電離輻射的分子生物學(xué)效應(yīng)

電離輻射的分子生物學(xué)效應(yīng)4/13/2023第1頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)DNA的電離輻射效應(yīng)第2頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一輻射所致DNA損傷的類型：DNA鏈斷裂、DNA堿基損傷、DNA交聯(lián)一、DNA鏈斷裂單鏈斷裂（singlestrandbreak，SSB)雙鏈斷裂（doublestrandbreak，DSB).第3頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一一、DNA損傷的種類DNA鏈斷裂—單鏈斷裂（SSB）雙鏈斷裂（DSB）DNA交聯(lián)—

DNA鏈交聯(lián)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)DNA二級和三級結(jié)構(gòu)的變化

其中DSB是輻射所致生物學(xué)效應(yīng)中最重要的原初損傷，而非重接性的DSB則被認為是細胞殺傷效應(yīng)的最重要的損傷。第4頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一DNA鏈斷裂（DNAstrandbreak)單鏈斷裂（singlestrandbreak，SSB)：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中一條鏈斷裂雙鏈斷裂（doublestrandbreak，DSB)：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中兩條互補鏈于同一對應(yīng)處或相鄰處同時斷裂第5頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一單鏈斷裂雙鏈斷裂第6頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一1.DNA鏈斷裂的分子機制（1）脫氧戊糖和磷酸二酯鍵的破壞（直接）三種自由基：eaq-，.OH，H.DNA鏈斷裂主要與.OH作用有關(guān)，從脫氧戊糖抽氫，形成了5中不同的反應(yīng)產(chǎn)物。第7頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一

.OH從脫氧戊糖中抽氫，主要作用于C(3’，5’），C（3’)上磷酸二酯鍵斷裂多余C（5’）端。

.OH攻擊糖基C(1’、2’、4’)形成堿不穩(wěn)定性位點（alkalilabilesites,ALS），這些位點在堿處理后發(fā)生鏈斷裂。第8頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一堿不穩(wěn)定性位點（ALS）.OH對C（1’），C（2’），C（3’），C（4’）攻擊后的產(chǎn)物，在與六氫吡啶供熱后都能導(dǎo)致DNA鏈的斷裂。所以，在DNA鏈上含有損失后經(jīng)堿處理后導(dǎo)致DNA鏈斷裂的位點，這些位點稱為堿不穩(wěn)定性位點（ALS）第9頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一（2）堿基損傷(basedamage)1、充氧溶液中堿基損傷嘧啶堿：羥自由基攻擊5、6位腺嘌呤：羥自由基攻擊8位鳥嘌呤：羥自由基攻擊4、5、8位2、細胞中堿基損傷進展不大，用電子自旋共振儀第10頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一酶敏感位點(enzymesensitivesites，ESS）：堿基損傷可引起DNA雙螺旋的局部變性，特異的核酸內(nèi)切酶能識別和切除這種損傷，并通過酶的作用，產(chǎn)生鏈斷裂。這種特異性酶敏感位點稱為ESS。無嘌呤或無嘧啶位點（apurinic/apyrimidinicsites，APS）：DNA鏈上損傷的堿基可被特異的DNA－糖基化酶除去或由于N－糖基鍵的化學(xué)水解而丟失，形成APS。形成APS在內(nèi)切酶的作用下形成鏈斷裂。第11頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一2.DNA鏈斷裂的主要特點1)單鏈斷裂與雙鏈斷裂的比值DSB約為SSB的1/10~1/20SSB由一個自由基攻擊引起。DSB必須由兩個以上自由基引起。一定能量的射線所產(chǎn)生的SSB和DSB有一個大致的比值，但比值不是恒定的。第12頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一2）LET對鏈斷裂的影響各種射線對鏈斷裂效應(yīng)的順序：中子＞γ射線、χ＞紫外線SSB與DSB的比值與LET的高低有關(guān)。隨著LET的升高，SSB減少，DSB增多。第13頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一3）氧效應(yīng)對鏈斷裂的影響氧效應(yīng)可增加鏈斷裂的程度：主要原因是氧效應(yīng)可增加羥自由基的產(chǎn)生。4）DNA鏈發(fā)生的部位劑量不同，DNA堿基發(fā)生斷裂的概率亦不同。當劑量＜10Gy照射時，堿基斷裂順序G＞A＞T≥C。當劑量＞40~80Gy照射時，堿基斷裂順序T＞G＞A≥C。第14頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一5）DNA鏈斷裂與細胞輻射敏感性DNA的斷裂程度與輻射敏感性有關(guān)。不同哺乳動物細胞對輻射的敏感性有很大差異，平均致死劑量（D0）亦不同。第15頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一DNA自然斷裂的發(fā)生通常情況下DNA斷裂的本底水平可達總DNA的百分之幾。一般方法難以測量，常引入凝膠模塊的方法來解決。第16頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一DNA交聯(lián)（DNAcross-linking)交聯(lián)種類1、鏈間交聯(lián)：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，一條鏈上的堿基與其互補鏈上的堿基以共價鍵結(jié)合。2、鏈內(nèi)交聯(lián)：DNA分子同一條鏈上的兩個堿基相互以共價鍵結(jié)合3、DNA－蛋白質(zhì)交聯(lián)（DNA-proteincross- linking，DPC）：DNA與蛋白質(zhì)以共價鍵結(jié)合第17頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一1.DNA-Proteincross-linking（DPC)1．DPC存在的證據(jù)

