硬脂酸鎂的微生物限度檢查

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一、概述

本報(bào)告按USP31中“〈61-62〉非滅菌產(chǎn)品的微生物學(xué)檢查〞的規(guī)定，對(duì)硬脂酸美的微生物學(xué)檢查方法學(xué)考察。參照企業(yè)提供標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)測(cè)試試驗(yàn)制定適合于本品的微生物學(xué)檢查的方法。企業(yè)提供標(biāo)準(zhǔn)：

總需氣菌數(shù)（TAMC）不得過(guò)1000cfu/g；霉菌及酵母菌總數(shù)（TYMC）不得過(guò)500cfu/g；每1g樣品不得檢出大腸埃希菌；每10g樣品不得檢出沙門氏菌。

二、方法學(xué)1、培養(yǎng)基及試劑

試驗(yàn)用培養(yǎng)基及緩沖液均符合USP規(guī)定。BP：pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液CA：溴化十六烷基三甲銨MCA：麥康凱瓊脂MCB：麥康凱肉湯MSA：甘露醇鹽瓊脂RVS：RV沙門菌增菌肉湯SDA：沙氏葡萄糖瓊脂SDB：沙氏葡萄糖肉湯TSA：大豆胰酪胨瓊脂TSB：大豆胰酪胨肉湯XLD：賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂2、試驗(yàn)菌株

黑曲霉ATCC16404

枯草芽孢桿菌ATCC6633，CMCC(B)63501白色念珠菌ATCC10231，CMCC(F)98001大腸埃希菌ATCC8739銅綠假單胞菌ATCC9027

霍亂沙門氏菌ATCC14028

金黃色葡萄球菌ATCC6538，CMCC(B)26003

本試驗(yàn)取用中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)菌種保存中心（CMCC）的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌。這三株菌也來(lái)源于ATCC。試驗(yàn)用菌株，自種子批啟用傳代不超過(guò)5次。黑曲霉為3個(gè)月內(nèi)制得的4℃保存的孢子懸液，可直接稀釋使用。參照表格2，將其他6株菌分別接種至規(guī)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)。上述各菌分別以pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液10倍稀釋至大約50-100cfu/mL的濃度，備用。參照表格2各菌株的生長(zhǎng)條件，采用澆碟法測(cè)定稀釋得到的最終菌液濃度。3、方法學(xué)

本部分主要包括培養(yǎng)基特性測(cè)試和方法的適用性考察。3.1培養(yǎng)基特性測(cè)試

依照USP31中“〈61-62〉非滅菌產(chǎn)品的微生物學(xué)檢查〞的規(guī)定，與已經(jīng)通過(guò)測(cè)試驗(yàn)證的參比培養(yǎng)基（MⅠ）相比，當(dāng)微生物限度檢查用培養(yǎng)基（MⅡ）符合以下標(biāo)準(zhǔn)，則用于硬脂酸美的微生物學(xué)檢驗(yàn)：

a.固體培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力：與MⅠ相比，MⅡ的回收率應(yīng)在50%-200%之間。b.固體培養(yǎng)基指示能力：與MⅠ相比，規(guī)定菌株在MⅡ的生長(zhǎng)特征應(yīng)與之類似。c.液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力：與MⅠ相比，規(guī)定菌株在MⅡ有明顯渾濁。d.抑制能力：無(wú)論是固體培養(yǎng)基或是液體培養(yǎng)基，規(guī)定菌株在其不得生長(zhǎng)。

對(duì)于固體培養(yǎng)基，尋常采用平皿計(jì)數(shù)法(包括澆碟法和表面接種法)來(lái)評(píng)價(jià)培養(yǎng)基特性，每次平行測(cè)試兩皿，最終取平均數(shù)為計(jì)算結(jié)果。培養(yǎng)基特性測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表格3-表格5。3.2方法適用性

