細胞生物學(xué)3細胞生物學(xué)研究方法02課件

基因敲除基因敲除示意圖（1）基因敲除示意圖（2）

KnockoutMice

未來的生物技術(shù)免疫膠體金技術(shù)基本原理：

氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠狀溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標(biāo)記：實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的過程。吸附機理：因膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸值被各種不同顏色的膠體金顆粒。應(yīng)用：膠體金粒子對蛋白質(zhì)有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽聚合物等結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床試驗中成為非常有用的工具。在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機體中取出的細胞，并使之生存和生長的技術(shù)為細胞培養(yǎng)技術(shù)。培養(yǎng)中的細胞不受體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的影響，人為改變培養(yǎng)條件(如物理、化學(xué)、生物等外界因素的變化)即可進一步觀察細胞在單因素或多因素的影響下的生理功能變化。細胞培養(yǎng)人的細胞培養(yǎng)

細胞系:原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細胞系，有無限的傳代能力。細胞株:通過原代培養(yǎng)或經(jīng)過細胞克隆與選擇而建立的、具有特異的性質(zhì)或標(biāo)記的細胞系，但是它們具有有限的傳代能力。原代培養(yǎng)：是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì)

植物原生質(zhì)體培養(yǎng)

植物組織培養(yǎng)外植體愈傷組織新植株概念流式細胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）利用流式細胞儀對處在快速、直線、流動狀態(tài)中的單細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速定量分析，同時對特定群體加以分選的現(xiàn)代細胞分析技術(shù)。流式細胞儀（FlowCytometer)

集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機技術(shù)、細胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。原理：將待測細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。

FluorescenceActivatedCellSorting488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector細胞標(biāo)記染色體分選流式細胞儀檢測范圍細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細胞結(jié)構(gòu)特異性抗原（細胞表面/胞漿/核）細胞內(nèi)細胞因子細胞活性酶活性激素結(jié)合位點細胞受體細胞功能流式細胞儀的工作原理光學(xué)系統(tǒng)激光光源 光收集系統(tǒng)液流系統(tǒng) 流動室液流驅(qū)動系統(tǒng)電子系統(tǒng) 光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)

細胞工程技術(shù)是細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)的交叉領(lǐng)域，主要利用細胞生物學(xué)的原理和方法，結(jié)合工程學(xué)的技術(shù)手段，按照人們預(yù)先的設(shè)計，有計劃地改變或創(chuàng)造細胞遺傳性的技術(shù)。包括體外大量培養(yǎng)和繁殖細胞，或獲得細胞產(chǎn)品、或利用細胞體本身。主要內(nèi)容包括：細胞融合、細胞生物反應(yīng)器、染色體轉(zhuǎn)移、細胞器移植、基因轉(zhuǎn)移、細胞及組織培養(yǎng)。細胞工程在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，兩個不同基因型的細胞或原生質(zhì)體融合形成一個雜種細胞?；具^程包括細胞融合形成異核體(heterokaryon)、異核體通過細胞有絲分裂進行核融合、最終形成單核的雜種細胞。細胞融合

聚乙二醇（PEG）法細胞融合過程顯微鏡下細胞融合過程BHK-21細胞用核骨架蛋白抗體進行免疫膠體金標(biāo)記的結(jié)果

IF：中間纖維；g:金顆粒；N:核區(qū)外周血血細胞掃描電鏡標(biāo)本的制備取血----PBS洗三次----滴片(有Formvar膜)----冷的1%戊二醛4度固定2小時-----PBS----1%四氧化鋨，30分-----PBS-----50、70、90%丙酮各一次，100%兩次----50、70、90%醋酸異戊酯丙酮溶液各一次，100%醋酸異戊酯兩次----臨界點干燥----噴碳、金—觀察人類血細胞SEM照片

