研究技術報告課件

研究技術報告

I小氣道功能與超細纖支鏡直視對比研究材料與和方法

共21例病人，經(jīng)詢問病史、查體、胸部X線攝片及MEFV檢查，以V50、V25≤正常預計值的70%為小氣道功能異常診斷標準[7]，分為小氣道功能異常組（A組）和正常組（N組）。A組12例，男7例，女5例；正常組9例，男6例，女3例，年齡32~53歲。參考Tanaka提出的氣道損傷內鏡分類及趙鳴武的方法將纖支鏡觀察的大氣道和UTBF觀察的小氣道病變[6，7]，按程度分為4級，即0、+、++、+++。為便于定量分析，將0級定為0分，+、++、+++分別定為2、4、6分。纖支鏡和UTBF觀察由2人進行，共同確定病變分級。結果

肺功能檢查結果表1小氣道功能與正常組與異常組肺通氣功能（實測值/正常預計值）比較

分組V50V25VCFEV1FEV1/FVC%正常組0.82±0.110.78±0.120.94±0.320.90±0.150.83±0.12異常組0.56±0.210.51±0.190.92±0.150.86±0.170.75±0.14注：檢驗，P>0.05

小氣道功能正常組和異常組小氣道觀察結果

表3小氣道功能正常組與異常組小氣道UTBF觀察結果分組充血血管擴張水腫脆性增加分泌物增多色素沉著總分*正常組0.8±1.00.8±1.000.2±0.62.5±1.51.2±1.05.5±1.6異常組1.8±1.81.0±1.00.5±1.00.5±1.03.8±1.82.0±1.09.6±1.8*P<0.01

討論

MEFV曲線已成為檢測小氣道病變的主要方法，其主要指標V50、V25敏感性高，重復性好，是目前最為常用的指標[8]。本文以V50、V25與UTBF直視評分相比較，結果表明，V50、V25異常組UTBF直視下小氣道病變程度顯著較V50、V25正常組嚴重。兩組UTBF直視評分有非常顯著性差異。V50、V25與UTBF直視評分的相關性分析也表明，兩者呈顯著負相關。我們在生理條件下的觀察結果，與其他學者通過手術切除或尸檢標本所得結果相符合[1~4]，進一步在生理條件下明確了小氣道功能和病理之間的如下相關關系：小氣道病變是MEFV異常的病理學基礎；MEFV較好地反映了小氣道的病變情況。

本UTBF主要觀察兩肺下葉外基底段的小氣道，由于小氣道病變是一種彌漫性支氣管病變，局部現(xiàn)象有一定的代表性，可大體反映小氣道病變的情況。我們通過UTBF觀察到小氣道病變主要是充血、水腫、分泌物增多等急性炎癥性改變,而在切除標本顯微鏡下中可見的平滑肌肥厚、結締組織增生、鱗狀上皮化生等慢性炎癥及氣道重塑改變無法直接判斷。COPD病變早期位于直徑≤2mm的小氣道[9]。小氣道病變有可逆性和不可逆性兩方面：由粘液栓和充血水腫等炎癥為主引起的是可逆的，以小氣道結構重塑為主引起則難以逆轉，臨床治療小氣道病變的目的主要是針對其可逆性，而目前缺乏一種辨別小氣道病變可逆性的可靠方法。我們認為：MEFV曲線和UTBF檢查施行相對容易，可以重復，二者相結合，有可能從功能和形態(tài)兩方面更全面、更可靠地評價小氣道病變的程度、性質，推測治療預后，進行長期隨訪。Ⅱ小氣道功能障礙與病理關系的研究

1.4病理學1.4.1常規(guī)行HE染色1.4.2逐一觀察每張切片中每支橫切或斜切的支氣管，凡橫徑：長徑<0.3者去除。以TD2000病理圖像分析系統(tǒng)測量內徑≤2mm。1.4.3參照何氏提出的八項病理指標評分[1，3]見表4，每切片中評閱小氣道4個，計其總分。表4小氣道病變計分標準

0分1分2分3分管腔阻塞無阻塞阻塞面積<管腔總面積的1/3阻塞面積占管腔總面積的1/3~2/3阻塞面積>管腔總面積的2/3粘膜潰瘍上皮完整潰瘍區(qū)<管腔周長的1/3潰瘍區(qū)占管腔周長的1/3~2/3潰瘍區(qū)>管腔周長的2/3炎性細胞浸潤管壁內無炎性細胞浸潤