小牛胸腺脫氧核糖核蛋白(DNP)在UV或γ射線照射后，其中DNA的不能被提取的部分隨著照射劑量的增加而增多，但如果用胰蛋白酶處理，則觀察到這部分DNA。這是因為UV和γ射線照射導(dǎo)致了DNA與核蛋白的交聯(lián)，影響了DNP中DNA的提出，胰蛋白酶能夠裂解DNA與蛋白質(zhì)之間的共價鍵，消化DNP中的蛋白質(zhì)部分．所以全部DNA都能被提取出來。第18頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一2、DPC形成的分子機制羥自由基有關(guān)（?OH)DNA與蛋白質(zhì)之間形成共價鍵的分子機制1）輻射后蛋白質(zhì)中的含硫氨基酸形成了自由基。

2）蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸形成酚型或酚氧型自由基，這類自由基在DPC中起著主要作用。第19頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一3、影響DPC形成的因素氧效應(yīng)：如：紫外線＋O2→DPC↑γ射線＋O2→DPC↓溫度：孵育（45℃±）＋照射→DPC↑特別是腫瘤細胞，已用于臨床染色質(zhì)的狀態(tài)：染色質(zhì)結(jié)構(gòu)愈緊，愈容易交聯(lián)。細胞的不同周期，DPC不同。S期交聯(lián)最多，G1,G2期很少第20頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一4、體內(nèi)DPC形成時DNA和蛋白質(zhì)的選擇性DNA的選擇性：具有轉(zhuǎn)錄活性的DNA。此處易發(fā)生SSB,單修復(fù)也快。蛋白質(zhì)的選擇性>：組蛋白、非組蛋白、調(diào)節(jié)蛋白、拓撲異構(gòu)酶以及與復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān)的核基質(zhì)蛋白。組蛋白中H3>H4>H2A>H2B第21頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一2.DNA-DNA鏈間交聯(lián)在放射生物學(xué)中研究DNA-DNA鏈間的交聯(lián)的報道較少。在干燥及含25%水的DNA中鏈間斷裂占優(yōu)勢；隨著水分子的增加DNA鏈斷裂生成率上升，而鏈間斷裂下降。DAN鏈間交聯(lián)多見于化學(xué)損傷，如氮芥、硫芥等；放射損傷時較少見到。放射損傷時，DNA鏈間交聯(lián)與鏈斷裂相互競爭。第22頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一3.DNA鏈內(nèi)交聯(lián)多見于紫外線照射，電離輻射較少二聚體形成是紫外線照射后胸腺嘧啶自由基加合而成；是紫外線照射引起DNA的特征性改變。在DNA接近其最大吸收波長260nm相鄰的嘧啶堿基共價交聯(lián)形成環(huán)丁烷四元環(huán)－嘧啶二聚體此反應(yīng)是可逆的。分布是非隨機性的，相鄰的兩個T、或兩個C、或C與T間都連成二聚體，其中最容易形成的是TT二聚體第23頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一DNA二級和三級結(jié)構(gòu)的變化DNA變性：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，氫鍵斷裂，克原子磷消光系數(shù)顯著升高，出現(xiàn)了增色效應(yīng)，比旋光性和粘度降低，浮力密度升高，酸堿滴定曲線改變，同時失去生物活性。第24頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一1.增色效應(yīng)和Tm值Tm：將DNA克原子磷消光系數(shù)ε（P）值達到最高值1/2時的溫度稱之為熔解溫度（Tm)增色效應(yīng)：隨DNA變性程度的增加，其克原子磷消光系數(shù)值增大，這種現(xiàn)象稱增色效應(yīng)。r射線照射后的特點：1、Tm值↓2、增色效應(yīng)有限，與鏈間交聯(lián)有關(guān)第25頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一2.旋光色散（opticalrotatorydispersion,ORD)和圓二色性：DNA的ORD光譜在228和229nm波段有高峰，在257nm有低谷。照射后，228和257nm發(fā)生與劑量呈線性的變化粘度：隨劑量的增加，粘度降低。3.粘度DNA溶液粘度的改變可反映出DNA結(jié)構(gòu)的改變。第26頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一二、DNA損傷的修復(fù)亞致死損傷修復(fù)（sublethaldamagerepair,SLDR）：將預(yù)定的照射劑量分次給予，生物效應(yīng)明顯減輕，表明在兩次照射間隔中細胞有所修復(fù)，這種修復(fù)稱作SLDR。潛在致死性損傷修復(fù)（potentiallylethaldamagerepair,PLDR)：照射后改變細胞所處的狀態(tài)和環(huán)境，如延長接種或給予不良的營養(yǎng)和環(huán)境條件，均能提高存活率。第27頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一不同類型DNA損傷的修復(fù)1、DNA單鏈斷裂的修復(fù)絕大多數(shù)正常細胞都能修復(fù)單鏈斷裂DNA修復(fù)與時間呈指數(shù)關(guān)系，修復(fù)速率依賴于溫度與SLDR有關(guān)第28頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一2、DNA雙鏈斷裂的修復(fù)斷裂后即刻，細胞內(nèi)酶修復(fù)系統(tǒng)啟動。修復(fù)速率的快慢與水平的高低直接決定損傷的殘留以及細胞的轉(zhuǎn)歸。（部分修復(fù)：早期修復(fù)快，隨后修復(fù)的慢）與PLDR有關(guān)第29頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一3、堿基損傷的修復(fù)種類多，分析較困難以嘧啶二聚體為模型，能修復(fù)但只能部分修復(fù)。第30頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一4、DNA修復(fù)合成DNA期外合成或程序外DNA合成（unscheduledDNAsynthesis,UDS）：DNA合成適于損傷后即刻，隨時間延長而增加，但與細胞周期沒有關(guān)系，是一種修復(fù)合成。第31頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一DNA的損傷修復(fù)機制1、回復(fù)修復(fù)細胞對DNA的某些損傷可以用很簡單的方式加以修復(fù)在單一基因產(chǎn)物的催化下，一步反應(yīng)就可以完成。這種修復(fù)方式叫回復(fù)。第32頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一1）酶學(xué)光復(fù)活光復(fù)活酶或DNA光解酶它的作用分成三個步驟：①酶與DNA中的二聚體部位相結(jié)合；②吸收波長為260～380nm的近紫外光，酶被激活，使二聚體解聚；③酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。