當(dāng)微生物學(xué)檢查方法符合以下要求時(shí)，說(shuō)明該方法適用該品種：

a.樣品供試液不得抑制測(cè)試菌株的生長(zhǎng)。計(jì)數(shù)試驗(yàn)中，測(cè)試微生物在供試樣品中的回收率不得低于接種量的50%；控制菌檢查中，測(cè)試菌在含有規(guī)定量供試品的環(huán)境中應(yīng)可以生長(zhǎng)。

b.樣品自身含有的微生物水平不得干擾菌株回收試驗(yàn)。

供試液制備：

以70%的乙醇擦拭供試品的外包裝，使自然揮干。由于硬脂酸美是一種脂溶性物質(zhì)，因此用表面活性劑吐溫-80將其溶解。無(wú)菌操作取10g硬脂酸美置滅菌過(guò)的三角燒瓶，參與一定量的45℃滅菌的含1%吐溫-80的pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，振搖使分散均勻，制成1:40的供試液。計(jì)數(shù)方法適用性：

a.試驗(yàn)組：取4個(gè)直徑為9cm的無(wú)菌平皿。其中兩個(gè)平皿中參與1:40供試液4mL和50-100cfu測(cè)試菌，取另兩平皿參與1:40供試液2mL和50-100cfu測(cè)試菌。每個(gè)平皿傾注45℃表格2中的規(guī)定培養(yǎng)基，搖勻。待瓊脂凝固后，參照表格2的條件倒置培養(yǎng)。5株測(cè)試菌（黑曲霉、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌）均進(jìn)行該測(cè)試。

b.樣品組：取8個(gè)直徑為9cm的無(wú)菌平皿。其中兩個(gè)平皿中分別參與1:40供試液4mL和2mL，每個(gè)平皿傾注45℃TSA；取另兩平皿參與1:40供試液4mL和2mL，每個(gè)平皿傾注45℃SDA；各平行測(cè)試兩皿。參照表格2培養(yǎng)。記錄平皿計(jì)數(shù)結(jié)果，計(jì)算測(cè)試菌回收率。

c.菌液組：計(jì)數(shù)方法適用性檢查中測(cè)試菌包括5株測(cè)試菌，分別為黑曲霉、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。參考表格2培養(yǎng)條件，采用澆碟法計(jì)數(shù)，確定接種量。d.回收率計(jì)算公式如下：

回收率?A-B?100%CA-試驗(yàn)組平均菌落數(shù)；B-樣品組平均菌落數(shù)；C-菌液組平均菌落數(shù)。

控制菌測(cè)試方法適用性：大腸埃希菌

a.預(yù)培養(yǎng)：取1:40供試液40mL（相當(dāng)于1g）至400mL滅菌TSB，混勻，置30至35℃培養(yǎng)18至24小時(shí)。

b.陽(yáng)性組1：接種50-100cfu大腸埃希菌至滅菌TSB中，置30至35℃培養(yǎng)18至24小時(shí)。

c.試驗(yàn)組1：取1:40供試液40mL（相當(dāng)于1g）和50-100cfu大腸埃希菌至400mL滅菌TSB，混勻，置30至35℃培養(yǎng)18至24小時(shí)。

d.陽(yáng)性組2：取1mL滅菌TSB和50-100cfu大腸埃希菌至100mL滅菌麥康凱肉湯中，置42至44℃培養(yǎng)24至48小時(shí)；劃線接種至麥康凱瓊脂，30至35℃培養(yǎng)18至72小時(shí)。

e.試驗(yàn)組2：取TSB預(yù)培養(yǎng)物1mL和50-100cfu大腸埃希菌至100mL滅菌麥康凱肉湯中，置42至44℃培養(yǎng)24至48小時(shí)。劃線接種至麥康凱瓊脂，30至35℃培養(yǎng)18至72小時(shí)。沙門氏菌

a.預(yù)培養(yǎng)：無(wú)菌操作取10g硬脂酸美置滅菌過(guò)的三角燒瓶，參與45℃的400mL1%吐溫-80的滅菌TSB，振搖使分散均勻，置30至35℃培養(yǎng)18至24小時(shí)。