炎性細胞浸潤面積<管壁面積的2/3，炎性細胞稀疏；或浸潤面積<管腔面積的1/3，但炎性細胞較密集浸潤面積為管壁面積的1/3~2/3，炎性細胞較密；或浸潤面積>管壁面積的2/3，炎性細胞稀疏；或浸潤面積<管壁面積的1/3，炎性細胞密集浸潤面積>管壁面積的2/3，炎性細胞較密；或浸潤面積>管壁面積的1/3，但炎性細胞密集，甚至呈灶狀分布杯狀細胞增多無杯狀細胞或杯狀細胞：纖毛柱狀細胞為<1:10杯狀細胞：纖毛柱狀細胞為2:10

杯狀細胞：纖毛柱細胞為3：10杯狀細胞：纖毛柱細胞為4：10上皮細胞鱗化矮柱狀短纖毛細胞出現(xiàn)鱗化傾向或鱗化區(qū)<管腔周長的1/4鱗化區(qū)占管腔周長的1/4~1/2鱗化區(qū)>管腔周長的1/2結締組織增生結締組織厚度：管壁厚度為<1/4結締組織厚度：管壁厚度為1/4~1/3，結締組織稀疏結締組織厚度：管壁厚度為1/3~1/2，結締組織較密結締組織厚度：管壁厚度>1/2，結締組織致密平滑肌肥厚平滑肌厚度：管壁厚度為<1/5平滑肌厚度：管壁厚度為1/5~1/3平滑肌厚度：管壁厚度為1/3~1/2平滑肌厚度：管壁厚度為>1/2色素沉積無色素沉積或僅有微量色素散在分布沉積面積<管壁面積的1/3，色素分布稀疏沉積面積為管壁面積的1/3~1/2，色素分布較密沉積面積>管壁面積的1/2，色素密集分布1.5統(tǒng)計學分析：應用SPSS軟件。小氣道病變積分采用方差分析，數(shù)值表示：Mean±SD；中性粒細胞（N）、淋巴細胞（L）、單核細胞（M）、嗜酸性粒細胞（E）細胞計數(shù)采用非參數(shù)Mann-Whitte檢驗，數(shù)值表示：中位數(shù)，以細胞數(shù)/mm3表示。相關性分析采用Spearmans等級相關分析，以P<0.05為有差異顯著性。2.結果

2.1各組間小氣道病變積分見表5在以上3組內，吸煙者與非吸煙者病理積分各項間均無顯著性差異，P>0.05。86例患者僅6例出現(xiàn)小氣道上皮細胞鱗化，12例上皮可見杯狀細胞，未做統(tǒng)計學分析。見圖1、2、3、4。圖1正常小氣道圖3小氣道病變圖4COPD表5組間小氣道病變積分

正常組小氣道病變組COPD組FP炎性細胞浸潤5.03±2.016.88±2.94*6.70±2.46*4.850.01平滑肌肥厚6.40±2.217.82±2.30*7.83±2.19*5.280.007結締組織增生6.60±2.307.00±1.846.70±2.300.300.75管腔狹窄5.10±2.666.39±2.577.52±2.89*5.360.006潰瘍5.30±2.095.24±2.487.30±2.75*#5.920.004色素沉著1.07±2.130.73±1.631.13±2.140.370.69杯狀細胞增生

