環(huán)境毒理學常用實驗方法課件

環(huán)境毒理學常用實驗方法急性毒性實驗蓄積性毒性實驗亞慢性和慢性毒性實驗致突變試驗致畸試驗致癌試驗毒理學

實驗基礎(chǔ)實驗動物（laboratoryanimal）經(jīng)人工培育，對其攜帶微生物實行控制，遺傳背景明確，來源清楚，可用于科學研究的動物。溫血動物(恒溫動物)

兔、豚鼠、大鼠、小鼠有時也用猴、狗、貓等實驗動物的選擇實驗動物的選擇種屬的選擇個體選擇年齡體重性別生理狀態(tài)健康狀況

實驗動物的選擇種屬的選擇機體反應上盡量近似于人體；易獲得、易飼養(yǎng)、易管理；最敏感、最合適；選用幾種不同種屬的動物(對毒作用不清楚的化學物質(zhì))；借助已有毒理學研究資料選擇。

實驗動物的選擇借助已有毒理學研究資料選擇氣體、蒸氣對粘膜的刺激作用——貓毒物對皮膚的局部作用——豚鼠或兔(皮膚對刺激物的反應近似于人)

過敏性反應——豚鼠(易于致敏)

觀察致嘔吐作用的實驗研究——狗、貓外界環(huán)境因素引起機體體溫過高及體溫過低的反應——兔或貓(大鼠、小鼠對于體溫調(diào)節(jié)不穩(wěn)定)

高血壓病理——狗、兔、大鼠(易出現(xiàn)血壓變化)

物質(zhì)的致癌作用——小鼠和大鼠慢性中毒損害實質(zhì)性臟器的毒物——小鼠(實質(zhì)性臟器容易罹患病變)常用染毒途徑和方式(1）經(jīng)口灌胃、喂飼、吞咽膠囊

（2）經(jīng)呼吸道動物自行吸收（靜式吸入染毒、動式吸入染毒）

人工動物氣管注入（3）經(jīng)皮膚（4）其它途徑注射途徑

常用染毒途徑和方式(1)經(jīng)口染毒①灌胃用灌胃器將所應投給動物的藥灌到動物胃內(nèi)；直接灌入胃內(nèi)，不與口腔及食道接觸；給予的化學物劑量準確。

②喂飼將化學物溶于無害的溶液中拌入飼料或飲用水中，使動物自行攝入含化學物的飼料或水，然后依每日食入的飼料與水再推算動物實際攝入化學物的劑量。

常用染毒途徑和方式(1)經(jīng)口染毒

優(yōu)點：接觸化學物的方式符合人類接觸污染食物與水的方式，方法簡便、易操作。缺點進食時浪費、損失飼料多，攝入的量不準確；如果化學物有異味，動物可能拒食；如果化學物在室溫下可以揮發(fā)，或在飼料中和水中可以水解，則劑量也不準確；有經(jīng)呼吸道與皮膚交叉吸收的可能；更適宜進行多日染毒，急性毒性試驗一般不用之。

（2）經(jīng)呼吸道染毒

凡是氣態(tài)或易揮發(fā)的液態(tài)化學物均有經(jīng)呼吸道吸入的可能，在生產(chǎn)過程中形成氣溶膠的化學物也可經(jīng)呼吸道吸入。類型:動物自行吸收靜式吸入染毒動式吸入染毒人工動物氣管注入

人工動物氣管注入——將液態(tài)或固態(tài)外源化學物注入肺內(nèi)。這是一個手術(shù)過程，僅適用于制造化學物對肺臟損傷模型的制備，而不用于一般毒性研究。常用染毒途徑和方式靜式吸入染毒在一定容積的染毒柜內(nèi)加入一定量受試物，造成含一定濃度受試物的空氣環(huán)境，使受試動物在規(guī)定時間內(nèi),經(jīng)吸入而達到染毒，適用于短時間染毒的試驗。動式吸入染毒采用機械通風為動力，連續(xù)不斷地將含有已知濃度受試物的新鮮空氣送入染毒柜內(nèi)，并排出等量的污染氣體，使染毒濃度保持相對穩(wěn)定，這樣可使染毒時間不受染毒柜(室)容積的限制，也可避免動物缺氧、CO2積聚、溫度增加等對試驗結(jié)果的可能影響，適用于較長時間以及反復染毒的試驗使用。常用染毒途徑和方式實驗前詳細檢查去毛部位皮膚有無擦傷、紅腫、皮疹等異?，F(xiàn)象，剔除不合格動物。染毒時按單位體重確定給予所需毒劑的容量。接觸時間應與人實際接觸該物質(zhì)的時間相仿。常用染毒途徑和方式成年動物——年老動物表皮厚度、細胞成分改變?yōu)楸ＷC不因皮膚部位不同而形成的化學物滲透率差異，一般大鼠、豚鼠、兔均使用背部皮膚。面積則依據(jù)選用動物及受試物的劑量和劑型而定。（如家兔可取5cm×6cm、豚鼠取3cm×4cm、大鼠取1.5cm～2.0cm直徑的面積，小鼠取1.0cm～1.5cm直徑的面積。）（3）經(jīng)皮膚染毒（4）其它途徑染毒