GFP是從一種生活在北太平洋寒冷水域的水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。在蛋白質(zhì)編號lema中可以看到GFP發(fā)色團的骨架在左邊。蛋白質(zhì)鏈形成一個圓柱形罐頭（藍色），子鏈的一部分直接從中間穿過（綠色），發(fā)色團剛好在罐頭盒的中間，它被保護起來以免受周圍環(huán)境的影響GFP的純?nèi)芤涸诘湫偷氖夜庀鲁庶S色，但是當(dāng)被拿到戶外的陽光下時，它會發(fā)出鮮綠的顏色。這種蛋白質(zhì)從陽光中吸收紫外光，然后以能量較低的綠光形式發(fā)射出來。綠色熒光蛋白的應(yīng)用綠色熒光蛋白是當(dāng)代科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最重要的工具之一，它從顯微水平上照亮了生命。隨著病毒在宿主體內(nèi)不斷擴散，你就可以通過跟蹤發(fā)出的綠光來觀察病毒的擴散途徑，或者你把它接合到一種蛋白質(zhì)上并通過顯微鏡觀察它在細胞內(nèi)部的移動科學(xué)使用綠色熒光蛋白跟蹤大腦神經(jīng)細胞的發(fā)育過程。綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)——下村修1962年首先從水母中分離綠色熒光蛋白的科學(xué)家，他發(fā)現(xiàn)這種蛋白在紫外線光中呈現(xiàn)亮色。

1992年，道格拉斯·普瑞金拿到了綠色熒光蛋白的基因。綠色熒光蛋白的推廣——馬丁-查爾菲1993年，馬丁·查爾菲成功地通過基因重組的方法使得除水母以外的其他生物(如大腸桿菌等)也能產(chǎn)生綠色熒光蛋白，證實了綠色熒光蛋白與活體生物的相容性。綠色熒光蛋白的改造——錢永健進行了大刀闊斧的化學(xué)改造，不但大大增強了它的發(fā)光效率，還發(fā)展出了紅色、藍色、黃色熒光蛋白，使得熒光蛋白真正成為了一個琳瑯滿目的工具箱，供生物學(xué)家們選用。綠色熒光蛋白質(zhì)在科學(xué)研究和藝術(shù)領(lǐng)域發(fā)揮作用的美麗而令人驚訝的例子。

3位諾貝爾獎得主第一次分離出的熒光基因，就是從上面照片中的這種水晶水母體內(nèi)獲得的。水晶水母圖片中的小老鼠是1997年7月在大阪大學(xué)降生的，它們是第一種能夠在夜里發(fā)光的哺乳動物。研究人員可利用熒光老鼠研究胎兒發(fā)育。

會發(fā)光的老鼠杰夫·利希曼(JeffLichtman)之手，展現(xiàn)了大腦內(nèi)的連接，圖片中美麗的“彩虹”就是神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)。腦內(nèi)連接這兩只熒光豬誕生于中國黑龍江省哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的實驗室。它們的發(fā)光本領(lǐng)并不是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的直接產(chǎn)物，而是從其經(jīng)過基因改造的母親那里遺傳而來。兩只熒光豬

發(fā)紅光的貓左側(cè)的貓由韓國研究人員2007年晚些時候打造，能夠在紫外線下發(fā)出紅光。某些情況下，這些熒光蛋白基因可用作一種分子開關(guān)，觸發(fā)其它細胞活動GFP賓尼兔熒光兔“阿爾巴”(Alba)。阿爾巴是在轉(zhuǎn)基因技術(shù)幫助下?lián)碛羞@種熒光基因的?！禛FP賓尼兔》的問世在世界上引發(fā)不小爭議。蝌蚪也發(fā)光

熒光魚

在約克鎮(zhèn)科技公司將熒光魚引入市場后不久，熒光蛋白便迅速在商業(yè)上得到應(yīng)用。綠色熒光蛋白質(zhì)可以幫助科學(xué)家了解細胞機制如何工作。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，所有細胞和動物都可以產(chǎn)生熒光蛋白質(zhì)。康涅狄格學(xué)院化學(xué)家、《發(fā)光基因》作者馬克·齊默(MarkZimmer)將綠色熒光蛋白質(zhì)稱之為“21世紀(jì)的顯微鏡”。通過讓基因攜帶綠色熒光蛋白質(zhì)——與瘤轉(zhuǎn)移或大腦功能有關(guān)的基因——科學(xué)家只需通過尋找熒光便可知道基因何時以及為什么“開啟”。

細胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)（如受體、抗原、抗體、酶、細胞骨架蛋白等基因表達產(chǎn)物）、DNA、RNA等細胞膜流動性（熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)）細胞內(nèi)氧自由基活性細胞內(nèi)鈣離子濃度變化膜電位共聚焦掃描顯微鏡在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用DrosophilaembryostainedwithafluorescentprobeforactinfilamentsConventionalConfocalGFPtagging:ArabidopsisleavesSEMConfocal:talin-GFP習(xí)題為什么電子顯微鏡不能完全