鱗狀上皮化生

總分29.57±6.1134.09±7.99*37.17±9.16*6.540.002*：P<0.05與正常組相比#：P<0.05與小氣道病變組相比

表6小氣道粘膜層炎性細胞（中位數(shù)，全距，細胞數(shù)/mm3）組別例數(shù)NLME合計正常組3066(0-363)792(264-3234)66(0-363)0(0-99)940(363-3498)小氣道病變組3433(0-462)1254(6-2013)*99(0-495)0(0-264)1485(693-3666)*COPD組2299(0-693)1254(528-3102)*66(0-289)16.5(0-264)1551(627-3300)**：P<0.05與正常組比2.3病理積分與肺功能指標之間相關性分析2.3.1正常組：V50、V25與病理積分各項間均無相關性，P>0.05。2.3.2小氣道病變組：V50與結締組織增生、平滑肌肥厚呈顯著負相關，相關系數(shù)-0.487及-0.404，P<0.05；V25與平滑肌肥厚呈顯著負相關，相關系數(shù)-0.377，P<0.05。其他指標間無相關性。2.3.3COPD組：炎性細胞浸潤與FEV1.0、V50顯著負相關，相關系數(shù)分別為-0.524，-0.428，P<0.05。關于小氣道病變炎性細胞分布特點的報道較少，本文發(fā)現(xiàn)：小氣道病變及COPD患者其小氣道粘膜層均以淋巴細胞浸潤為主，明顯高于正常組，而中性粒細胞、單核細胞及嗜酸性粒細胞在三組之間無差異顯著性，僅有少數(shù)病例氣道中見到嗜酸性粒細胞，提示小氣道病變及COPD患者小氣道粘膜層均存在以淋巴細胞為主的炎癥，而嗜酸性粒細胞在COPD中作用不大。本文未發(fā)現(xiàn)吸煙組與非吸煙組小氣道粘膜層炎性細胞浸潤有明顯差異。Ⅲ小氣道病變患者小氣道粘膜層免疫病理的研究

材料與方法

對象本研究病例選擇標準[3]：（1）因肺局限性病變需行全肺切除或肺葉切除者；（2）無明顯心、肝、腎及其他重要病史；（3）術前2周內無急性呼吸道感染史；（4）無哮喘及其它過敏性疾患史；（5）肺局限性病灶位于段支氣管以下，以減少局部病灶對肺功能檢查的影響。按以上標準選擇病例86例，年齡24~70歲，男性53例，女性33例。其中肺癌72例，炎性假瘤6例，結核球4例，支氣管擴張2例，錯構瘤1例，胸膜間皮瘤1例。12便為單側全肺切除，74例肺葉切除。

根據(jù)中華醫(yī)學會呼吸病學會COPD診斷標準將上述患者分為3組[10，13]：（1）正常組30例：FEV1.0%預計值>80%；FEV1.0/FVC>70%；V50和V25%預計值>70%；（2）小氣道病變組34例：FEV1.0%預計值>80%；FEV1.0/FVC>70%；V50和（或）V25%預計值<70%；（3）COPD組22例：FEV1.0%<70%和或FEV1.0%預計值<80%；△FEV1.0<15%?；颊咭话闱闆r見表7。

表7患者一般情況（－χ±S）

正常組小氣道病變組COPD組例數(shù)303422年齡（歲）53±752±954±6男/女18/1220/1415/7吸煙者172016FEV1.0%Pred103±1686±757±15FEV1.0/FVC79.5±3.573.5±2.654.6±4.0V50%Pred93±1861±1336±19V25%Pred95±2260±1430±15表I表明三組間年齡、性別、吸煙者比例均無差異，具有可比性。

肺標本處理（一）收集術后肺標本，于距病變邊緣4cm以外處取1×1×0.5cm3組織2塊，以10%中性甲醛浸泡固定，脫水，石臘包埋，切片厚度5mm。（二）免疫組化染色：采用生物素標記的第二抗體與鏈霉素抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及底物色素混合液測定細胞表面分化抗原，測定外周氣道粘膜層內CD3+、CD8+、CD68+、CD20+、CD45RA+、CD45RO+細胞：CD3：T淋巴細胞CD8：T淋巴細胞中與MCHⅡ結合的亞群，包括抑制性T淋巴細胞（Ts）及殺傷性T淋巴細胞（Tc）.CD20：B淋巴細胞CD68：單核巨噬細胞CD45RA：未成熟T淋巴細胞、B細胞、NK細胞CD45RO：活化T淋巴細胞、B細胞、粒細胞、單核細胞（三）免疫組化染片：每例患者取完整的小氣道（內徑<2mm，TD2000測得）2個，每個小氣道由上皮內緣向外取4個油鏡視野（10×100倍，直徑140μm），計數(shù)視野中陽性細胞數(shù)（CD3+、CD8+、CD20+、CD68+、CD45RA+、CD45RO+）取均數(shù)，以陽性細胞數(shù)/mm2表示。陽性細胞為細胞膜部位染色，呈均勻棕色，每種均做陽性及陰性對照片。40例測定大氣道粘膜下層炎性細胞。統(tǒng)計學分析

應用SPSS軟件分析。組間CD3+、CD8+、CD20+、CD68+、CD45RA+、CD45RO+細胞比較采用秩合檢驗；與FEV1.0、V50、V25相關性采用Spearman’s等級相關分析；以P<0.05為有差異顯著性，數(shù)據(jù)表示：中位數(shù)（全距）結果