有時需對外源化學物進行絕對毒性或比較毒性研究，或進行一些必要的特殊研究(如靜脈注射毒物動力學、代謝研究、急救藥物篩選等)，往往用注射途徑染毒。靜脈注射:大鼠、小鼠尾靜脈，兔耳緣靜脈

注射途徑肌肉注射皮下注射腹腔注射:小動物常用染毒途徑和方式動物實驗的一般操作方法二、急性毒性試驗的目的

探求化學物的致死劑量，以初步評估其對人類的可能毒害的危險性；求該化學物的劑量-反應關(guān)系，為其它毒性實驗打下選擇染毒劑量的基礎(chǔ)。表示急性毒性大?。篖D50急性毒性試驗三、急性毒性試驗的內(nèi)容（1）急性毒性測定確定一次染毒的LD50或LC50；（2）經(jīng)皮膚染毒實驗考察受檢化學物質(zhì)能否經(jīng)皮膚進入體內(nèi)，LD50；（3）局部作用實驗通過使受檢化學物質(zhì)直接接觸皮膚及眼結(jié)膜等試驗，研究其對生物體局部有無刺激、腐蝕及其他危害作用。急性毒性試驗三、急性毒性試驗的內(nèi)容（4）中毒癥狀的觀察據(jù)染毒動物癥狀及體征，粗略了解毒物作用的程度和可能作用部位。（5）功能及病理組織學檢查選擇必要的功能指標，尋求毒作用劑量與功能改變的關(guān)系，確定急性閾劑量；通過病理組織學檢查，進一步了解毒作用部位及毒害程度。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（一）半數(shù)致死量(LD50、LC50)的測定2.劑量選擇先查閱文獻中與受試物的類似物LD50或LC50；以3倍之差的三個劑量組進行預實驗，每組3只動物，求出動物全活、全死劑量；在預試驗的全活全死劑量之間設(shè)5～6個劑量組，各組間劑量差距常按等比級數(shù)1.2～1.5設(shè)計。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（一）半數(shù)致死量(LD50、LC50)的測定3.藥液配制及染毒給藥的劑型——溶解性——水溶液、混懸液、油劑或乳劑在非吸入染毒實驗中，多按單位體重給予等容量藥液的方法給藥，可以保證不同劑量組動物接受相同容量的藥液。如配制實驗用液中用到新溶劑、新助劑，或?qū)嶒灲K結(jié)時需作病理組織學觀察時，則應有對照組。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（一）半數(shù)致死量(LD50、LC50)的測定5.病理學檢查觀察器官是否有血、出血、水腫或其他變化，并對有變化的臟器作病理組織學檢查。對存活動物在觀察期滿后也應做病理學檢查。6.結(jié)果評價計算半致死劑量或濃度：確定絕對致死劑量或濃度、最小致死劑量或濃度和最大耐受劑量或濃度。急性毒性進行評定：與同系物或其他毒物比較，與毒性分級比較分析。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（二）急性閾劑量的測定