b.陽(yáng)性組1：接種50-100cfu霍亂沙門氏菌至滅菌的1%吐溫-80的TSB中，置30至35℃培養(yǎng)18至24小時(shí)。

c.試驗(yàn)組1：無(wú)菌操作取10g硬脂酸美置滅菌過(guò)的三角燒瓶，參與45℃的400mL滅菌的1%吐溫-80的TSB，振搖使分散均勻。參與50-100cfu霍亂沙門氏菌置30至35℃培養(yǎng)18至24小時(shí)。

d.陽(yáng)性組2：取0.1mL滅菌TSB（含1%吐溫-80）和50-100cfu霍亂沙門氏菌至10mL滅菌RVS肉湯中，30至35℃培養(yǎng)18至24小時(shí)；劃線接種至XLD瓊脂，30至35℃培養(yǎng)18至48小時(shí)。

e.試驗(yàn)組2：取TSB（含1%吐溫-80）預(yù)培養(yǎng)物0.1mL和50-100cfu霍亂沙門氏菌至10mL滅菌RVS肉湯中，30至35℃培養(yǎng)18至24小時(shí)；劃線接種至XLD瓊脂，30至35℃培養(yǎng)18至48小時(shí)。4、探討

表格3至表格5說(shuō)明本品涉及到所有培養(yǎng)基均符合微生物學(xué)檢查用的要求。培養(yǎng)基的滅菌方式各異，參見(jiàn)表格1。表格6至表格8說(shuō)明硬脂酸美并不抑制各株測(cè)試菌的生長(zhǎng)。計(jì)數(shù)試驗(yàn)中，膠囊殼自身的顏色使得瓊脂明了度降低，使得對(duì)3株細(xì)菌（枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌）的計(jì)數(shù)較為困難，但并不影響黑曲霉和酵母菌的計(jì)數(shù)。因此，通過(guò)方法適用性試驗(yàn)，確定以增加培養(yǎng)基體積的方式使得平皿計(jì)數(shù)可行。控制菌檢查方法依照常規(guī)方法即可滿足。本品微生物學(xué)檢查方法的具體內(nèi)容在后續(xù)細(xì)述，詳見(jiàn)“微生物學(xué)檢查檢驗(yàn)操作程

序〞。

三、微生物學(xué)檢查檢驗(yàn)操作程序1、供試樣品制備

以70%的乙醇擦拭供試品的外包裝，使自然揮干。無(wú)菌操作取10g硬脂酸美置滅菌過(guò)的三角燒瓶，參與的45℃含1%吐溫-80滅菌pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，振搖使分散均勻，制成1:40的供試液。取1:40供試液4mL至6mLpH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，制得1:100供試液。2、計(jì)數(shù)測(cè)試

試驗(yàn)中均使用直徑為9cm的滅菌平皿。

a.需氣菌計(jì)數(shù)（TAMC）：取1:40供試液2mL，平行測(cè)定4皿；取1:100供試液1mL，平行測(cè)定2皿，分別傾注15-20mL45℃TSA瓊脂，充分搖勻分散供試品。待平皿中瓊脂凝固后，30-35℃倒置培養(yǎng)3至5天。

b.霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)（TYMC）：取1:40供試液2mL，平行測(cè)定4皿，；取1:100供試液1mL，平行測(cè)定2皿，傾注15-20mL45℃SDA瓊脂，充分搖勻分散供試品。待平皿中瓊脂凝固后，20-25℃倒置培養(yǎng)5至7天。

依照規(guī)定培養(yǎng)條件終止培養(yǎng)后，點(diǎn)擊平皿中的菌落數(shù)（CFU）。通過(guò)平皿計(jì)數(shù)結(jié)果求算均值，最終轉(zhuǎn)換為相當(dāng)于每g樣品中含有的菌落數(shù)。若樣品中未檢出菌落，則結(jié)果可解釋為“每g樣品中菌落數(shù)少于10個(gè)。〞。3、控制菌檢查3.1大腸埃希菌

取1:40供試液40mL（相當(dāng)于1g）至400mLTSB，混勻，置30至35℃培養(yǎng)18至24小時(shí)，觀測(cè)結(jié)果。取TSB培養(yǎng)物2mL接種至100mL麥康凱肉湯，置42至44℃