植物生理實(shí)驗(yàn)二

植物生理實(shí)驗(yàn)二第1頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一、目的

硝酸還原酶（nitratereductase，縮寫NR）是硝酸鹽同化中第一個(gè)酶，也是限速酶，處于植物氮代謝的關(guān)鍵位置。它與植物吸收利用氮肥有關(guān)，對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)有重要影響，因而硝酸還原酶活性被當(dāng)作植物營(yíng)養(yǎng)或農(nóng)田施肥的指標(biāo)之一，也可作為品種選育的指標(biāo)之一。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以初步掌握測(cè)定硝酸還原酶活性的原理和方法。第2頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期五二、原理

在一定條件下，NO2-的生成量與硝酸還原酶活性呈正相關(guān)。NO2-含量可用磺胺顯色法測(cè)定，即在酸性條件下與對(duì)-氨基苯磺酸胺發(fā)生重氮反應(yīng)，生成的重氮化合物又與N-萘基乙二胺鹽酸鹽（或α-萘胺）生成紅色偶氮化合物，可在520nm下比色測(cè)定。反應(yīng)如下：第3頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第4頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期五離體法需將材料磨成勻漿，經(jīng)過(guò)濾或離心除去殘?jiān)?，以上清液為硝酸還原酶粗酶液進(jìn)行測(cè)定。由于研磨中NADH受損失，必需外加NADH方可測(cè)定?；铙w法直接用鮮活組織進(jìn)行測(cè)定。環(huán)境中的NO3-進(jìn)入細(xì)胞后，被硝酸還原酶還原成NO2-并擴(kuò)散到細(xì)胞外在溶液中積累，測(cè)定溶液中NO2-的含量即可得知硝酸還原酶活性的大小。第5頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期五活體法不破壞細(xì)胞原有的酶反應(yīng)系統(tǒng)，NADH可由代謝反應(yīng)不斷生成，無(wú)需外加?；铙w法簡(jiǎn)便、快速，不需要貴重儀器設(shè)備及低溫條件，但重復(fù)性欠佳，應(yīng)作一定量的重復(fù)。本實(shí)驗(yàn)采用活體法測(cè)定硝酸還原酶活性。第6頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期五三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1．材料材料可選用小麥、玉米、白菜、油菜、煙葉等作物的葉片2．儀器（1）天平（2）真空泵和真空干燥器（3）離心機(jī)（4）20mL試管×7（5）50mL三角瓶×3（6）恒溫水?。?）恒溫箱（8）分光光度計(jì)（9）移液管：5mL×2；2mL×5；1mL×1第7頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3．試劑（1）亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液：（2）0.1mol/LpH7.5磷酸緩沖液：A液（0.2mol/LNa2HPO4）B液（0.2mol/LNaH2PO4）取A液84.0mL和B液16.0mL，混勻，加蒸餾水100mL。（3）0.04mol/LKNO3：（4）1%對(duì)氨基苯磺酸：（5）0.2%α?萘胺：（6）30%三氯乙酸：第8頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期五四、操作步驟1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支干凈試管，編號(hào)，按表1加入試劑：搖勻后在室溫下放置30min，然后在520nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度，以亞硝酸含量和光密度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。第9頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期五試劑試管號(hào)123456亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液（mL）00.20.40.60.81.0蒸餾水（mL）1.00.80.60.40.201%對(duì)氨基苯磺酸2.02.02.02.02.02.00.2%α?萘胺2.02.02.02.02.02.0亞硝酸鈉含量（μg

）012345表一標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取樣表第10頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2．酶反應(yīng)和酶活性的測(cè)定將實(shí)驗(yàn)材料用水洗凈，再用蒸餾水沖洗，然后用紗布或?yàn)V紙吸干。將材料剪成0.5cm×0.5cm左右的小塊，混合均勻后分別稱取三份，每份0.4g，然后分別放入3只50mL的三角瓶中，編號(hào)后按表2加入各種試劑：第11頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第12頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期五搖勻后將三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽氣10-15min。放氣后葉片變軟并沉入溶液。將三角瓶取出放入恒溫箱，在30℃、暗條件下保溫30min。取出后立即向2、3號(hào)瓶分別加入1mL30%三氯乙酸以終止酶反應(yīng)。第13頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期五將各瓶中的反應(yīng)液離心（2000r/min，10min）（根據(jù)情況，可以省略），然后分別吸取上清液1mL于另一試管中，各加入2mL1%對(duì)氨基苯磺酸和2mL0.2%α-萘胺（注意順序），室溫顯色30min后測(cè)定520nm波長(zhǎng)下的光密度。用2、3號(hào)管溶液光密度平均值減去1號(hào)管溶液的光密度，得到的值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的NaNO2含量（μg）。第14頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期五五、結(jié)果與計(jì)算

把在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的NaNO2含量代入下式，計(jì)算硝酸還原酶活性：第15頁(yè)，共16頁(yè)，202