生物化學(xué)蛋白質(zhì)3課件

第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)四、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性五、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)+OH－+H++OH－+H+COOHPrH3N+COO－PrH3N+COO－PrH2NpH＜pI

pH=pI

pH＞pI

由于蛋白質(zhì)是由氨基酸組成，氨基酸所具有的兩性游離性質(zhì)，蛋白質(zhì)也同樣具有。

一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH值時，蛋白質(zhì)解離成正離子和負(fù)離子的趨勢相等，為兼性離子，即總凈電荷為零，此時在電場中，蛋白質(zhì)分子既不向陽極移動，也不向陰極移動，這個pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，用pI來表示。二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的性質(zhì)，常將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋中，置于流水中逐漸將小分子雜質(zhì)除去，起到純化的目的，這種方法即為透析。利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的性質(zhì)發(fā)展了的另一蛋白質(zhì)純化方法—超濾。二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)形成水化層形成雙電層為什么蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)1．鹽析和鹽溶法2．有機(jī)溶劑沉淀法3．重金屬鹽沉淀法4．生物堿試劑以及某些酸類沉淀蛋白質(zhì)5．加熱凝固1．鹽析和鹽溶法鹽溶：少量的中性鹽，會增加蛋白質(zhì)分子表面的電荷，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子與水分子的作用，從而使蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度增大。原理：蛋白質(zhì)吸附某種鹽離子→雙電層→蛋白質(zhì)彼此排斥。蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用加強(qiáng)，因而溶解度提高。1．鹽析和鹽溶法鹽析蛋白質(zhì)分子表面聚集了許多水分子，當(dāng)鹽濃度高時，水分子被鹽抽出，蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域暴露并相互結(jié)合，沉淀。1．鹽析和鹽溶法鹽析：向蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的中性鹽，可有效地破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化層，同時中和了蛋白質(zhì)的電荷，降低了蛋白質(zhì)的溶解度，從而使蛋白質(zhì)沉淀。常用：以硫酸銨（中性鹽）最常應(yīng)用。因其溶解度大，且不易傷害蛋白質(zhì)，另外還有硫酸鈉、硫酸鎂及氯化鈉等。3．重金屬鹽沉淀法pH稍大于等電點(diǎn)為宜，因為此時蛋白質(zhì)帶負(fù)電，易與金屬離子結(jié)合成鹽。通常這種沉淀為變性的，如控制溫度（低溫）并控制重金屬離子濃度，則可用于分離制備不變性的蛋白質(zhì)。4．生物堿試劑以及某些酸類沉淀蛋白質(zhì)某些生物堿試劑（如苦味酸、鎢酸、鞣酸、碘化鉀等）及某些酸（三氯乙酸、水楊磺酸、硝酸等）與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性的鹽沉淀。沉淀條件應(yīng)當(dāng)是pH小于等于電點(diǎn)，這樣蛋白質(zhì)帶正電，易與酸根負(fù)離子結(jié)合成鹽。5．加熱凝固將接近于等電點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)溶液加熱可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固而沉下。雞蛋煮熟后，本來流動的蛋清、蛋黃都變成固體樣的東西了。1．蛋白質(zhì)變性的概念蛋白質(zhì)變性是指通過某些物理或化學(xué)因素的作用，使蛋白質(zhì)天然的空間構(gòu)象破壞，從而引起蛋白質(zhì)若干理化和生物學(xué)性質(zhì)的改變。蛋白質(zhì)變性作用的實質(zhì)是維持蛋白質(zhì)分子高級結(jié)構(gòu)的次級鍵和二硫鍵被破壞，引起天然構(gòu)象解體，但維持主鏈的共價鍵－肽鍵并未被打斷，即一級結(jié)構(gòu)保持完好。1．蛋白質(zhì)變性的概念2．蛋白質(zhì)變性的誘因與結(jié)果能使蛋白質(zhì)變性的因素很多，可分為化學(xué)因素和物理因素兩大類。化學(xué)因素有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、胍、去污劑、重金屬鹽、三氯醋酸、磷鎢酸、苦味酸、濃乙醇等。物理因素有加熱（70～100℃）、劇烈振蕩或攪拌、紫外線及X射線照射、超聲波等。3．蛋白質(zhì)的復(fù)性復(fù)性:某些變性蛋白質(zhì)，再除去變性因素后，可以“復(fù)性”。蛋白質(zhì)的復(fù)性是一個十分復(fù)雜的過程，除了要去除變性因素，多數(shù)蛋白還需要一些其他因素的協(xié)助來恢復(fù)蛋白質(zhì)的正確折疊。在復(fù)性過程中，不同的蛋白質(zhì)充分體現(xiàn)出自身的特性，沒有可以通用的方法。五、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)是指利用蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或利用肽鍵、以及酚基等特殊氨基酸殘基的特性，使其與一些試劑發(fā)生反應(yīng)而生成有色物質(zhì)。蛋白質(zhì)由氨基酸組成，氨基酸的一些顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)往往也都具有。氨基酸所沒有的一些顏色反應(yīng)，主要是雙縮脲反應(yīng)，是蛋白質(zhì)常用的定量分析方法。五、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)原理:蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應(yīng)，形成紅紫色混合物。應(yīng)用:可以用此反應(yīng)來定性測定蛋白質(zhì)；也可在540nm處比色，定量測定蛋白質(zhì)。第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)氨基酸性質(zhì)蛋白質(zhì)性質(zhì)兩性性質(zhì)物理性質(zhì)兩性性質(zhì)紫外吸收化學(xué)性質(zhì)分離純化測定鹽析等電點(diǎn)凝膠過濾分子大小膠體性質(zhì)沉淀作用α－NH2α－COOH共同R基顏色反應(yīng)含量測定變性復(fù)性離子交換電泳含量測定第六節(jié)氨基酸及蛋白質(zhì)的分析和分離一、氨基酸的分析分離二、蛋白質(zhì)的分離和純化三、蛋白質(zhì)的定量檢測四、蛋白質(zhì)的純度分析

