時間分辨熒光免疫分析技術(shù)資料

時間分辨熒光免疫分析技術(shù)資料第1頁/共27頁標記免疫學(xué)分析技術(shù)發(fā)展歷程免疫熒光分析(Coons,1941)放射免疫分析(Berson和Yalow,1960)酶免ELISA(Engvall,1971)金標免疫分析(Faulk和Taylor,1971)化學(xué)發(fā)光免疫分析(Arakawa，1977)時間分辨熒光免疫分析(Soini和Hemmila，1979)電化學(xué)發(fā)光免疫分析(Leland,1990)液相芯片(美國Luminex公司,1997)第2頁/共27頁①免疫熒光②放射免疫④化學(xué)發(fā)光⑥電化學(xué)發(fā)光

⑤時間分辨熒光③酶聯(lián)免疫第3頁/共27頁標記免疫技術(shù)的理論檢測靈敏度放射免疫 10-10-10-12mol酶聯(lián)免疫 10-9-10-10mol化學(xué)發(fā)光 10-15mol時間分辨熒光10-18mol電化學(xué)發(fā)光 10-18mol第4頁/共27頁一、時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）

（Time-resolvedfluorescenceimmunoassay）

背景介紹基本原理技術(shù)特點反應(yīng)模式第5頁/共27頁背景介紹1979年，芬蘭Wallac公司研發(fā)部的Soini

和Hemmila首次提出了建立稀土離子標記物的“時間分辨熒光免疫分析”理論1983年，Soini和Kojola首先開發(fā)出以鑭系元素為示蹤物的時間分辨熒光測量儀，建立了新的非放射性微量分析檢測技術(shù)。同一年，

Pettersson等人運用此儀器首次對人絨膜促性腺激素

(hCG)進行了時間分辨熒光免疫分析1984年，Hemmila確定了DELFIA(DissociationEnhancedLanthanideFluoroimmunoassay)這種時間分辨免疫分析技術(shù)方案,從而使DELFIA成為Wallac的專利技術(shù)1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis創(chuàng)立了一種不同于DELFIA

的時間分辨熒光免疫分析，即FIAgen2003年，時間分辨熒光分析技術(shù)獲國家科技進步二等獎第6頁/共27頁基本原理三價稀土離子包括有銪(Eu)，釤（Sm)，鋱

(Tb)，鏑

(Dy)

等，它們的熒光光譜具有特異性強﹑Stokes位移大﹑壽命長的特點DELFIA采用異硫氰酸芐基二亞乙基三胺四乙酸銪(DTTA-Eu)

為雙功能螯合試劑，其一端螯合Eu3+，另一端可與蛋白質(zhì)的-NH2

連接。在中性或接近中性pH條件下，DTTA與Eu3+具有足夠的螯合穩(wěn)定性，而在增強液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu又能將螯合的Eu3+迅速、徹底地釋放出來并與增強液中的配體螯合﹑進入膠束的疏水內(nèi)核，使Eu3+熒光得以成千萬倍地放大FIAgen采用的是以Eu3+螯合物配基BCPDA為標記物，通過檢測其與過量Eu3+形成的螯合物熒光進行定量。由于

BCPDA的可檢測性不夠理想，F(xiàn)IAgen需要利用生物素-

親合素信號放大來彌補BCPDA檢測靈敏度的不足第7頁/共27頁DELFIA標記技術(shù)堿性第8頁/共27頁時間:(μs）04008001000340nm激發(fā)光第二個循環(huán)熒光短壽命熒光613nm長壽命熒光延遲時間測值時間通過時間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光分辨開來，使理論本底達到0第9頁/共27頁300400500600熒光強度激發(fā)光發(fā)射光波長(nm)第10頁/共27頁TbDyEuSm500發(fā)射光強度2004000延遲時間(μs)600發(fā)射光波長(nm)500發(fā)射光強度0延遲時間(μs)第11頁/共27頁TRFIA技術(shù)特點極長的熒光衰退時間

銪：730000ns

Stokes位移大

銪：激發(fā)光340nm，發(fā)射光613nm狹窄的發(fā)射峰解離-增強技術(shù)可使其熒光性提高100萬倍第12頁/共27頁固相包被抗體銪標記抗體孵育Eu待測抗原++EuEu+增強液+Eu雙抗體夾心法示意圖第13頁/共27頁雙抗原夾心法示意圖Eu++孵育+Eu孵育增強液+Eu固相包被抗原待測抗體銪標記抗原第14頁/共27頁中和法示意圖(回滴定法)++孵育+Eu孵育EuEu增強液++Eu待測抗體銪標記抗體中和抗原第15頁/共27頁小分子抗原競爭抑制示意圖固相包被二抗+孵育++Eu孵育Eu待測抗原銪標抗原Eu增強液++Eu一抗第16頁/共27頁時間分辨技術(shù)重點和難點固定相（96孔板）標準品銪標記物第17頁/共27頁二、時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）

測試儀第18頁/共27頁目前的TRFIA測試儀：國外儀器（Wallac公司<PerkinElmer>）國內(nèi)其他公司生產(chǎn)的儀器(上海新波、廣州豐華等)達瑞抗體公司自主研發(fā)的儀器及軟件（DR-M6601）第19頁/共27頁WallacAutoDELFIA1235第20頁/共27頁半自動VICTOR21420第21頁/共27頁半自動ANYTEST2000第22頁/共27頁DR-M6601時間分辨熒光免疫分析儀【粵食藥管械（準）字2005第2400226】第23頁/共27頁達瑞公司開發(fā)的系列TRF試劑內(nèi)分泌科檢查甲狀腺系列：T3、T4、FT3、FT4、TSH、TBG、TG、TGAb、TPoAb糖尿病系列：insulin、C-Peptide

生長激素：hGH

其他：Cortisol腫瘤科檢查AFP、CEA、tPSA、β2-MG

、hTG、CA-242、CA-724、CA-50

、

fPSA、NSE、cyfra211、CA-199、CA-125、CA153傳染病檢查乙肝系列：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb其他：HCV、HIV婦產(chǎn)科檢查FSH、LH、hCG、Prolactin、Progesterone、SHBG、β-hCG、PAPP-A、Testosterone

、uE3、E2血液科檢查貧血檢查：（Ferritin、VitB12