第33頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一2）DNA單鏈斷裂重接DNA單鏈斷裂中有一部分是通過簡單的重接而修復(fù)的，只需要一種酶——DNA連接酶(ligase)參加，因此也屬于直接回復(fù)。DNA連接酶能催化DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中一條鏈缺口處的5’磷酸根與相鄰的一個3’羥基形成磷酸二酯健。連接所需的能量ATP(如動物細胞)。第34頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一3）嘌呤的直接插入嘌呤插入酶受損嘌呤→APS→插入嘌呤（糖苷鍵）K+糖基化酶嘌呤插入酶第35頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一2、切除修復(fù)將損傷的部位（或連同其附近的一定部位）切除，然后用正確配對的、完好的堿基替代修復(fù)。有多種酶和基因參與過程：識別（損傷位點→切除→修復(fù)（補） 連接DNA連接酶酶和蛋白質(zhì)DNA聚合酶兩個特點:準確、正確修復(fù)。第36頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一1)堿基切除：特點是切除受損傷的堿基。主要過程是水解受損傷的堿基與脫氧核糖磷酸鏈之間的N—糖苷鍵。反應(yīng)由一類糖基化酶催化。也即：糖基化酶→APS→內(nèi)、外切酶去除殘基。整個修復(fù)過程可分以下幾步。第37頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一2）核甘酸切成（一段寡核苷酸）首先由一個酶系統(tǒng)識別損傷；然后在損傷兩側(cè)各水解一個磷酸二酯鍵；釋放出一段寡核苷酸；填補缺損區(qū)連接酶重新完成連接。第38頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一3、多聚ADP-核糖的作用ADP－核糖基多聚物的形成與存在是提高連接酶活性的重要因素，在DNA損傷修復(fù)過程中起著重要作用。第39頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一4、損傷的“耐受”DNA分子的損傷有時不能立即修復(fù)。特別是在復(fù)制已經(jīng)開始，而損傷又在復(fù)制叉附近時，細胞會通過另一些機制，使復(fù)制能進行下去，待復(fù)制完成后，再通過某種機制修復(fù)殘留的損傷。復(fù)制時損傷并未消除，故稱“耐受”。包括重組修復(fù)（復(fù)制后修復(fù)）、SOS修復(fù)第40頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一1）、重組修復(fù)當DNA雙鏈發(fā)生嚴重損傷時需要另一種機理來完成正確的修復(fù)。一種情況是兩條鏈同時受到損傷；另一種情況是單鏈損傷尚未修復(fù)時發(fā)生了復(fù)制，造成對應(yīng)于損傷位置的新鏈缺乏正確模板；此時需要重組酶系將另一段未受損傷的雙鏈DNA移到損傷位置附近，提供正確的模板，進行重組。這便是重組修復(fù)。第41頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一2）SOS修復(fù)細胞DNA受到損傷或復(fù)制系統(tǒng)受到抑制，產(chǎn)生一種調(diào)控信號，解除對許多基因的抑制，這些基因的產(chǎn)物參與修復(fù)過程。SOS修復(fù)過程是在損傷信號誘導(dǎo)下發(fā)生的，又稱可誘導(dǎo)的DNA修復(fù)。修復(fù)過程容易發(fā)生錯誤，故又稱易錯修復(fù)。第42頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一4、錯配修復(fù)錯配修復(fù)是生物維持生命、保持物種穩(wěn)定的—種重要功能。從細菌、酵母直至哺乳動物都普遍具有此修復(fù)機理。在修復(fù)、重組的過程中或外界損傷因子的作用下都有可能發(fā)生錯配。在修復(fù)過程中首先要識別錯配堿基對。然后需要分辨錯配的哪一側(cè)屬于母鏈，哪一側(cè)屬于新合成的錯誤鏈。最后修復(fù)。錯配糾正過程是很復(fù)雜的，至少需要10種活性因子參加。第43頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一基因組修復(fù)的不均一性特點1）轉(zhuǎn)錄活性DNA修復(fù)優(yōu)于靜止的基因2）轉(zhuǎn)錄鏈優(yōu)于非轉(zhuǎn)錄鏈－修復(fù)與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)第44頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一1、重復(fù)序列中的DNA修復(fù)靈長類細胞基因組中存在一種高度重復(fù)順序，在非洲綠猴細胞中此順序占總DNA的15％一20％，堿基組成與總DNA相近，長度為172bP，沒有轉(zhuǎn)錄功能。第45頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一2、活性基因中的修復(fù)活性基因片段中二聚體的清除非?；钴S，如紫外線照射(20J2/M2)后8小時，已清除47%左右。3、活性基因中轉(zhuǎn)錄鏈的修復(fù)轉(zhuǎn)錄鏈優(yōu)先修復(fù)，其機制以轉(zhuǎn)錄修復(fù)偶聯(lián)因子的作用解釋。第46頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一DNA修復(fù)基因1、原核細胞的修復(fù)基因占基因組總量1％。2、酵母有三組RAD基因（radiationsensitive的前三個字母）3、人類基因：1）XRCC（X-rayrepair crosscomplementing）基因；2）ERCC第47頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一三、DNA損傷與修復(fù)的生物學(xué)意義DNA結(jié)構(gòu)的完整與穩(wěn)定在生物學(xué)上有著特別重要的意義。在射線作用下，DNA堿基的損傷或脫落改變了密碼，引起基因的突變。導(dǎo)致細胞的突變或轉(zhuǎn)化。雙鏈DNASSB能迅速修復(fù)，DSB經(jīng)原位重接很少，重組修復(fù)則易發(fā)生染色體畸變。DNA交聯(lián)會影響核小體及更高層次的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，影響復(fù)制?；钚匀旧|(zhì)的破壞影響基因的表達和調(diào)控。第48頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一與DNA損傷修復(fù)有密切關(guān)系的另一個因素是真核細胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。而染色質(zhì)包括：DNA、組蛋白、非組蛋白及少量RNA。1.染色質(zhì)2.核小體常染色質(zhì):