利用層析法分離混合物，例如氨基酸混合物，其先決條件是各種氨基酸成分的分配系數(shù)要有差異，哪怕是很小的差異，一般差異越大，越容易分開。

1．層析法的基本原理2．常用的氨基酸層析方法（1）紙層析（2）薄層層析（3）離子交換層析（4）高效（高壓）液相色譜（1）紙層析紙層析是利用混合物各組分在流動相和固定相兩種不同溶劑中分配系數(shù)的差異，將它們分離開。紙層析以濾紙為隋性支持物，濾紙纖維和水有較強(qiáng)的親和力，在一般條件下較難脫去，而濾紙纖維與有機(jī)溶劑的親和力甚弱，所以紙層析的固定相是被濾紙纖維吸附的結(jié)合水。紙層析以有機(jī)溶劑為流動相，也稱為層析液，在毛細(xì)拉力的作用下，層析液能不斷由下向上流動。（1）紙層析層析時，混合氨基酸在水和有機(jī)相之間不斷進(jìn)行分配，使它們分布在濾紙的不同位置，從而使物質(zhì)得到分離和提純。最后用茚三酮顯色。（1）紙層析氨基酸的混合物點(diǎn)在濾紙的一個角上，把這個點(diǎn)稱為原點(diǎn)。氨基酸在濾紙上移動的速度稱為比移值或遷移率，以符號Rf代表。Rf也就是原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)（即原色點(diǎn)）中心的距離(DA)與原點(diǎn)到溶劑前沿的距離（Ds）的比值。Rf＝DA/DS（2）薄層層析薄層層析的基本原理是利用混合物各組分在某一物質(zhì)中的吸附性能、溶解性能（即分配）或者其它親和作用性能的差異，使混合物溶液中的各種物質(zhì)，進(jìn)行反復(fù)的吸附或者分配等作用，從而將各種組分分開。根據(jù)分離的原理不同，薄層層析可以分為吸附薄層層析和分配薄層層析兩類。（2）薄層層析（3）離子交換層析離子交換層析是一種用離子交換劑作為支持劑的層析方法。分離原理是在一定離子強(qiáng)度和pH等條件下，由于樣品中目標(biāo)純化分子和雜質(zhì)分子與吸附劑之間的吸附與解吸能力不同，達(dá)到分離純化目標(biāo)分子的目的。一般需經(jīng)過加樣、吸附、洗滌、洗脫和凝膠再生幾個環(huán)節(jié)。（3）離子交換層析（3）離子交換層析常用于氨基酸分離的離子交換劑是樹脂。帶有正電荷的樹脂稱之為陰離子交換樹脂。而帶有負(fù)電荷的稱之為陽離子樹脂。它們分別和不同帶電性質(zhì)的離子基團(tuán)發(fā)生離子交換。（4）高效（高壓）液相色譜液相色譜法是以液體為載體，將樣品帶入色譜儀進(jìn)行分析的方法。高效液相色譜（HPLC）采用了高壓泵、高效分離柱、高靈敏度檢測器等，使分離效能、分析速度、檢測靈敏度比經(jīng)典液相色譜有了很大的提高。HPLC適用于分析分離不易揮發(fā)的極性物質(zhì)。（4）高效（高壓）液相色譜高效液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)等五大部分組成。（4）高效（高壓）液相色譜氨基酸的高效液相色譜圖二、蛋白質(zhì)的分離和純化

