一是可以和液相色譜、毛細管電泳等高效分離手段聯(lián)用，因而可實現(xiàn)復雜化合物分離與鑒定的聯(lián)機操作。而MALDI-TOF質(zhì)譜儀的特點是對鹽和填加物的耐受能力強，且操作簡便，測定速度快，易于實現(xiàn)高通量，譜峰與樣品成分的質(zhì)量有一一對應關(guān)系，圖譜容易解析。此外，用于生物大分子測定的質(zhì)譜儀還有離子阱(iontrap)