異染色質(zhì):活性染色質(zhì) 非活性染色質(zhì)(χ染色體)第49頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一四、染色質(zhì)損傷對DNA輻射效應(yīng)的影響一、染色質(zhì)的輻射敏感性染色質(zhì)（chromatin)：真核細胞間期的核中DNA、組蛋白、非組蛋白以及少量RNA所組成的復(fù)合體。染色體（chromosome）：有絲分裂期，染色質(zhì)的細纖絲高度壓縮，濃集成為光學(xué)顯微鏡下能看到的深染的結(jié)構(gòu)。染色質(zhì)和染色體是細胞周期中不同的時期的兩種不同形態(tài)，化學(xué)本質(zhì)是相同的。第50頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一1、染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與分類染色質(zhì)是由核小體的重復(fù)亞單位連接而成串珠狀結(jié)構(gòu)。核小體由直徑為10nm×5.5nm的組蛋白核心和盤繞于此核心之外的DNA構(gòu)成組蛋白H2A，H2B，H3，H4各兩分子組成八聚體蛋白，外繞DNA長約200個堿基對140個堿基對形成超螺旋結(jié)構(gòu)，60個為連接區(qū)。H1在連接區(qū)連接兩個核小體，起穩(wěn)定作用第51頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一常染色質(zhì)與異染色質(zhì)（eu-chromatin&hetero-chromatin）常染色質(zhì)纖絲折疊疏松，在細胞分裂間期著色微弱，其中含有單一和重復(fù)順序的DNA，能進行轉(zhuǎn)錄。異染色質(zhì)纖絲折疊緊密、在細胞分裂間期著色深，也含有重復(fù)和非重復(fù)順序的DNA，但都不能轉(zhuǎn)錄。隨體DNA(SatelliteDNA）往往含有高度重復(fù)序列，聚集于異染色質(zhì)區(qū)，靠近著絲點。第52頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一