1．蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟

2．蛋白質(zhì)分離純化的常用方法

1．蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟（1）材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎（2）蛋白質(zhì)的抽提（3）蛋白質(zhì)粗制品的獲得（4）樣品的進(jìn)一步分離純化（1）材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎預(yù)處理的主要目的是去除原材料中的部分可溶性雜質(zhì)，分離含有蛋白的細(xì)胞。分離提純某一種蛋白質(zhì)時，首先要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。常用的破碎方法有：機(jī)械破碎法、滲透破碎法、反復(fù)凍融法（對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法）、超聲波法和酶法等。機(jī)械破碎法是最常用的細(xì)胞破碎方法。（1）材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開來，首先獲得蛋白質(zhì)粗制品。方便有效的方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)行分離。常用下列幾種方法：等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法。（2）蛋白質(zhì)的抽提選擇適當(dāng)?shù)木彌_液把蛋白質(zhì)提取出來，即為蛋白質(zhì)的抽提。抽提所用緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。在抽提過程中，應(yīng)注意選擇合適的溫度條件，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。（3）蛋白質(zhì)粗制品的獲得常用的方法有：層析法（凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等）；電泳法和超離心法等。有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。2．蛋白質(zhì)分離純化的常用方法（1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法（2）利用溶解度差別的純化方法（3）根據(jù)電荷不同的純化方法（4）利用選擇性吸附的純化方法（5）利用對配體的特異親和力的純化方法（1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法①透析法②超濾法③離心法④凝膠過濾法（1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法血液透析小分子溶出小分子被帶出透析機(jī)透析液血液加壓①透析透析法是利用蛋白質(zhì)的分子比較大，不能透過半透膜的特點(diǎn)，實現(xiàn)蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)分離的方法。（1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法②超濾利用一定的壓力使樣品通過半透膜，這時，小分子和水組成的溶質(zhì)可以被濾過，而大分子的蛋白質(zhì)則留在膜內(nèi)，這種方法稱為超濾法，亦稱微濾法。（1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法離心分離是利用離心慣性力的作用分離非均相混合物的方法。由于懸浮液中顆粒的沉降速率不僅取決于顆粒本身的性質(zhì)，而且也取決于懸浮顆粒介質(zhì)以及作用在顆粒上的力，因此常采用密度梯度離心法對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。密度梯度離心法是在離心管中通過某種介質(zhì)來提供一個密度梯度環(huán)境，然后加入待分離的物質(zhì)，通過離心的方法達(dá)到分離的目的。③離心法蔗糖濃度％4％8％12％16％20％塑料離心管滴加樣品蛋白質(zhì)的位置決定于它的大小，密度。（1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法③離心法（1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法凝膠過濾層析也稱為分子篩層析，可以對含有不同大小分子的混合物進(jìn)行分離。凝膠過濾層析是通過一定的載體來實現(xiàn)的，載體的孔徑不同，分離的分子大小范圍也不相同。分離過程是基于蛋白質(zhì)在自由流動溶劑和存在于多孔凝膠中的固定溶劑間的分配。④凝膠過濾法（3）根據(jù)電荷不同的純化方法A裝好的凝膠過濾層析柱；B蛋白質(zhì)混合物上樣；C不同大小的蛋白質(zhì)分子通過層析柱；D蛋白出峰圖；④凝膠過濾法利用凝膠過濾層析，除了可以進(jìn)行混合物的分離外，還能測定樣品的相對分子質(zhì)量。（2）利用溶解度差別的純化方法①溶液的pH會影響蛋白質(zhì)的溶解度。②溶液中的鹽離子濃度也會影響蛋白質(zhì)的溶解度。③溶劑的極性同樣會影響蛋白質(zhì)的溶解度。（2）利用溶解度差別的純化方法當(dāng)溶液的pH與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)相同時，蛋白質(zhì)分子呈現(xiàn)電中性，分子間無斥力，分子易于積聚和沉淀，此時蛋白質(zhì)的溶解度是最小的，這種使蛋白質(zhì)沉淀的方法稱為等電點(diǎn)沉淀。不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用這一特性，可以通過改變?nèi)芤旱膒H，使要分離的蛋白質(zhì)沉降出來，這些蛋白質(zhì)仍然能夠保持天然的生物學(xué)活性，該方法可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)的粗分離。（2）利用溶解度差別的純化方法鹽溶現(xiàn)象。鹽析現(xiàn)象。（2）利用溶解度差別的純化方法與水混溶的有機(jī)溶劑能減少水和蛋白質(zhì)間的作用力，使蛋白質(zhì)脫水。有機(jī)溶劑的加入能降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子間的作用力增強(qiáng)，蛋白質(zhì)分子易于聚集沉淀。（3）根據(jù)電荷不同的純化方法①電泳②離子交換層析①電泳電泳是溶液中帶電粒子（離子）在電場中移動的現(xiàn)象。利用帶電粒子在電場中移動速度不同而使目標(biāo)分子分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)。在一定的pH溶液中，蛋白質(zhì)的遷移方向取決于它們帶電的性質(zhì)和數(shù)量，同時也受蛋白質(zhì)形狀的影響。十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）可以完全依據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，來對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)電泳通常使用的支持物是聚丙烯酰胺凝膠。①電泳SDS電泳示意圖①電泳等電聚焦在等電聚焦時，蛋白質(zhì)分子是在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中進(jìn)行電泳。不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)分子在等電聚焦電泳結(jié)束后，會分別聚集于其等電點(diǎn)的位置，這樣不同的蛋白質(zhì)分子就得以分離。②離子交換層析是用離子交換樹脂作支持劑的一種層析法。離子交換樹脂是具有酸性或堿性基團(tuán)的人工合成聚苯乙烯酸等不溶性高分子化合物。②離子交換層析RCHCOOHNH3++M1A+RCHCOOHNH3M1+A+