急性閾劑量指毒物經(jīng)一次染毒后對機體產(chǎn)生不良作用的最小劑量，是用于評價毒物非致死性損害的參數(shù)。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（二）急性閾劑量的測定1.觀察指標的選擇應根據(jù)毒物和實驗動物的特性采用不同的生理、生化及形態(tài)學的指標。（1）對于新化學物質(zhì)，首先選用整體狀態(tài)及非特異性作用指標，如活動能力、應激狀態(tài)、條件反射等。（2）對于毒作用特點比較清楚的毒物，可選擇該毒物作用引起最敏感反應指標，如有機磷農(nóng)藥可選膽堿酯酶活性變化。（3）對于刺激性氣體和蒸氣，可測定其刺激閾濃度或嗅覺閾濃度。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（二）急性閾劑量的測定2.實驗方法（1）游泳試驗主要是通過觀察動物的活動能力，揭示不同劑量的毒物對機體體力影響的程度，是研究閾劑量(或濃度)的常用指標。實驗動物一般用小鼠或大鼠。記錄每只動物自放入水中至口鼻沉沒到水下5秒鐘的時間，即游泳時間。在游泳過程中記錄游泳速度、運動姿勢等。比較染毒組與對照組游泳時間和速度以及游泳姿勢上的差異并進行評價。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（二）急性閾劑量的測定2.實驗方法（2）刺激閾試驗刺激性氣體或蒸汽，對上呼吸道、眼睛和口腔等器官的黏膜會產(chǎn)生局部刺激作用，通過觀察毒物在不同濃度下引起的刺激癥狀，可找出毒物引起刺激癥狀的最低濃度，即閾濃度。實驗動物多用貓。觀察指標除一般刺激癥狀，如流淚、流涕、等以外，主要觀察動物的流涎出現(xiàn)的時間及嚴重程度。將50％以上動物出現(xiàn)“有少量唾液流到口唇周圍”以上程度的刺激癥狀的最小濃度作為閾濃度。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（三）局部作用試驗用于研究一些化學物質(zhì)引起接觸的皮膚和黏膜的癥狀，如炎癥和燒傷。1.急性皮膚刺激/腐蝕試驗為了確定化學物質(zhì)對哺乳動物的皮膚是否具有刺激或腐蝕作用。選用白色豚鼠或家兔作為實驗動物。觀察涂抹部位的皮膚反應，對刺激作用給予全面完整的評價。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（三）局部作用試驗2.急性眼睛刺激/腐蝕試驗結(jié)膜囊染毒試驗。試驗常選用家兔或豚鼠為實驗動物。將受試化學物0.1mL滴人一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，用手將眼瞼壓住，使閉眼幾秒鐘，另一側(cè)眼滴生理鹽水作對照。記錄滴藥后1h、12h、24h、48h、72h和96h的局部反應，如充血、水腫、流淚、怕光、角膜、結(jié)膜和眼球損害的程度以及恢復的時間等。以規(guī)定的間隔時間觀察刺激或腐蝕作用的程度，同時作進一步描述以便對刺激作用給予全面、完整的評價。急性毒性試驗五、水生動物毒性實驗一些水生生物對水質(zhì)變化很敏感，反應顯著。因此，在環(huán)境毒理實驗中常用水生生物作為實驗動物，特別在制訂污水排放標準時，常進行水生生物的急性毒性實驗。