一、小氣道粘膜層CD3+、CD8+陽性細胞等特點表8小氣道粘膜層CD系列陽性細胞數(shù)（個/mm2），中位數(shù)（全距）

正常組小氣道病變組COPP組CD3726(313.5-2161.5)990(8-1914)*1188(528-2178)*CD8420.8(132-1466)618.8(165-1155)*511.5(132-1172)*CD68313.5(0-1864)709.5(0-2316)*792(330-1980)*CD45RO891(0-3465)907.5(0-3630)664(132-1782)*：P<0.05與正常組相比圖5正常組CD3圖6小氣道病變組CD3圖7小氣道病變組CD8圖8COPD組CD8圖9小氣道病變組CD45RO油鏡圖10COPD組CD68二、組內CD3+、CD8+、CD45RO+、CD68+細胞數(shù)與FEV1.0、V50%、V25%預計值相關性分析。1、正常組內，均無相關性，P>0.05。2、小氣道病變組：小氣道粘膜層CD8+細胞數(shù)/mm與V50呈顯著負相關，相關系數(shù)-0.342，P=0.005，其余指標間無顯著相關性。3、COPD組：均無相關性P>0.05。三、各組內吸煙者與非吸煙者相比表9吸煙與非吸煙者小氣道粘膜CD+細胞數(shù)(個/mm2），中位數(shù)(全距)

組別例數(shù)CD3CD8CD68CD45RO小氣道病變組吸煙201039.5(8-1914)734(165-1155)0(0-1683)853.9(75.9-3630)非吸煙14957(9-1749)511.5(165-1056)974(366-2316)*#1023(0-1914)COPD組吸煙201122(528-1881)544.5(132-1172)924(330-1980)□664(330-1782)非吸煙21353(1056-2178)512(264-792)627(479-1782)549(132-1188)正常組吸煙17990(354-2162)355(132-1466)297(0-1865)990(396-3465)△非吸煙13693(396-1386)462(132-1043)330(0-1650)726(0-1122)

*P=0.01與吸煙組相比△P=0.03與非吸煙組相比#P0.003與正常組非吸煙者相比□P0.05與正常組、小氣道病變組吸煙者相比四、大氣道免疫組化特點：表10三組中炎性細胞的分布：中位數(shù)（最小值~最大值）組別CD3CD8CD68CD45RO正常對照組800(330~1900)460(200~660)460(0~1050)1550(825~3370)小氣道病變組1360(400~2380)*725(260~1500)*645(0~2870)2045(660~3370)COPD組1120(790~1980)*660(400~1320)*660(0~1780)1290(549~1990)*與正常對照組相比討論

一、小氣道免疫病理：

CD3+細胞為成熟T淋巴細胞，介導細胞免疫，包括兩個亞群：（1）CD4+細胞：包括輔助T細胞（TH）及誘導T細胞（T1）。（2）CD8+細胞：包括抑制性T細胞（TS）及殺傷性T細胞（Tc），Ts可抑制T、B淋巴細胞功能，對免疫反應有下調作用；Tc殺傷靶細胞。新近的研究發(fā)現(xiàn)CD8+細胞還可產生IL-5及IL-8，導致嗜酸性粒細胞及中性粒細胞在支氣管粘膜聚集[14]。CD20是B細胞分化抗原，標記早期及成熟B細胞。CD45為白細胞共同抗原（LCA），CD45RA）主要標記B細胞、NK細胞及未經(jīng)抗原刺激的T細胞，CD45RO主要標記抗原刺激分化的活性T細胞、B細胞、粒細胞及單核細胞，CD45RO+細胞對再次抗原刺激可發(fā)生更強的增殖反應。CD68主要由單核細胞、巨噬細胞表達，用以標記單核-巨噬細胞。