氨基酸（在酸性溶液中）陽離子交換劑

氨基酸鹽RCHCOO－NH2+M2B－RCHCOOM2NH2+B－

氨基酸（在堿性溶液中）陰離子交換劑

氨基酸鹽M1為酸性基團(tuán)，M2為堿性基團(tuán)（4）利用選擇性吸附的純化方法吸附層析是利用待純化的分子和雜質(zhì)分子與吸附劑之間的吸附能力和解吸性質(zhì)不同，達(dá)到使它們分離的目的。硅膠、氧化鋁、活性炭等物質(zhì)為固體吸附劑，能夠?qū)⑵渌肿游皆诒砻?。吸附層析的分離效果，決定于吸附劑、溶劑和蛋白質(zhì)的性質(zhì)三個因素。（5）利用對配體的特異親和力的純化方法原理：利用蛋白質(zhì)分子能與其相對應(yīng)的配體進(jìn)行特異的、非共價的、可逆的結(jié)合來分離純化，即親和層析法。配體：指能與某些蛋白質(zhì)進(jìn)行特異結(jié)合的化合物，如配體的作用物及抑制劑、激素和受體、抗原和抗體、酶及底物等。（5）利用對配體的特異親和力的純化方法親和色譜顆粒三、蛋白質(zhì)的定量檢測1．凱氏定氮法2．紫外-分光光度計法3．雙縮脲法（Biuret法）4．Folin-酚試劑法（Lowry法）5．考馬斯亮藍(lán)G-250染色法（Bradford法）6．BCA法1．凱氏定氮法原理：氮在蛋白質(zhì)分子中含量恒定（平均占16%），因此測出樣品中氮的含量后，即可求得樣品中蛋白質(zhì)含量。每克樣品中含氮的克數(shù)×6.25×100=100克樣品中蛋白質(zhì)的含量（克%）。2．紫外-分光光度計法由于蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸在280nm左右具有最大吸收，所以在280nm吸收值與濃度成正比，可用于蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)濃度mg/ml=1.45A280－0.74A260由于此法非常簡便，條件要求低，因此常作為粗略定量蛋白質(zhì)的方法來使用。3．雙縮脲法（Biuret法）包含肽鍵基團(tuán)的化合物能與硫酸銅-氫氧化鈉溶液產(chǎn)生雙縮脲顏色反應(yīng)，生成紫紅色或藍(lán)紫色的復(fù)合物。在540nm處測定其吸光值，此值與蛋白質(zhì)的含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。雙縮脲法的測定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)是快速，缺點(diǎn)是靈敏度差。4．Folin-酚試劑法（Lowry法）又叫Lowry法其原理是堿性銅試劑與蛋白質(zhì)發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，然后蛋白質(zhì)中的酚基（如酪氨酸）在堿性條件下很容易將混合試劑（含有磷鉬酸和磷鎢酸）還原或藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，在650~660nm下測定光吸收值，即可測定蛋白質(zhì)含量。此法比雙縮脲法靈敏100倍。蛋白質(zhì)測量范圍在25~250mg/ml，因此是通用的方法之一。但其受還原劑、EDTA、Tritonx-100及酚的影響，并且蛋白質(zhì)的種類不同，有較大的變動。5．考馬斯亮藍(lán)G-250染色法（Bradford法）用考馬思亮蘭G-250染色蛋白質(zhì)，出現(xiàn)的顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比。其顏色在595nm的光波下，有強(qiáng)烈吸收峰。常用此反應(yīng)來定量測定蛋白質(zhì)含量。6．BCA法BCA法是對一價銅離子敏感、穩(wěn)定