常染色質(zhì)和異染色質(zhì)在化學(xué)性質(zhì)上沒有什么差別，而可能是由于DNA核苷酸順序和折疊不同，導(dǎo)致染色質(zhì)以兩種不同狀態(tài)存在。活性染色質(zhì)(activechromatin)：具有轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)非活性染色質(zhì)(inactivechromatin)：不具有轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)第53頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一2、核小體連接區(qū)的輻射效應(yīng)1、是合成RNA引物的起始部位，前者是DNA復(fù)制的起始步驟2、連接區(qū)DNA是組蛋白H1的結(jié)合部位，組蛋白H1的磷酸化與細胞分裂啟動有關(guān)。此區(qū)受輻射作用使H1的磷酸化受抑制，影響細胞分裂。3、連接區(qū)DNA易受DNase的攻擊。受照后更易。4、DNA修復(fù)合成從連接區(qū)開始故連接區(qū)受到輻射后，意義更大！第54頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一3、染色質(zhì)緊密程度對輻射敏感性的影響4、活性染色質(zhì)與非活性染色質(zhì)的輻射敏感性第55頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一二、染色質(zhì)的輻射降解1.機制2.組織的輻射敏感性與復(fù)賽中降解程度3.蛋白酶在染色質(zhì)降解中的作用4.核酸酶在染色質(zhì)自身消化中的作用三、染色質(zhì)蛋白的輻射效應(yīng)1.組蛋白的輻射效應(yīng)2.非組蛋白的輻射效應(yīng)第56頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一

第五節(jié)細胞通信和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的電離輻射效應(yīng)第五