魚類、甲殼動物、藻類毒性實驗等方法。急性毒性試驗魚類毒性實驗1.實驗用魚的選擇必須具有一定區(qū)域代表性，便于在實驗條件下飼養(yǎng)，對化學物質(zhì)較為敏感。短期試驗多采用我國的青、草、鰱、鳙四大養(yǎng)殖淡水魚，一般體長<7cm。較長期的試驗多采用金魚，一般在3cm以下，體長最長不應超過最小體長的1.5倍。選擇行動活潑、體色光澤、魚鰭完整舒展、逆水性強和食欲好的健康魚，在實驗室內(nèi)觀察一周后使用。急性毒性試驗魚類毒性實驗2.實驗條件實驗容器采用玻璃缸或白搪瓷桶，其盛水量以每條魚2～3L水為宜。水的pH值為6.7～8.5，冷水溫度為12～18℃，溫水溫度為20～28℃，水溫變化為±2℃。水中溶解氧不能低于4mg/L，可用清潔的河水、湖水或放置3d以上的自來水。急性毒性試驗魚類毒性實驗3.半數(shù)耐受濃度的測定半數(shù)耐受濃度或半數(shù)存活濃度的測定試驗設(shè)計與哺乳動物的LD50測定基本相同。先通過預備試驗確定100％致死濃度和不引起死亡的最大濃度，然后以此濃度范圍，按l﹕(0.65-0.9)的等比級數(shù)確定5-7個濃度組，另加一空白對照組，每組10-20尾魚，染毒48-96h。染毒開始頭8h經(jīng)常觀察，以后可作24h、48h、72h、96h的定期觀察，記錄中毒反應及死亡時間。死亡魚立即取出剖檢。試驗期間水環(huán)境(DO、pH、水溫)穩(wěn)定。根據(jù)24h、48h、96h各組魚的死亡數(shù)，按LD50計算方法，求出相應時間的TLm。急性毒性試驗魚的急性毒性實驗設(shè)計設(shè)計有機磷農(nóng)藥—樂果對魚的急性毒性實驗六、發(fā)光細菌急性毒性試驗基本原理：發(fā)光細菌在干凈水體中發(fā)光恒定，當受到污染物影響時，發(fā)光受到抑制，受抑制的程度與水體中毒物的總體濃度及毒性大小有關(guān)，故用發(fā)光光度計測定其發(fā)光強度，即可評估該水樣的毒性。急性毒性試驗梨形四膜蟲(原生動物)毒性試驗進行藥物、有機物、無機物及水污染物毒理學評價蚯蚓急性毒性試驗土壤環(huán)境毒理學試驗的標準動物兩棲類動物毒性試驗兩棲類動物對水體污染物的敏感性比其他動物更高禽、鳥類急性毒性試驗食物鏈、對化學品的安全性評價急性毒性試驗蓄積毒性實驗蓄積毒性實驗蓄積毒性作用低于中毒閾劑量的外來化合物，反復多次地與機體持續(xù)接觸，經(jīng)一定時間后使機體出現(xiàn)明顯的中毒表現(xiàn)。進入速度>機體消除速度—不斷累積—毒性作用閾劑量蓄積毒性實驗蓄積毒性作用環(huán)境污染物在體內(nèi)的蓄積作用的過程，表現(xiàn)為：物質(zhì)蓄積：污染物不斷進入機體，其吸收量>排出量，以致在體內(nèi)的貯留量增多；功能蓄積：不斷進入機體內(nèi)的環(huán)境污染物，反復作用機體，引起機體一定結(jié)構(gòu)或功能的變化，并逐漸累積加重，最后導致出現(xiàn)損害作用。相對的區(qū)分，同時存在，互為基礎(chǔ)蓄積毒性實驗蓄積毒性作用環(huán)境污染物在體內(nèi)的蓄積作用，是引起亞慢性和慢性毒性作用的基礎(chǔ)。常是評估環(huán)境污染物毒性作用的指標之一；制定其在環(huán)境中的衛(wèi)生標準的重要參考依據(jù)。闡明污染物有無蓄積作用及其程度有重要意義。蓄積毒性實驗一、試驗方法（一）蓄積系數(shù)法固定劑量每天連續(xù)染毒法劑量定期遞增染毒法（二）20天蓄積試驗法（三）生物半減期法一、試驗方法（一）蓄積系數(shù)法（cumulativecoefficientmethod）

分次給受試物后引起50%受試動物出現(xiàn)某種毒效應的總劑量（∑LD50(n)表示）與一次給受試物后引起50%受試動物出現(xiàn)同一毒效應的劑量（以∑LD50(1)表示）的比值，即蓄積毒性實驗蓄積作用強度分級蓄積毒性實驗一、試驗方法（一）蓄積系數(shù)法試驗方法固定劑量每天連續(xù)染毒、劑量定期遞增染毒先按常規(guī)方法測定受試動物的LD50或ED50，此即LD50(1)或ED50(1)；然后另取動物進行LD50(n)或ED50(n)的測定。試驗動物通常是大鼠和小鼠。一、試驗方法（一）蓄積系數(shù)法1.固定劑量每天連續(xù)染毒法固定劑量—1/10-1/20LD50—每天染毒一次—觀察死亡情況LD50(n)>5個LD50時，若動物死亡數(shù)未超過半數(shù)，K>5，表明蓄積作用不明顯。如果染毒過程中動物相繼死亡，記下受試動物出現(xiàn)半數(shù)死亡時的累計的染毒總劑量，按上述計算蓄積系數(shù)。分次染毒劑量為1/20LD50時，實驗時間可長達100天，分次染毒劑量為1/10LD50時，實驗還可長達50天。蓄積毒性實驗2、劑量定期遞增染毒法：以4d為一期，開始第一期每天染毒劑量為1/10LD50，隨后染毒劑量每隔4d按1.5倍遞增一次。

定期遞增染毒劑量*表(注：表中的遞增染毒劑量*為×LD50)

染毒日期（天）每日染毒劑量每4天染毒總劑量累計染毒總劑量1～40.100.40.45～80.150.61.09～120.220.91.913～160.341.43.317～200.502.05.3

如果連續(xù)染毒已達20d，此時染毒的總劑量已累計達到5.30倍的LD50，受試動物中出現(xiàn)某種毒性效應或死亡的動物數(shù)未達到50%，則表示該受試物的蓄積毒性不明顯，試驗可以終止。如受試物在試