本組結果顯示：小氣道病變組及COPD組，小氣道粘膜層內CD3+、CD8+及CD68+細胞均明顯高于正常對照組，而B淋巴細胞極少見，說明T淋巴細胞及CD68+細胞（單核巨噬細胞）在小氣道病變及COPD炎性過程中有重要意義，且小氣道病變組CD8+細胞數(shù)與V50呈顯著負相關，提示CD8+細胞浸潤與小氣道病變功能改變關系更為密切，說明小氣道病變是以T淋巴細胞尤其是CD8+淋巴細胞浸潤為主的炎癥。本組結果還顯示小氣道病變組與COPD組之間無顯著差異，說明兩者有相同的病理基礎，而此病理特點與哮喘不同，哮喘T細胞浸潤是以CD4+細胞為主[15]。吸煙是引起小氣道病變的主要原因，目前國外的研究均集中于此，然而，僅有20%的人最終發(fā)展成為COPD[16]。這說明宿主因素與COPD發(fā)生有關。在吸煙者外周血中淋巴細胞總數(shù)，CD8+細胞數(shù)均高于非吸煙者，而CD4+/CD8+則降低[17]。在吸煙者肺泡灌洗液中，也發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞增多，CD4+/CD8+比值降低[18，19]

Saetta等對吸煙的外周氣道（內周徑≤6mm）研究發(fā)現(xiàn)[21，22]：吸煙的COPD患者上皮層內CD8+、CD45+、CD68+細胞均較非吸煙者升高，且CD8+與FEV1.0呈顯著負相關。與本組結果類似。但反映小氣道的肺功能指標是V50、V25，Saetta等以小氣道上皮層CD8+細胞與FEV1.0做相關有一定局限性。引起小氣道病變的非吸煙原因包括感染、氣候、理化因素等，對這類原因引起的小氣道病變及COPD的病理研究未見報道。本組研究資料顯示：正常吸煙者CD45RO+細胞明顯高于非吸煙者，這是一組炎性細胞，包括活化T細胞、B細胞、粒細胞及單核細胞等，說明吸煙可導致活化T細胞在小氣道粘膜募集。在小氣道病變組非吸煙者CD68+細胞均較吸煙者高，因為非吸煙因素包括感染等，CD68+細胞有可能在這類原因所致小氣道病變中起主要作用。在COPD組吸煙及非吸煙之間無差異顯著性。本組結果還顯示COPD、小氣道病變組吸煙及非吸煙者間，除小氣道病變組CD68外，余CD3+、CD8+、CD45RO+細胞數(shù)均無差異顯著性，說明無論是吸煙或其他因素導致的小氣道病變，其病理特點大部分是相同的。二、大氣道的免疫病理：

本課通過肺功能MEFV中V50及V25兩項指標，對非COPD患者進一步分為肺功能正常組與小氣道病變組，并對其大氣道粘膜進行免疫組化。研究發(fā)現(xiàn)無論小氣道病變組或COPD組，其大氣道中炎性細胞分布有共同的特點，CD3+及CD8+細胞均明顯高于對照組，這說明在小氣道病變組，既使反映大氣道通氣功能的指標如FVC、FEV1.0/FVC等尚未出現(xiàn)異常時，其大氣道已經(jīng)出現(xiàn)類似于COPD的病理變化。Ⅳ小氣道病變病因治療的臨床研究

對其的診斷及病理研究較多，而其治療研究極少。1994年至2000年我們對門診310例小氣道病變患者進行病因治療，其中127例肺功能恢復?，F(xiàn)報告如下：1.資料和方法1.1臨床資料：310例患者中男性186例，女性124例，年齡18~64歲。均無慢性支氣管炎和肺疾病史。多因咳嗽或胸悶來診。小氣道病變通過chest-65型肺功能儀測得，標準如下[10]：第1秒用力肺活量（FEV1.0）預計值≥80%；FEV1.0與用力肺活量（FVC）比值≥70%；50%及25%用力肺活量時呼氣流速（V50、V25）/預計值<70%，患者一般情況見表12。

表12患者一般情況

吸煙組感染組過敏組原因未明組總計例數(shù)115160926310年齡48±1351±747±949±649±4男/女92/3266/804/518/22176/134FVC87.96±8.2487.89±9.0886.8±11.986.4±8.4387.8±9.1FEV188.98±7.5989.33±8.3189.2±9.389±8.1289.2±7.3V5055.3±10.6652.24±7.2351.6±11.358.1±9.5856.6±8.4V2552.24±9.1153.74±8.5950.8±6.651.1±11.5753.2±6.7病因分析：有呼吸道感染患者160例，吸煙者（每日>10支，≥10年）115例，原因未明者26例，過敏組9例。1.2治療方法1.2.1感染引起者，口服抗生素（阿莫西林、頭孢拉定、氧氟沙星